Влияние антибиотикотерапии на имунно-физиологический статус рыб

УДК 619:616.15:639.2.09:615.33
DOI 10.33861/2071-8020-2023-5-46-48

Романова Н. Н., Сехина О. В., Вишторская А. А. Филиал по пресноводному рыбному хозяйству Федерального государственного
бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»
Федерального агентства по рыболовству, Московская область

Объемы воспроизводства ценных видов рыб и производства продукции товарной аквакультуры в России в последние годы резко выросли [12]. Интенсификация технологических процессов неизбежно приводит к возникновению напряженной эпизоотической ситуации на рыбоводных предприятиях. Высокие плотности посадки, хендлинг, несоответствующее качество воды снижают иммуно-физиологический статус рыб, и на фоне ослабления иммунной системы рыбы часто болеют и в основном бактериальными инфекциями, которые развиваются при контаминации органов бактериальной микрофлорой, которая находится в воде. Если вовремя не провести лечение, то могут быть большие потери рыбопосадочного материала и рыбной продукции.

При развитии бактериальных инфекций у рыб применение антибактериальных препаратов позволяет приостановить развивающийся патологический процесс и вспышку заболевания. С другой стороны, частое применение антибиотиков формирует у бактерий резистентность (устойчивость), что в дальнейшим приводит к тому, что они становятся неэффективными для лечения [5]. В связи с этим поиск новых эффективных антибиотиков для использования в животноводстве, в том числе в аквакультуре, является актуальным направлением ветеринарии.

Другой сложностью разработки терапии является то, что бактериальные инфекции у рыб чаще всего вызывают разные виды бактерий и, в связи с этим, возникает сложность подбора эффективного антибиотика для лечения, который бы действовал на весь спектр возбудителей. В последние годы в медицине и ветеринарии для лечения бактериозов используют комбинированный метод, заключающий в применении двух разных антибиотиков одновременно. Это направление начинают поддерживать и практики-рыбоводы для разработки эффективных схем лечения бактериальных инфекций рыб.

С другой стороны, антибиотикотерапия является дополнительным стресс-фактором на организм рыб, снижающим общую резистентность и может привести к нежелательным побочным эффектам.

Для осуществления рационального применения антибиотиков необходимы сведения о возможном влиянии на рыб применяемых лекарственных препаратов. Информации по этому вопросу очень мало, в основном изучали токсичность антибиотиков на организм теплокровных животных [7, 8].

В основе воздействия антибиотиков лежит подавление и уничтожение не только патогенной, но и полезной микрофлоры, что приводит к дисбактериозу и снижению иммунитета. Оценка действия антибиотиков на организм рыб и выявление изменений в крови является достаточно информационной. Кровь является лабильной тканью, ее количественные показатели чувствительны к изменениям, происходящим в организме, и отражают его ответную реакцию.

Цель исследования - оценить влияние антибиотикотерапии на иммуно-физиологический статус рыб.

Материалы и методы исследований. Экспериментальные работы проводили на годовиках карпа (ср. масса 30 г) и гибридах сибирского осетра х калуги (далее, СО х К) («29,7 г).

Во время проведения эксперимента температура воды в аквариумах с опытной и контрольной рыбой составляла 18,0-21,0°C, содержание растворенного кислорода - 6,9-8,1 мг/л. Для кормления использовали экструдированные продукционные корма. Суточная норма кормления составила «1% от массы рыбы.

Были сформированы 2 группы рыб (контрольная и опытная) по 15 экземпляров в каждой. Для рыб опытной группы в комбикорм одновременно вводили 2 антибиотика: «Левофлоксацин» и «Хлорте-трациклин» в дозировках 1000 мг/кг и 200 мг/кг ихтиомассы. Эти антибиотики являются новыми для терапии бактериальных инфекций у рыб, первые положительные результаты по оценки эффективности были получены при выполнении научно-исследовательской работы по разработке новых методов профилактики и лечения болезней объектов аквакультуры [6]. Курс кормления составил 7 суток (традиционная длительность курса антибиотикотерапии). Опыты проводили по аналогии у карпа и гибрида СО х К.

Левофлоксацин относится к антибиотикам широкого спектра действия из группы фторхинолонов. Активно действующим веществом является офлоксацин. Препарат активен в отношении большинства штаммов микроорганизмов [13].

Хлортетрациклин - антибиотик широкого спектра действия из тетрациклинового ряда. Он подавляет рост и развитие многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов [14].

