Влияние препарата АОКВЕТ на уровень бактериальной контаминации молока у коров при маститах

УДК 619:636.2
DOI 10.33861/2071-8020-2021-6-18-20

Кононенко К.Н., Чекрышева В.В., Клименко А.И. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Федеральный Ростовский аграрный научный центр», Ростовская область, пос. Рассвет

Значительный ущерб хозяйствам с молочным скотоводст­вом наносит воспаление молочной железы - мастит. При мастите резко снижается молочная продуктивность коров. Причины возникновения мастита интересуют ученых давно. Данное заболевание может быть клинически выражено или проявляться в скрытой субклинической форме. Причем скрытая форма мастита час­то преобладает над клинической формой по количеству заболевших животных. Если при диагностировании животных на наличие мастита любой формы упустить раннюю стадию его проявления, то вероят­ность благоприятного исхода заболевания будет минимальной. Таким образом, своевременная диагностика обусловливает также сниже­ние затрат на проведение лечебных мероприятий [1, 4].

Для первичной диагностики мастита обычно используют кенотест, который позволяет определить скрытую форму мастита. Для постанов­ки диагноза клинической формы мастита проводят осмотр и пальпа­цию молочной железы. При наличии трех основных признаков вос­паления (гиперемия, болезненность, отек), а также при изменении характера секрета вымени (полужидкая консистенция, сероватый цвет, присутствие сгустков казеина, гноя и слизи) можно ставить пред- варительнй диагноз на клинический мастит. Чтобы начать лечение следует определить видовой состав микрофлоры, её чувствительность к противомаститным препаратам или отдельным химиотерапевтичес­ким средствам (антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны). Таким образом, выбор терапевтических средств будет обоснованным. Из­вестно более 30 видов микроорганизмов, способных осложнять тече­ние воспалительного процесса в вымени и других органах животного. Многие из них являются опасными для человека и при определенных условиях могут вызывать инфекционную патологию. Поэтому важным ветеринарно-санитарным мероприятием на фермах является свое­временное выявление заболевания коров маститами и проведение эффективного курса их лечения [1, 3, 10].

В ветеринарной практике применяются различные профилакти­ческие и терапевтические препараты: Мастисан-А, Монклавит, Вак- камаст и другие, но проблема заболевания молочных коров масти­том остаётся по-прежнему актуальной. Для лечения маститов у коров чаще всего применяют комплексные антибиотические препараты, к сожалению, у большинства микроорганизмов появляются резистент­ные свойства и повышается их вирулентность [2, 7].

В Северо-Кавказском зональном НИВИ - филиале ФГБНУ ФРАНЦ проводятся исследования в области ветеринарного акушерства с це­лью разработки новых активнодействующих субстанций для создания новых препаратов для лечения коров с заболеваниями молочной железы. В ходе длительных исследований учеными нашего института был разработан новый препарат АОКВЕТ на основе амида олеиновой кислоты, который обладает высокой терапевтической эффективнос­тью при маститах, при этом не является антибиотическим средством [5, 6].

Целью исследований стало изучение чувствительности микрофло­ры, выделяемой при маститах, и определение уровня терапевтичес­кой эффективности нового препарата АОКВЕТ.

Материалы и методы исследований. На видовой состав микро­флоры было исследовано всего 9 проб молока. Из каждой пробы дела­ли высев на разные виды сред: 5%-кровяной агар, содержащий 7,5% хлористого натрия для выделения гемолитического стафилококка; пи­тательный агар (ПА), среду ЭНДО для группы кишечной палочки; среду Плоскирева для выделения сальмонелл; жидкий питательный бульон (ПБ) для выявления синегнойной палочки.

Чувствительность патогенной микрофлоры Streptococous sp., St. aureus и E. coli к различным химиотерапевтическим препаратам определяли методом диффузии в агар. Для исследований использо­вали плотную питательную среду Луриа-Бертани, которую заливали в чашки Петри по 25 мл в каждую. Чашки подсушивали в течение 10­20 мин. На поверхность чашек Петри с питательной средой наносили 1-2 мл взвеси бактериальных культур Staphylococcus aureus (штамм 6538p), Escherichia coli (полевой штамм F-50) и Streptococous sp. (полевой изолят выделен из молока кошек) густотой 5 единиц опти­ческого стандарта мутности (0,5*109 мкл/мл). Взвесь распределяли в чашке равномерно по поверхности среды специальным шпате­лем, при необходимости избыток удаляли. Чашки подсушивали 15­25 минут. Размечали сектора (3-6). В сектора размещали по 1 диску из фильтр-картона НД - ПМП - 1 ГОСТ 6722 - 75. На диск наносили 15 мкл испытуемого препарата концентрацией 1000 мкг/мл, нагруз­ка составляла 15 мкг препарата на каждый диск. Подготовленные чашки помещали в термостат при 37°С на 24 часа. Величину зоны задержки роста культуры бактерий оценивали в мм [8].

Методика в нашей модификации в переводе на английский язык опубликована в высокорейтинговом зарубежном журнале Polyhedron в 2018 году [11, 12].

Общую микробную обсемененность секрета молочной железы до и после применения амида олеиновой кислоты изучали на 20 коро­вах, которых поделили на 2 группы по 10 голов.

В первой группе наблюдали животных с серозно-катаральной фор­мой мастита, во второй группе - животных со скрытым маститом, вы­явленным при помощи кенотеста.

В первый день перед введением препарата взяли пробы молока из больных долей вымени в разовые стаканчики по 50 мл после удале­ния первых порций молока путем ручного сдаивания, затем больным животным ввели препарат АОКВЕТ интрацистернально с помощью молочного катетера (одна доза составляла 10 мл, на одну четверть вы­мени, препарат вводили 2 раза в сутки до полного выздоровления).

Через 12 и 24 часа после введения препарата у коров взяли про­бы молока перед основным доением. Из проб молока, взятых до и после введения препарата, отобрали по 1 мл молока и перенесли в стерильные бактериологические пробирки с 5 мл стерильной дистил­лированной воды. Пробы хранили при температуре +4°С.

В лаборатории СКЗНИВИ приготовили разведения проб молока 1:10, 1:100, 1:1000. Из этих разведений с целью определения уровня микробной загрязненности (КОЕ - число колониеобразующих единиц) провели посевы на питательный агар (далее, ПА), на среду ЭНДО, на среду Плоскирева, на жидкий питательный бульон (далее, ПБ). Посевы с чашками поместили в термостат при температуре 37°С на 24 часа.

Результаты исследований и их обсуждение. При бактериоло­гическом исследовании секрета 98 проб от больных коров с суб­клиническим и клиническим маститом, выявлено 28 (27,4%) проб с содержанием стафилококков и стрептококков; в 10 пробах они от­сутствовали. Из пораженных долей молочной железы было выделено 44 штамма микроорганизмов, среди которых 28 (13,7%) было отне­сено к стафилококкам и 16 (7,4%) к стрептококкам. В 53,1% случаев из пораженных долей вымени выделены в смешанной культуре стреп­тококки и стафилококки одновременно. В виде монокультуры стафи­лококки выделены из 12 проб молока (5,8%).

Бактериологические исследования контаминации молока пред­ставлены в таблице 1.

Таблица 1 Результаты бактериологических исследований

Установленный диагноз (исследовано проб)	Выделенные микроорганизмы в пробах молока
	Стафилококк		Стрептококк		Кишечная палочка		Смешанная контаминация		Всего культур
	Количество проб	%	Количество проб	%	Количество проб	%	Количество проб	%	Количество проб	%
Серозно-катаральный мастит (13)	2	16,6	-	-	1	9,2	1	8,3	11	34,1
Скрытый мастит (28)	5	17,8	2	7,1	-	-	3	10,7	10	36,3
Клинически здоровые животные (57)	3	5,4	1	0,3	-	-	-	-	4	5,7

При бактериологическом анализе молока от 41 коровы с серозно­катаральным и субклиническим маститом выявлено 4 (19%) пробы со смешанным содержанием стафилококков и стрептококков. Всего выделено культур патогенных микроорганизмов в пробах больных коров с серозно-катаральным маститом 34,1%. Из них выявлено 2 (16,6%) пробы с наличием стафилококка (St. aureus) и 1 (9,2%) про­ба с выявленной кишечной палочкой (E. coli). Наличие стрептококко­вой микрофлоры в пробах не выявлено.

В 28 пробах, взятых от больных коров с субклиническим маститом, обнаружено 5 (17,8%) проб с наличием стафилококка (St. aureus), 2 (7,1%) пробы с наличием стрептококков и 3 (10,7%) пробы со сме­шанной микрофлорой стафилококков и стрептококков.

Наличие синегнойной палочки (Ps. aeruginosa) и бактерии рода сальмонелла (Salmonella sp.) не установлено.

Санитарное качество молока здоровых коров (57 проб) соответст­вовало нормам СанПИН по уровню содержания микрофлоры.

Таким образом, проведённые исследования по определению уровня контаминации молока патогенной и условно-патогенной мик­рофлорой показали, что определяющая роль в этиологии маститов принадлежит кокковой микрофлоре. Это подтвердилось нашими ис­следованиями общего числа микроорганизмов в 1 мл содержимого секрета пораженных долей вымени у коров с серозно-катаральными и субклиническими признаками мастита в сравнении со здоровыми животными.

В таблице 2 представлены результаты определения чувствитель­ности выделенной микрофлоры при маститах к различным препара­там методом диффузии в агар. Оценка производилась по величине зоны задержки роста культуры в мм.

Таблица 2 Чувствительность выделенной микрофлоры к противомаститным препаратам и отдельным антибиотикам

Препарат	Антимикробная активность, зона задержки культуры, мм
	Streptococous sp.	St. aureus	E. coli
Мастисан-А	12	12	10
Амоксициллин	12	12	8
Бицилин-5	12	16	8
Цефтриаксон	10	17	8
Ципрофлоксацин	30	24	26
АОКВЕТ	15	16	24

Таким образом, показатели уровня бактериальной контаминации свидетельствуют о значительном снижении микробного числа в мо­локе уже после 12 часов, то есть после однократного введения пре­парата АОКВЕТ: в первом разведении (1:10) - в 13 раз, во втором разведении (1:100) - в 23 раза, в третьем разведении (1:1000) - в 7 раз, то есть уровень бактериального загрязнения молока снижается после введения препарата в среднем в 14 раз. После 24 часов ле­чения животных (препарат ввели двукратно) уровень контаминации снизился еще на 50%. Через 48 часов уровень контаминации секрета молочной железы снизился до минимального уровня.

Из данных таблицы 3 видно, что в пробах молока до начала ле­чения животных, через 12 часов после введения препарата АОКВЕТ и после 24 часов не было обнаружено бактерий кишечной палочки (рода E. coli и рода Salmonella). В пробах молока при высеве на пита­тельный бульон также не обнаружили бактерий синегнойной палочки (рода Ps. aeruginosa).

Таблица 3 Определение уровня бактериальной контаминации молока при высеве на питательный агар у коров с субклиническим маститом

Экспозиции от момента введения препарата АОКВЕТ	Общая бактериальная обсемененность, число КОЕ
	Разведения проб молока
	10-1	10-2	10-3
Перед введением	196	46	7
Через 12 часов после введения	15	2	1
Через 24 часа лечения	7	1	0
Через 48 часов лечения	1	0	0

Последующие исследования секрета молочной железы (12 часов, 24 часа и 48 часов) после введения в исследованных пробах моло­ка, не выявили особо значимых в этиологии маститов бактериаль­ных патогенов E. coli, Salmonella, Ps. aeruginosa, которые зачастую являются возбудителями маститов вымени или отдельных четвертей у продуктивных молочных коров.

Для уточнения форм возбудителей, из выросших колоний делали мазки, которые окрашивали по Грамму. При микроскопии мазков, приготовленных из колоний, выросших на питательном агаре, ок­рашенных по Грамму, обнаружили наличие кокковой микрофлоры и грамотрицательных бактерий (Proteus vulgaris), вероятно данный вид бактерий был причиной проявления субклинической формы мастита.

Таблица 4 Определение уровня бактериальной контаминации молока при высеве на питательный агар у коров с серозно-катаральным маститом

Экспозиции от момента введения препарата АОКВЕТ	Общая бактериальная обсемененность, число КОЕ			19
	Разведения проб молока
	10-1	10-2	10-1
Перед введением	238	48	17
Через 12 часов после введения	56	16	1
Через 24 часа лечения	31	10	0
Через 48 часов лечения	12	0	0

При определении уровня бактериальной обсемененности моло­ка при высеве на питательный агар, мы видим, что после введения препарата АОКВЕТ, число КОЕ уменьшилось в разы (табл. 4). Через 12 часов после введения количество клеток стало на 67% меньше. Если процедуру введения препарата повторить 2-3 раза, то число бак­териальных клеток будет минимальным, вероятность выздоровления составляла 95%.

Таким образом, показатели уровня бактериальной контаминации свидетельствуют о значительном снижении микробного числа в моло­ке даже после первого введения препарата АОКВЕТ.

В пробах молока с серозно-катаральным маститом на селектив­ных средах не было выделено бактерий рода E. coli и рода Salmonella. В пробах молока при высеве на питательный бульон также не обнару­жили бактерий рода Ps. aeruginosa.

Заключение. В целях повышения клинической и экономической эффективности лечения коров, больных маститом, необходимо про­водить лечение с учётом чувствительности возбудителей болезни к антимикробным средствам. Установлено, что при субклиническом мастите в микрофлоре молока был обнаружен Proteus vulgaris, кото­рый вероятно был причиной проявления данной формы мастита, при серозно-катаральном мастите у коров из секрета молочной железы изолировали условно-патогенную микрофлору, принадлежащую к следующим родам: Staphylococcus, Streptococcus и Escherichia. При изучении терапевтической эффективности результаты исследований свидетельствуют о том, что применение нового препарата АОКВЕТ интрацистернально, способствовало выздоровлению 95% больных животных, что соответствует уровню эффективности коммерческих антибактериальных препаратов (Мастисан-А, Амоксициллин, Ци­профлоксацин, Бициллин-5, Цефтриаксон). При использовании ком­мерческих препаратов необходимо утилизировать молоко в течение 5 суток, после последнего введения препаратов, что не требуется, если для терапии мастита применять АОКВЕТ.

Список литературы:

1. Батраков А.Я. Динамика концентрации антибиотиков в лимфе вымени коров при артериальном введении их на фоне новокаиновой блокады и без неё// Материалы XVI науч. конф. Ленинградского ветеринарного института. Л., 1970. С. 126-128.
2. Зубенко А.А., Дробин Ю.Д., Фетисов Л.Н., Бодряков А.Н. Синтез и скрининг новых соединений с высокой антимикробной активностью// В сборнике: Ак­туальные вопросы развития отраслей сельского хозяйства: теория и практика. Материалы III Всероссийской научно-практической конференции (с междуна­родным участием) и I Всероссийской конференции молодых ученых АПК. 2019. С. 207-215.
3. К вопросу о лечении мастита у коров/ И.А. Родин, И.Р. Кильметова, А.В. Седов, А.В. Капустин, М.Г. Яковец// В книге: Научно-технологическое обес­печение агропромышленного комплекса России: проблемы и решения. Сбор­ник тезисов по материалам IV Национальной конференции. 2019. С. 50.
4. Наставление по диагностике, терапии и профилактике мастита у коров// Департамент ветеринарии. 2000. 11 с.
5. Новый препарат для лечения животных при маститах/ Ю.Д. Дробин, К.Н. Кононенко, Л.Н. Фетисов, А.А. Зубенко, А.Н. Бодряков// Вопросы норма­тивно-правового регулирования в ветеринарии. 2020. № 1. С. 223-225.
6. Препарат отечественного происхождения для лечения маститов/ К.Н. Ко­ноненко, А.В. Коваленко, Л.Н. Фетисов, А.А. Зубенко, А.Н. Бодряков// Ветерина­рия и кормление. 2020. № 7. С. 22-24.
7. Разработка новых химиопрепаратов для лечения коров при маститах/ А.В. Коваленко, К.Н. Кононенко, Л.Н. Фетисов, А.А. Зубенко, А.И. Клименко, А.Н. Бодряков// Ветеринария и кормление. 2020. № 6. С. 26-28.
8. Санитарно-микробиологические исследования молока и молочных про­дуктов/ Л.И. Смирнова, А.А. Сухинин, И.В. Белкина, Е.И. Приходько, У.А. Фепоно- ва// СПб.: Изд-во СПбГАВМ, 2009. 54 с.
9. Способ лечения маститов у животных/ Ю.Д. Дробин, А.А. Зубенко, И.А. Родин, К.Н. Кононенко, Л.Н. Фетисов, А.Н. Бодряков// Патент на изобрете­ние RU 2711195 C1, 15.01.2020. Заявка № 2019127355 от 29.08.2019.
10. Чекрышева В.В. Диагностика и рациональные методы терапии при кли­ническом мастите коров. 2020.
11. Burlov A.S., Koshchienko Y.V., Makarova N.I., Borodkin G.S., Metelitsa A.V., Vlasenko V.G., Zubenko A.A., Drobin Y.D., Zubavichus Y.V., Garnovskii D.A. Complexes of zinc(II) with n-[2-(hydroxyalkyliminomethyl)phenyl]-4-methylbenzene sulfonamides: synthesis, structure, photoluminescence properties and biological activity// Polyhedron. 2018. Т. 144. pp. 249-258.
12. Burlov A.S., Koshchienko Y.V., Makarova N.I., Kolodina A.A., Vlasenko V.G., Zubenko A.A., Drobin Y.D., Fetisov L.N., Zubavichus Y.V., Trigub A.L., Levchenkov S.I., Garnovskii D.A. Synthesis, characterization, luminescent properties and biological activities of zinc complexes with bidentate azomethine schiff-base ligands// Polyhedron. 2018. Т. 154. pp. 65-76.

Резюме. Известно, что в этиологии маститов определяющая роль прина­длежит патогенной и условно-патогенной микрофлоре, в состав которой часто входят стрептококки, стафилококки и значительно реже различные энтеробак­терии. В пробах молока от коров с признаками поражения молочной железы изолируют патогенную микрофлору чаще в форме ассоциаций, реже в виде мо­нокультур. Рациональный и эффективный подход к лечению коров при маститах, в первую очередь, предусматривает проведение бактериологических исследо­ваний, включающих определение видового состава микрофлоры и ее чувстви­тельности к противомаститным и отдельным антибактериальным препаратам. В настоящей работе представлены исследования 98 проб молока на видовой состав микрофлоры и её чувствительность к различным препаратам. Из каждой пробы делали высевы на разные виды сред. При бактериологическом иссле­довании молока от больных коров с субклиническим и клиническим маститом, выявлено: 28 проб (27,4%) с содержанием стафилококков и стрептококков, 10 проб (10,2 %) - без микроорганизмов. Из пораженных долей молочной железы было выделено 44 штаммов микроорганизмов, среди которых: 28 проб (13,7 %) 20 было отнесено к стафилококкам; 16 проб (7,4 %) к стрептококкам. В 53,1% случаев из пораженных долей вымени выделены в смешанной культуре стреп­тококки и стафилококки одновременно. В виде монокультуры стафилококки выделены из 12 проб молока (5,8%). После определения видового состава мик­рофлоры в пробах молока, взятых от коров больных субклиническим и серозно­катаральным маститом, изучили динамику микробной контаминации в молоке до и после лечения животных препаратом АОКВЕТ. В результате однократного интрацистернального введения препарата АОКВЕТ уровень общего микробно­го загрязнения секрета вымени уменьшился на 67%. После третьего введения уровень контаминации в молоке был минимальным, что свидетельствовало о выздоровлении животных.

Ключевые слова: коровы, мастит, контаминация молока, препарат «АОКВЕТ», антибактериальная активность, патогенные микроорганизмы, условно-патоген­ная микрофлора, стрептококки, стафилококки, неантибиотические средства.

Сведения об авторах:

Кононенко Кристина Николаевна, младший научный сотрудник Северо­Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института -филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-918-5943886; e-mail: velikayakrista@mail.ru.

Клименко Александр Иванович, академик РАН, доктор сельскохозяйствен­ных наук, профессор, директор ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный на­учный центр»; 346735, Ростовская область, Аксайский район, пос. Рассвет, ул. Институтская, 1; тел.: 8-86350-37389.

Ответственный за переписку с редакцией: Чекрышева Виктория Вла­димировна, кандидат ветеринарных наук, директор Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Рос­товская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-908-5110139; e-mail: veterinar1987@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей