УДК 619:636.2
DOI 10.33861/2071-8020-2021-6-18-20
Кононенко К.Н., Чекрышева В.В., Клименко А.И. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Федеральный Ростовский аграрный научный центр», Ростовская область, пос. Рассвет
Значительный ущерб хозяйствам с молочным скотоводством наносит воспаление молочной железы - мастит. При мастите резко снижается молочная продуктивность коров. Причины возникновения мастита интересуют ученых давно. Данное заболевание может быть клинически выражено или проявляться в скрытой субклинической форме. Причем скрытая форма мастита часто преобладает над клинической формой по количеству заболевших животных. Если при диагностировании животных на наличие мастита любой формы упустить раннюю стадию его проявления, то вероятность благоприятного исхода заболевания будет минимальной. Таким образом, своевременная диагностика обусловливает также снижение затрат на проведение лечебных мероприятий [1, 4].
Для первичной диагностики мастита обычно используют кенотест, который позволяет определить скрытую форму мастита. Для постановки диагноза клинической формы мастита проводят осмотр и пальпацию молочной железы. При наличии трех основных признаков воспаления (гиперемия, болезненность, отек), а также при изменении характера секрета вымени (полужидкая консистенция, сероватый цвет, присутствие сгустков казеина, гноя и слизи) можно ставить пред- варительнй диагноз на клинический мастит. Чтобы начать лечение следует определить видовой состав микрофлоры, её чувствительность к противомаститным препаратам или отдельным химиотерапевтическим средствам (антибиотики, сульфаниламиды, нитрофураны). Таким образом, выбор терапевтических средств будет обоснованным. Известно более 30 видов микроорганизмов, способных осложнять течение воспалительного процесса в вымени и других органах животного. Многие из них являются опасными для человека и при определенных условиях могут вызывать инфекционную патологию. Поэтому важным ветеринарно-санитарным мероприятием на фермах является своевременное выявление заболевания коров маститами и проведение эффективного курса их лечения [1, 3, 10].
В ветеринарной практике применяются различные профилактические и терапевтические препараты: Мастисан-А, Монклавит, Вак- камаст и другие, но проблема заболевания молочных коров маститом остаётся по-прежнему актуальной. Для лечения маститов у коров чаще всего применяют комплексные антибиотические препараты, к сожалению, у большинства микроорганизмов появляются резистентные свойства и повышается их вирулентность [2, 7].
В Северо-Кавказском зональном НИВИ - филиале ФГБНУ ФРАНЦ проводятся исследования в области ветеринарного акушерства с целью разработки новых активнодействующих субстанций для создания новых препаратов для лечения коров с заболеваниями молочной железы. В ходе длительных исследований учеными нашего института был разработан новый препарат АОКВЕТ на основе амида олеиновой кислоты, который обладает высокой терапевтической эффективностью при маститах, при этом не является антибиотическим средством [5, 6].
Целью исследований стало изучение чувствительности микрофлоры, выделяемой при маститах, и определение уровня терапевтической эффективности нового препарата АОКВЕТ.
Материалы и методы исследований. На видовой состав микрофлоры было исследовано всего 9 проб молока. Из каждой пробы делали высев на разные виды сред: 5%-кровяной агар, содержащий 7,5% хлористого натрия для выделения гемолитического стафилококка; питательный агар (ПА), среду ЭНДО для группы кишечной палочки; среду Плоскирева для выделения сальмонелл; жидкий питательный бульон (ПБ) для выявления синегнойной палочки.
Чувствительность патогенной микрофлоры Streptococous sp., St. aureus и E. coli к различным химиотерапевтическим препаратам определяли методом диффузии в агар. Для исследований использовали плотную питательную среду Луриа-Бертани, которую заливали в чашки Петри по 25 мл в каждую. Чашки подсушивали в течение 1020 мин. На поверхность чашек Петри с питательной средой наносили 1-2 мл взвеси бактериальных культур Staphylococcus aureus (штамм 6538p), Escherichia coli (полевой штамм F-50) и Streptococous sp. (полевой изолят выделен из молока кошек) густотой 5 единиц оптического стандарта мутности (0,5*109 мкл/мл). Взвесь распределяли в чашке равномерно по поверхности среды специальным шпателем, при необходимости избыток удаляли. Чашки подсушивали 1525 минут. Размечали сектора (3-6). В сектора размещали по 1 диску из фильтр-картона НД - ПМП - 1 ГОСТ 6722 - 75. На диск наносили 15 мкл испытуемого препарата концентрацией 1000 мкг/мл, нагрузка составляла 15 мкг препарата на каждый диск. Подготовленные чашки помещали в термостат при 37°С на 24 часа. Величину зоны задержки роста культуры бактерий оценивали в мм [8].
Методика в нашей модификации в переводе на английский язык опубликована в высокорейтинговом зарубежном журнале Polyhedron в 2018 году [11, 12].
Общую микробную обсемененность секрета молочной железы до и после применения амида олеиновой кислоты изучали на 20 коровах, которых поделили на 2 группы по 10 голов.
В первой группе наблюдали животных с серозно-катаральной формой мастита, во второй группе - животных со скрытым маститом, выявленным при помощи кенотеста.
В первый день перед введением препарата взяли пробы молока из больных долей вымени в разовые стаканчики по 50 мл после удаления первых порций молока путем ручного сдаивания, затем больным животным ввели препарат АОКВЕТ интрацистернально с помощью молочного катетера (одна доза составляла 10 мл, на одну четверть вымени, препарат вводили 2 раза в сутки до полного выздоровления).
Через 12 и 24 часа после введения препарата у коров взяли пробы молока перед основным доением. Из проб молока, взятых до и после введения препарата, отобрали по 1 мл молока и перенесли в стерильные бактериологические пробирки с 5 мл стерильной дистиллированной воды. Пробы хранили при температуре +4°С.
В лаборатории СКЗНИВИ приготовили разведения проб молока 1:10, 1:100, 1:1000. Из этих разведений с целью определения уровня микробной загрязненности (КОЕ - число колониеобразующих единиц) провели посевы на питательный агар (далее, ПА), на среду ЭНДО, на среду Плоскирева, на жидкий питательный бульон (далее, ПБ). Посевы с чашками поместили в термостат при температуре 37°С на 24 часа.
Результаты исследований и их обсуждение. При бактериологическом исследовании секрета 98 проб от больных коров с субклиническим и клиническим маститом, выявлено 28 (27,4%) проб с содержанием стафилококков и стрептококков; в 10 пробах они отсутствовали. Из пораженных долей молочной железы было выделено 44 штамма микроорганизмов, среди которых 28 (13,7%) было отнесено к стафилококкам и 16 (7,4%) к стрептококкам. В 53,1% случаев из пораженных долей вымени выделены в смешанной культуре стрептококки и стафилококки одновременно. В виде монокультуры стафилококки выделены из 12 проб молока (5,8%).
Бактериологические исследования контаминации молока представлены в таблице 1.
Таблица 1 Результаты бактериологических исследований
| Установленный диагноз (исследовано проб) | Выделенные микроорганизмы в пробах молока | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Стафилококк | Стрептококк | Кишечная палочка | Смешанная контаминация | Всего культур | ||||||
| Количество проб | % | Количество проб | % | Количество проб | % | Количество проб | % | Количество проб | % | |
| Серозно-катаральный мастит (13) | 2 | 16,6 | - | - | 1 | 9,2 | 1 | 8,3 | 11 | 34,1 |
| Скрытый мастит (28) | 5 | 17,8 | 2 | 7,1 | - | - | 3 | 10,7 | 10 | 36,3 |
| Клинически здоровые животные (57) | 3 | 5,4 | 1 | 0,3 | - | - | - | - | 4 | 5,7 |
При бактериологическом анализе молока от 41 коровы с серознокатаральным и субклиническим маститом выявлено 4 (19%) пробы со смешанным содержанием стафилококков и стрептококков. Всего выделено культур патогенных микроорганизмов в пробах больных коров с серозно-катаральным маститом 34,1%. Из них выявлено 2 (16,6%) пробы с наличием стафилококка (St. aureus) и 1 (9,2%) проба с выявленной кишечной палочкой (E. coli). Наличие стрептококковой микрофлоры в пробах не выявлено.
В 28 пробах, взятых от больных коров с субклиническим маститом, обнаружено 5 (17,8%) проб с наличием стафилококка (St. aureus), 2 (7,1%) пробы с наличием стрептококков и 3 (10,7%) пробы со смешанной микрофлорой стафилококков и стрептококков.
Наличие синегнойной палочки (Ps. aeruginosa) и бактерии рода сальмонелла (Salmonella sp.) не установлено.
Санитарное качество молока здоровых коров (57 проб) соответствовало нормам СанПИН по уровню содержания микрофлоры.
Таким образом, проведённые исследования по определению уровня контаминации молока патогенной и условно-патогенной микрофлорой показали, что определяющая роль в этиологии маститов принадлежит кокковой микрофлоре. Это подтвердилось нашими исследованиями общего числа микроорганизмов в 1 мл содержимого секрета пораженных долей вымени у коров с серозно-катаральными и субклиническими признаками мастита в сравнении со здоровыми животными.
В таблице 2 представлены результаты определения чувствительности выделенной микрофлоры при маститах к различным препаратам методом диффузии в агар. Оценка производилась по величине зоны задержки роста культуры в мм.
Таблица 2 Чувствительность выделенной микрофлоры к противомаститным препаратам и отдельным антибиотикам
| Препарат | Антимикробная активность, зона задержки культуры, мм | ||
|---|---|---|---|
| Streptococous sp. | St. aureus | E. coli | |
| Мастисан-А | 12 | 12 | 10 |
| Амоксициллин | 12 | 12 | 8 |
| Бицилин-5 | 12 | 16 | 8 |
| Цефтриаксон | 10 | 17 | 8 |
| Ципрофлоксацин | 30 | 24 | 26 |
| АОКВЕТ | 15 | 16 | 24 |
Таким образом, показатели уровня бактериальной контаминации свидетельствуют о значительном снижении микробного числа в молоке уже после 12 часов, то есть после однократного введения препарата АОКВЕТ: в первом разведении (1:10) - в 13 раз, во втором разведении (1:100) - в 23 раза, в третьем разведении (1:1000) - в 7 раз, то есть уровень бактериального загрязнения молока снижается после введения препарата в среднем в 14 раз. После 24 часов лечения животных (препарат ввели двукратно) уровень контаминации снизился еще на 50%. Через 48 часов уровень контаминации секрета молочной железы снизился до минимального уровня.
Из данных таблицы 3 видно, что в пробах молока до начала лечения животных, через 12 часов после введения препарата АОКВЕТ и после 24 часов не было обнаружено бактерий кишечной палочки (рода E. coli и рода Salmonella). В пробах молока при высеве на питательный бульон также не обнаружили бактерий синегнойной палочки (рода Ps. aeruginosa).
Таблица 3 Определение уровня бактериальной контаминации молока при высеве на питательный агар у коров с субклиническим маститом
| Экспозиции от момента введения препарата АОКВЕТ | Общая бактериальная обсемененность, число КОЕ | ||
|---|---|---|---|
| Разведения проб молока | |||
| 10-1 | 10-2 | 10-3 | |
| Перед введением | 196 | 46 | 7 |
| Через 12 часов после введения | 15 | 2 | 1 |
| Через 24 часа лечения | 7 | 1 | 0 |
| Через 48 часов лечения | 1 | 0 | 0 |
Последующие исследования секрета молочной железы (12 часов, 24 часа и 48 часов) после введения в исследованных пробах молока, не выявили особо значимых в этиологии маститов бактериальных патогенов E. coli, Salmonella, Ps. aeruginosa, которые зачастую являются возбудителями маститов вымени или отдельных четвертей у продуктивных молочных коров.
Для уточнения форм возбудителей, из выросших колоний делали мазки, которые окрашивали по Грамму. При микроскопии мазков, приготовленных из колоний, выросших на питательном агаре, окрашенных по Грамму, обнаружили наличие кокковой микрофлоры и грамотрицательных бактерий (Proteus vulgaris), вероятно данный вид бактерий был причиной проявления субклинической формы мастита.
Таблица 4 Определение уровня бактериальной контаминации молока при высеве на питательный агар у коров с серозно-катаральным маститом
| Экспозиции от момента введения препарата АОКВЕТ | Общая бактериальная обсемененность, число КОЕ | 19 | ||
|---|---|---|---|---|
| Разведения проб молока | ||||
| 10-1 | 10-2 | 10-1 | ||
| Перед введением | 238 | 48 | 17 | |
| Через 12 часов после введения | 56 | 16 | 1 | |
| Через 24 часа лечения | 31 | 10 | 0 | |
| Через 48 часов лечения | 12 | 0 | 0 | |
При определении уровня бактериальной обсемененности молока при высеве на питательный агар, мы видим, что после введения препарата АОКВЕТ, число КОЕ уменьшилось в разы (табл. 4). Через 12 часов после введения количество клеток стало на 67% меньше. Если процедуру введения препарата повторить 2-3 раза, то число бактериальных клеток будет минимальным, вероятность выздоровления составляла 95%.
Таким образом, показатели уровня бактериальной контаминации свидетельствуют о значительном снижении микробного числа в молоке даже после первого введения препарата АОКВЕТ.
В пробах молока с серозно-катаральным маститом на селективных средах не было выделено бактерий рода E. coli и рода Salmonella. В пробах молока при высеве на питательный бульон также не обнаружили бактерий рода Ps. aeruginosa.
Заключение. В целях повышения клинической и экономической эффективности лечения коров, больных маститом, необходимо проводить лечение с учётом чувствительности возбудителей болезни к антимикробным средствам. Установлено, что при субклиническом мастите в микрофлоре молока был обнаружен Proteus vulgaris, который вероятно был причиной проявления данной формы мастита, при серозно-катаральном мастите у коров из секрета молочной железы изолировали условно-патогенную микрофлору, принадлежащую к следующим родам: Staphylococcus, Streptococcus и Escherichia. При изучении терапевтической эффективности результаты исследований свидетельствуют о том, что применение нового препарата АОКВЕТ интрацистернально, способствовало выздоровлению 95% больных животных, что соответствует уровню эффективности коммерческих антибактериальных препаратов (Мастисан-А, Амоксициллин, Ципрофлоксацин, Бициллин-5, Цефтриаксон). При использовании коммерческих препаратов необходимо утилизировать молоко в течение 5 суток, после последнего введения препаратов, что не требуется, если для терапии мастита применять АОКВЕТ.
Список литературы:
Резюме. Известно, что в этиологии маститов определяющая роль принадлежит патогенной и условно-патогенной микрофлоре, в состав которой часто входят стрептококки, стафилококки и значительно реже различные энтеробактерии. В пробах молока от коров с признаками поражения молочной железы изолируют патогенную микрофлору чаще в форме ассоциаций, реже в виде монокультур. Рациональный и эффективный подход к лечению коров при маститах, в первую очередь, предусматривает проведение бактериологических исследований, включающих определение видового состава микрофлоры и ее чувствительности к противомаститным и отдельным антибактериальным препаратам. В настоящей работе представлены исследования 98 проб молока на видовой состав микрофлоры и её чувствительность к различным препаратам. Из каждой пробы делали высевы на разные виды сред. При бактериологическом исследовании молока от больных коров с субклиническим и клиническим маститом, выявлено: 28 проб (27,4%) с содержанием стафилококков и стрептококков, 10 проб (10,2 %) - без микроорганизмов. Из пораженных долей молочной железы было выделено 44 штаммов микроорганизмов, среди которых: 28 проб (13,7 %) 20 было отнесено к стафилококкам; 16 проб (7,4 %) к стрептококкам. В 53,1% случаев из пораженных долей вымени выделены в смешанной культуре стрептококки и стафилококки одновременно. В виде монокультуры стафилококки выделены из 12 проб молока (5,8%). После определения видового состава микрофлоры в пробах молока, взятых от коров больных субклиническим и серознокатаральным маститом, изучили динамику микробной контаминации в молоке до и после лечения животных препаратом АОКВЕТ. В результате однократного интрацистернального введения препарата АОКВЕТ уровень общего микробного загрязнения секрета вымени уменьшился на 67%. После третьего введения уровень контаминации в молоке был минимальным, что свидетельствовало о выздоровлении животных.
Ключевые слова: коровы, мастит, контаминация молока, препарат «АОКВЕТ», антибактериальная активность, патогенные микроорганизмы, условно-патогенная микрофлора, стрептококки, стафилококки, неантибиотические средства.
Сведения об авторах:
Кононенко Кристина Николаевна, младший научный сотрудник СевероКавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института -филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-918-5943886; e-mail: velikayakrista@mail.ru.
Клименко Александр Иванович, академик РАН, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, директор ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346735, Ростовская область, Аксайский район, пос. Рассвет, ул. Институтская, 1; тел.: 8-86350-37389.
Ответственный за переписку с редакцией: Чекрышева Виктория Владимировна, кандидат ветеринарных наук, директор Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-908-5110139; e-mail: veterinar1987@mail.ru.
http://vetkuban.com/num6_202119.html