Для оценки влияния антибиотиков на организм рыб проводили гематологический анализ. Кровь отбирали из хвостовой артерии пастеровской пипеткой. Анализ проведен согласно Методическим указаниям по проведению гематологического обследования рыб [4]. Определяли следующие гематологические показатели:

• гемоглобин - гемоглобинцианидным методом на приборе МиниГЕМ-540;
• число эритроцитов - пробирочным методом с подсчетом в камере Горяева;
• содержание гемоглобина в эритроците (СГЭ) - по формуле Гительсона и Терского;
• процентное соотношение незрелых форм эритроцитов (эритропоэз) на мазках крови, окрашенных по Паппенгейму (Романовскому-Гимза);
• количество лейкоцитов;
• лейкоцитарную формулу;
• абсолютное значение лейкоцитов.

Идентификацию форменных элементов крови проводили по общепринятой классификации [2].

Для оценки реактивности организма рыб на антибиотикотера-пию рассчитывали лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) - показатель, характеризующий степень эндогенной интоксикации. Расчет проводили по формуле Кальф-Калифа на основании полученных данных при анализе микроскопии лейкоцитарной формулы.

Лейкоцитарный индекс интоксикации Кальф - Калифа [1]:

где М - миелоциты; Плазм.кл. - плазматические клетки; Ю - юные; Мц - моноциты; П - палочкоядерные; Лц - лимфоциты; Сегм. - сегментоядерные; Эоз. - эозинофилы [3].

Статистическая обработка материала проведена с помощью программы Microsoft Excel.

Результаты исследований и их обсуждение. После 7-дневного курса антибиотикотерапии внешних изменений у опытных рыб (как у карпа, так и гибрида СО х К) не выявлено, поведение их не отличалось от рыб контрольных групп.

Результаты гематологического анализа карпа приведены в таблице 1. Достоверно значимых различий в эритроцитарной картине между контрольной и опытной группами не выявили. Но хотелось бы отметить, что у рыб, получавших антибиотик, содержания гемоглобина было немного выше (на 7,5%), чем у рыб контрольной группы, что, вероятно, связано с тем, что в крови больше зрелых форм эритроцитов, оснащенность их гемоглобином выше. При анализе эритроцитарной картины у опытных рыб отмечен более низкий уровень эритропоэза (количество молодых эритроцитов на 22,7% меньше).

Таблица 1 Показатели крови карпа после применения антибиотиков

Наименование показателя	Контроль	Опыт
Гемоглобин, г/л	98,38±16,91	105,80±10,60
Эритроциты, тыс./мкл	1 092,00±106,33	1 070,00±138,40
Содержание гемоглобина в эритроците (СГЭ), пг	89,69±11,71	100,57±18,16
Эритропоэз (всего молодых эритроцитов), %	7,76±1,40	6,00±2,20
Лейкоциты, тыс./мкл	50,43±33,49	70,21±18,75*
Лейкоцитарная формула
Миелоциты нейтрофильные, %	0,86±0,70	0,22±0,12
Метамиелоциты нейтрофильные, %	2,40±1,21	1,22±1,00
Палочкоядерные нейтрофилы, %	3,86±2,27	1,44±1,02
Сегментоядерные нейтрофилы, %	2,43±1,90	1,22±0,90
Общее число нейтрофилов, %	9,29±3,55	4,14±1,95*
Базофилы, %	1,60±0,55	2,00±1,87
Моноциты, %	2,57±1,13	2,44±2,13
Лимфоциты, %	85,29±6,02	91,56±3,57*
Абсолютные значения лейкоцитов
Миелоциты нейтрофильные, тыс./мкл	0,65±0,50	0,22±0,19
Метамиелоциты нейтрофильные, тыс./мкл	1,40±1,27	0,82±0,79
Палочкоядерные нейтрофилы, тыс./мкл	2,36±1,80	1,07±1,01
Сегментоядерные нейтрофилы, тыс./мкл	1,08±0,81	0,79±0,60
Общее число нейтрофилов, тыс./мкл	4,87±1,43	2,71±1,05*
Базофилы, тыс./мкл	1,02±0,74	1,11±0,69
Моноциты, тыс./мкл	1,2±0,35	1,67±1,05
Лимфоциты, тыс./мкл	44,10±10,72	62,94±9,71*

Примечание: *- различия достоверны относительно контрольной группы

После курса антибиотикотерапии общее количество лейкоцитов на 40% выше, чем у рыб из контрольной группы, что характеризует высокую резистентность организма.

В лейкоцитарной картине у карпа опытной группы выявлены нейтропения (абсолютное количество нейтрофилов снижено на 44%) и лимфоцитоз (количество лимфоцитов увеличено на 43%).

У гибридов СО х К, получавших антибиотик, изменения в эритроцитарной картине были обратные тем, которые были у карпа. Вероятно, это можно объяснить видовой специфичностью рыб. Механизм ответной реакции организма на антибиотикотерапию в эритроцитарной картине развивался иначе. Уровень гемоглобина у рыб в опытной группе значительно снижен (на 32%) по сравнению с контролем, но при этом общее количество эритроцитов оказалось выше (на 30%), а число молодых эритроцитов ниже на 45% (табл. 2). При этом достоверно значимых различий между контрольной и опытной группами не выявлено, что свидетельствует о неспецифической ответной реакции эритроцитарной картины на воздействие антибиотиков.

В лейкоцитарной картине у гибрида СО х К изменения были идентичные как у карпа, но менее выраженные. Следовательно, специфической ответной реакцией на антибиотикотерапию являются именно лейкоцитарные показатели.

Выявили достоверное увеличение общего количества лейкоцитов на 40% у рыб, получавших в рационе антибиотики. В лейкоформу-ле снизилась доля нейтрофилов (на 17% относительно контрольной группы рыб), но изменения были не такими значимыми, как у карпа, статистической достоверности не обнаружено и пересчет в абсолютные значения не показал снижения количества этих клеток к крови у опытной группы рыб (табл. 2). У гибрида СО х К отреагировали на антибиотикотерапию гранулоциты - эозинофилы - форменные элементы в цитоплазме с ярко-оранжевого цвета гранулами (рисунок 1).

Рис.1. Эозинофил в крови гибрида сибирского осетра х калуги

Они характерны для костно-хрящевых рыб, к которым и относятся осетровые. У карпа мы их не наблюдали, что связано с редкой встречаемостью их в периферической крови карповых рыб. Известно, что фагоцитарная активность их ниже, чем у моноцитов и нейтрофилов [10], а хемотаксис связан с веществами, возникающими при аллергизации [1].

Эозинофилы млекопитающих способны аккумулировать гистамин в тканях при аллергических реакциях и воспалении, возможно, что это явление характерно и для эозинофилов пойки-лотермных животных - рыб. Доля эозинофилов у гибридов осетровых рыб, получавших в рационе антибиотики, была почти в 2 раза выше, чем у контрольных рыб, а при пересчете в абсолютные значения их количество даже в 3 раза выше (табл. 2).

Таблица 2 Показатели крови гибрида сибирского осетра х калуги (СО х К) после применения максимальной дозы антибиотиков при комбинированном действии (эксперимент на токсичность антибиотиков)

Наименование показателя	Контроль	Опыт (токсичность антибиотиков)
Гемоглобин, г/л	68,83±13,79	46,63±6,35
Эритроциты, тыс./мкл	420,00±74,45	547,50±72,85
Содержание гемоглобина в эритроците (СГЭ), пг	158,69±36,93	82,58±9,51
Эритропоэз (всего молодых эритроцитов), %	18,34±5,81	10,08±2,92
Лейкоциты, тыс./мкл	38,27±15,31	53,79±12,62*
Лейкоцитарная формула
Миелоциты нейтрофильные, %	0,63±0,50	0,17±0,09
Метамиелоциты нейтрофильные, %	3,25±2,43	3,50±1,87
Палочкоядерные нейтрофилы, %	12,38±3,54	9,00±5,87
Сегментоядерные нейтрофилы, %	10,25±3,15	9,75±1,50
Общее число нейтрофилов, %	26,50±4,41	22,00±5,89
Эозинофилы, %	8,25±0,96	16,00±5,72*
Моноциты, %	1,38±0,74	2,00±1,79
Лимфоциты, %	63,88±5,59	56,83±12,32
Абсолютные значения лейкоцитов
Миелоциты нейтрофильные, тыс./мкл	0,26±0,19	0,09±0,06
Метамиелоциты нейтрофильные, тыс./мкл	1,43±1,18	1,80±0,91
Палочкоядерные нейтрофилы, тыс./мкл	5,09±3,30	5,17±3,91
Сегментоядерные нейтрофилы, тыс./мкл	3,60±1,04	5,17±2,13
Общее число нейтрофилов, тыс./мкл	10,75±5,66	11,67±5,21
Эозинофилы, тыс./мкл	2,80±1,67	8,62±1,79*
Моноциты, тыс./мкл	0,51±0,28	0,84±0,48
Лимфоциты, тыс./мкл	24,58±10,78	30,14±9,05

Примечание: *- различия достоверны относительно контрольной группы

Для оценки реактивности организма рыб на антибиотикоте-рапию рассчитали ЛИИ. Выявили у опытных групп рыб снижение ЛИИ: у карпа - в 2,75 раза, у гибрида осетра - в 1,95 раз относительно контрольных групп (рисунок 2). Более значимые колебания ЛИИ отмечены у карпа, что соответствует более выраженной степени интоксикации в организме после антибиотикотерапии.

Рис. 2. Лейкоцитарный индекс интоксикации у карпа и гибрида сибирского осетра

Заключение. Проведена экспериментальная работа по оценке воздействия антибиотикотерапии на показатели крови карпа и гибрида сибирского осетра х кулуги. Было выявлено, что показатели эритроцитарной картины являются неспецифическими маркерами, происходящие изменения характеризуют видовую ответную реакцию организма. Статистически достоверные изменения отмечали в лейкоцитарной картине. У рыб, получавших антибиотик, резко увеличивается количество лейкоцитов, что указывает на проявление стрессового лейкоцитоза, связанного с выбросом глюкокортикостико-идов в кровь и развитием второй стадии стрессовой реакции - резистентности (адаптации) в организме. В данном случае это объясняет происхождение лейкоцитоза и указывает, что антибиотикотерапия является стресс-фактором для организма рыб. Антибиотики являются одной из главных причин нейтропении и агранулоцитоза (увеличение количество моноцитов и лимфоцитов). Из литературных источников известно, что антибиотики оказывают ингибирующий эффект на нейтрофилы, что связано с изменением структуры антибактериальных препаратов вследствие метаболических процессов в организме, в результате чего продукты метаболизма становятся токсичными для самих фагоцитов. У гибрида СО х К, получавших антибиотик, мы отметили увеличение эозинофилов. Вероятно, эти клетки реагируют на антибиотикотерапию. С учетом их основной функции в организме -ответ на аллергическую реакцию, увеличение числа эозинофилов в периферическом русле можно отнести к прямым маркерам реакции гиперчувствительности осетровых. Рассчитанный лейкоцитарный индекс интоксикации позволил дать оценку реактивности организма рыб на антибиотикотерапию. Отмечено его снижение у рыб опытных групп: у карпа - в 2,75 раза, у гибрида СО х К - в 1,95 раз относительно контрольных групп. Наибольшие колебания ЛИИ проявились у карпа, что указывает на более выраженную степень интоксикации организма этого вида рыб. Таким образом, с учетом максимального 7-дневного применения высоких доз антибиотиков картина крови характерна для начальной стадии стресс-реакции организма, при которой мобилизуются защитные механизмы (увеличение количества лейкоцитов). На фоне проявления лейкоцитоза, нейтропении и лимфоцитоза у осетровых рыб выявлена эозинофилия, что является видоспецифическим маркером осетровых на антибиотикотерапию. Для коррекции иммуно-физиологического состояния после антибиотикотерапии целесообразно проводить курс кормления с пробиотическим препаратом [9, 11].

Список литературы:

1. Алмазов, В. А. Физиология лейкоцитов человека / В. А. Алмазов, Б. В. Афанасьев, А. Ю. Зарицкий // Наука. 1979. 230 с.

2. Иванова, Н. Т. Атлас клеток крови рыб / Н. Т. Иванова // 1983. 184 с.

3. Интерпретация лабораторных данных (справочное пособие) / Н. М. Батырханова, Г. К. Прмагамбетов, К. Б. Иманбекова [и др.] // КазМУНО. 2010. 40 с.

4. Методические указания по проведению гематологического обследования рыб // Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб. 1999. С. 69-97.

5. Портнягина, Е. В. Рациональная антибактериальная терапия и вопросы предупреждения бактериальной резистентности: учебное пособие / Е. В. Порт-нягина, Г. Г. Раднаев // ИГМУ. 2022. 135 с.

6. Применение препаратов «Левофлоксацин» и «СУБ-ПРО» при терапии бактериальной геморрагической септицемии у карповых рыб / Н. Н. Романова, Л. Н. Юхименко, В. В. Вараксина [и др.] // Труды ВНИРО. 2022. Т. 190. С. 116-124.

7. Провоторов, В. М. Роль и место эритроцитов в системе направленного транспорта различных фармакологических средств / В. М. Провоторов, Г. А. Иванова // Клиническая медицина. 2009. № 9. С. 4-8.

8. Особенности распределения цефтриаксона в организме теплокровных животных / А. А. Безъязычная, В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая [и др.] // Фармация. 2020. № 6. С. 51-56.

9. Оценка влияния пробиотика СУБ-ПРО на имунно-физиологический статус рыб/ Н. Н. Романова, П. П. Головин, Л. Н. Юхименко [и др.] // Современные проблемы ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии : мат. науч.-практ. конф. ЗооВетКнига. 2020. С. 142-148.

10. Хем, А. Гистология / А. Хем, Д. Кормак // Мир. 1983. 254 с.

11. Gilliland B.C. Drug-induced autoimmune and hematologic disorders // Immunol Allergy Clin North Am. 1991. No. 11. Рр. 525-553.

12. https://fish.gov.ru/news/2023/05/04/za-i-kvartal-2023-goda-proizvodstvo-tovarnoj-akvakultury-vyroslo-na-156-do-1814-tys-tonn/

13. https://www.vidal.ru/drugs/levofloxacin__29985

14. https://www.megamix.ru/products/aviculture/kormovye-antibiotiki-vetpreparaty/khlortetratsiklin/

Резюме. Представлены изменения показателей крови после антибиотико-терапии, проведенной у молоди карпа и гибрида сибирского осетра х калуги. Выявлен ряд показателей эритроцитарной картины, которые являются неспецифическими маркерами, в связи с тем, что после курса применения антибиотиков у карпа и гибрида сибирского осетра х калуги изменения в крови различно и даже противоположно, что указывает на видовую ответную реакцию. Лейкоцитарная картина крови показывает аналогичные изменения как у карпа, так и у гибрида сибирского осетра х калуги. Общее количество лейкоцитов возрастает почти на 40%, что является проявлением стрессового лейкоцитоза, связанного с выбросом глюкокортикостикоидов в кровь и развитием второй стадии стрессовой реакции - резистентности (адаптации) в организме. У рыб, получавших антибиотики, отмечали нейтропению и агранулоцитоз, сопровождающиеся увеличением количества моноцитов и лимфоцитов. Кроме того, у гибрида сибирского осетра х калуги увеличивается количество эозинофилов, что может служить маркером для осетровых рыб на реакцию гиперчувствительности к антибиотикам. Для оценки реактивности организма на антибиотикотерапию рассчитали лейкоцитарный индекс интоксикации, который после курса применения антибиотиков у рыб опытных групп снижается: у карпа - в 2,75 раза, у гибрида сибирского осетра х калуги - в 1,95 раз относительно контрольных групп. Наибольшие колебания лейкоцитарного индекса интоксикации проявляются у карпа, что соответствует более выраженной степени интоксикации организма после антибиотикотерапии. Для коррекции иммуно-физиологического статуса рыб после антибиотикотерапии целесообразно проводить курс кормления с пробиотическим препаратом.

Ключевые слова: рыбоводство, антибиотикотерапия, карп, осетровые, гибрид сибирского осетра х калуги, иммуно-физиологический статус, кровь, гематология, показатели крови, лейкоцитарная картина крови.

Сведения об авторах:

Романова Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, доцент, заведующая лабораторией ихтиопатологии филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» («ВНИИПРХ»); 141821, Московская область, Дмитровский г.о., п. Рыбное, 40 а; тел.: 8-495-1086856; e-mail: romanova_nn@vniiprh.ru.

Сехина Ольга Васильевна, специалист лаборатории ихтиопатологии филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» («ВНИИ-ПРХ»); 141821, Московская область, Дмитровский г.о., п. Рыбное, 40 а; тел.: 8-495-1086856; e-mail: sekhina_ov@vniiprh.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Вишторская Антонина Александровна, специалист лаборатории ихтиопатологии филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» («ВНИИПРХ»); 141821, Московская область, Дмитровский г.о., п. Рыбное, 40 а; тел.: 8-495-1086856; e-mail: vishtorskaya_aa@vniiprh.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей