УДК 619:616.15:639.2.09:615.33
DOI 10.33861/2071-8020-2023-5-46-48
Романова Н. Н., Сехина О. В., Вишторская А. А. Филиал по пресноводному рыбному хозяйству Федерального государственного
бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»
Федерального агентства по рыболовству, Московская область
Объемы воспроизводства ценных видов рыб и производства продукции товарной аквакультуры в России в последние годы резко выросли [12]. Интенсификация технологических процессов неизбежно приводит к возникновению напряженной эпизоотической ситуации на рыбоводных предприятиях. Высокие плотности посадки, хендлинг, несоответствующее качество воды снижают иммуно-физиологический статус рыб, и на фоне ослабления иммунной системы рыбы часто болеют и в основном бактериальными инфекциями, которые развиваются при контаминации органов бактериальной микрофлорой, которая находится в воде. Если вовремя не провести лечение, то могут быть большие потери рыбопосадочного материала и рыбной продукции.
При развитии бактериальных инфекций у рыб применение антибактериальных препаратов позволяет приостановить развивающийся патологический процесс и вспышку заболевания. С другой стороны, частое применение антибиотиков формирует у бактерий резистентность (устойчивость), что в дальнейшим приводит к тому, что они становятся неэффективными для лечения [5]. В связи с этим поиск новых эффективных антибиотиков для использования в животноводстве, в том числе в аквакультуре, является актуальным направлением ветеринарии.
Другой сложностью разработки терапии является то, что бактериальные инфекции у рыб чаще всего вызывают разные виды бактерий и, в связи с этим, возникает сложность подбора эффективного антибиотика для лечения, который бы действовал на весь спектр возбудителей. В последние годы в медицине и ветеринарии для лечения бактериозов используют комбинированный метод, заключающий в применении двух разных антибиотиков одновременно. Это направление начинают поддерживать и практики-рыбоводы для разработки эффективных схем лечения бактериальных инфекций рыб.
С другой стороны, антибиотикотерапия является дополнительным стресс-фактором на организм рыб, снижающим общую резистентность и может привести к нежелательным побочным эффектам.
Для осуществления рационального применения антибиотиков необходимы сведения о возможном влиянии на рыб применяемых лекарственных препаратов. Информации по этому вопросу очень мало, в основном изучали токсичность антибиотиков на организм теплокровных животных [7, 8].
В основе воздействия антибиотиков лежит подавление и уничтожение не только патогенной, но и полезной микрофлоры, что приводит к дисбактериозу и снижению иммунитета. Оценка действия антибиотиков на организм рыб и выявление изменений в крови является достаточно информационной. Кровь является лабильной тканью, ее количественные показатели чувствительны к изменениям, происходящим в организме, и отражают его ответную реакцию.
Цель исследования - оценить влияние антибиотикотерапии на иммуно-физиологический статус рыб.
Материалы и методы исследований. Экспериментальные работы проводили на годовиках карпа (ср. масса 30 г) и гибридах сибирского осетра х калуги (далее, СО х К) («29,7 г).
Во время проведения эксперимента температура воды в аквариумах с опытной и контрольной рыбой составляла 18,0-21,0°C, содержание растворенного кислорода - 6,9-8,1 мг/л. Для кормления использовали экструдированные продукционные корма. Суточная норма кормления составила «1% от массы рыбы.
Были сформированы 2 группы рыб (контрольная и опытная) по 15 экземпляров в каждой. Для рыб опытной группы в комбикорм одновременно вводили 2 антибиотика: «Левофлоксацин» и «Хлорте-трациклин» в дозировках 1000 мг/кг и 200 мг/кг ихтиомассы. Эти антибиотики являются новыми для терапии бактериальных инфекций у рыб, первые положительные результаты по оценки эффективности были получены при выполнении научно-исследовательской работы по разработке новых методов профилактики и лечения болезней объектов аквакультуры [6]. Курс кормления составил 7 суток (традиционная длительность курса антибиотикотерапии). Опыты проводили по аналогии у карпа и гибрида СО х К.
Левофлоксацин относится к антибиотикам широкого спектра действия из группы фторхинолонов. Активно действующим веществом является офлоксацин. Препарат активен в отношении большинства штаммов микроорганизмов [13].
Хлортетрациклин - антибиотик широкого спектра действия из тетрациклинового ряда. Он подавляет рост и развитие многих грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов [14].
Для оценки влияния антибиотиков на организм рыб проводили гематологический анализ. Кровь отбирали из хвостовой артерии пастеровской пипеткой. Анализ проведен согласно Методическим указаниям по проведению гематологического обследования рыб [4]. Определяли следующие гематологические показатели:
Идентификацию форменных элементов крови проводили по общепринятой классификации [2].
Для оценки реактивности организма рыб на антибиотикотера-пию рассчитывали лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ) - показатель, характеризующий степень эндогенной интоксикации. Расчет проводили по формуле Кальф-Калифа на основании полученных данных при анализе микроскопии лейкоцитарной формулы.
Лейкоцитарный индекс интоксикации Кальф - Калифа [1]:
где М - миелоциты; Плазм.кл. - плазматические клетки; Ю - юные; Мц - моноциты; П - палочкоядерные; Лц - лимфоциты; Сегм. - сегментоядерные; Эоз. - эозинофилы [3].
Статистическая обработка материала проведена с помощью программы Microsoft Excel.
Результаты исследований и их обсуждение. После 7-дневного курса антибиотикотерапии внешних изменений у опытных рыб (как у карпа, так и гибрида СО х К) не выявлено, поведение их не отличалось от рыб контрольных групп.
Результаты гематологического анализа карпа приведены в таблице 1. Достоверно значимых различий в эритроцитарной картине между контрольной и опытной группами не выявили. Но хотелось бы отметить, что у рыб, получавших антибиотик, содержания гемоглобина было немного выше (на 7,5%), чем у рыб контрольной группы, что, вероятно, связано с тем, что в крови больше зрелых форм эритроцитов, оснащенность их гемоглобином выше. При анализе эритроцитарной картины у опытных рыб отмечен более низкий уровень эритропоэза (количество молодых эритроцитов на 22,7% меньше).
Таблица 1 Показатели крови карпа после применения антибиотиков
| Наименование показателя | Контроль | Опыт |
|---|---|---|
| Гемоглобин, г/л | 98,38±16,91 | 105,80±10,60 |
| Эритроциты, тыс./мкл | 1 092,00±106,33 | 1 070,00±138,40 |
| Содержание гемоглобина в эритроците (СГЭ), пг | 89,69±11,71 | 100,57±18,16 |
| Эритропоэз (всего молодых эритроцитов), % | 7,76±1,40 | 6,00±2,20 |
| Лейкоциты, тыс./мкл | 50,43±33,49 | 70,21±18,75* |
| Лейкоцитарная формула | ||
| Миелоциты нейтрофильные, % | 0,86±0,70 | 0,22±0,12 |
| Метамиелоциты нейтрофильные, % | 2,40±1,21 | 1,22±1,00 |
| Палочкоядерные нейтрофилы, % | 3,86±2,27 | 1,44±1,02 |
| Сегментоядерные нейтрофилы, % | 2,43±1,90 | 1,22±0,90 |
| Общее число нейтрофилов, % | 9,29±3,55 | 4,14±1,95* |
| Базофилы, % | 1,60±0,55 | 2,00±1,87 |
| Моноциты, % | 2,57±1,13 | 2,44±2,13 |
| Лимфоциты, % | 85,29±6,02 | 91,56±3,57* |
| Абсолютные значения лейкоцитов | ||
| Миелоциты нейтрофильные, тыс./мкл | 0,65±0,50 | 0,22±0,19 |
| Метамиелоциты нейтрофильные, тыс./мкл | 1,40±1,27 | 0,82±0,79 |
| Палочкоядерные нейтрофилы, тыс./мкл | 2,36±1,80 | 1,07±1,01 |
| Сегментоядерные нейтрофилы, тыс./мкл | 1,08±0,81 | 0,79±0,60 |
| Общее число нейтрофилов, тыс./мкл | 4,87±1,43 | 2,71±1,05* |
| Базофилы, тыс./мкл | 1,02±0,74 | 1,11±0,69 |
| Моноциты, тыс./мкл | 1,2±0,35 | 1,67±1,05 |
| Лимфоциты, тыс./мкл | 44,10±10,72 | 62,94±9,71* |
Примечание: *- различия достоверны относительно контрольной группы
После курса антибиотикотерапии общее количество лейкоцитов на 40% выше, чем у рыб из контрольной группы, что характеризует высокую резистентность организма.
В лейкоцитарной картине у карпа опытной группы выявлены нейтропения (абсолютное количество нейтрофилов снижено на 44%) и лимфоцитоз (количество лимфоцитов увеличено на 43%).
У гибридов СО х К, получавших антибиотик, изменения в эритроцитарной картине были обратные тем, которые были у карпа. Вероятно, это можно объяснить видовой специфичностью рыб. Механизм ответной реакции организма на антибиотикотерапию в эритроцитарной картине развивался иначе. Уровень гемоглобина у рыб в опытной группе значительно снижен (на 32%) по сравнению с контролем, но при этом общее количество эритроцитов оказалось выше (на 30%), а число молодых эритроцитов ниже на 45% (табл. 2). При этом достоверно значимых различий между контрольной и опытной группами не выявлено, что свидетельствует о неспецифической ответной реакции эритроцитарной картины на воздействие антибиотиков.
В лейкоцитарной картине у гибрида СО х К изменения были идентичные как у карпа, но менее выраженные. Следовательно, специфической ответной реакцией на антибиотикотерапию являются именно лейкоцитарные показатели.
Выявили достоверное увеличение общего количества лейкоцитов на 40% у рыб, получавших в рационе антибиотики. В лейкоформу-ле снизилась доля нейтрофилов (на 17% относительно контрольной группы рыб), но изменения были не такими значимыми, как у карпа, статистической достоверности не обнаружено и пересчет в абсолютные значения не показал снижения количества этих клеток к крови у опытной группы рыб (табл. 2). У гибрида СО х К отреагировали на антибиотикотерапию гранулоциты - эозинофилы - форменные элементы в цитоплазме с ярко-оранжевого цвета гранулами (рисунок 1).
Рис.1. Эозинофил в крови гибрида сибирского осетра х калуги
Они характерны для костно-хрящевых рыб, к которым и относятся осетровые. У карпа мы их не наблюдали, что связано с редкой встречаемостью их в периферической крови карповых рыб. Известно, что фагоцитарная активность их ниже, чем у моноцитов и нейтрофилов [10], а хемотаксис связан с веществами, возникающими при аллергизации [1].
Эозинофилы млекопитающих способны аккумулировать гистамин в тканях при аллергических реакциях и воспалении, возможно, что это явление характерно и для эозинофилов пойки-лотермных животных - рыб. Доля эозинофилов у гибридов осетровых рыб, получавших в рационе антибиотики, была почти в 2 раза выше, чем у контрольных рыб, а при пересчете в абсолютные значения их количество даже в 3 раза выше (табл. 2).
Таблица 2 Показатели крови гибрида сибирского осетра х калуги (СО х К) после применения максимальной дозы антибиотиков при комбинированном действии (эксперимент на токсичность антибиотиков)
| Наименование показателя | Контроль | Опыт (токсичность антибиотиков) |
|---|---|---|
| Гемоглобин, г/л | 68,83±13,79 | 46,63±6,35 |
| Эритроциты, тыс./мкл | 420,00±74,45 | 547,50±72,85 |
| Содержание гемоглобина в эритроците (СГЭ), пг | 158,69±36,93 | 82,58±9,51 |
| Эритропоэз (всего молодых эритроцитов), % | 18,34±5,81 | 10,08±2,92 |
| Лейкоциты, тыс./мкл | 38,27±15,31 | 53,79±12,62* |
| Лейкоцитарная формула | ||
| Миелоциты нейтрофильные, % | 0,63±0,50 | 0,17±0,09 |
| Метамиелоциты нейтрофильные, % | 3,25±2,43 | 3,50±1,87 |
| Палочкоядерные нейтрофилы, % | 12,38±3,54 | 9,00±5,87 |
| Сегментоядерные нейтрофилы, % | 10,25±3,15 | 9,75±1,50 |
| Общее число нейтрофилов, % | 26,50±4,41 | 22,00±5,89 |
| Эозинофилы, % | 8,25±0,96 | 16,00±5,72* |
| Моноциты, % | 1,38±0,74 | 2,00±1,79 |
| Лимфоциты, % | 63,88±5,59 | 56,83±12,32 |
| Абсолютные значения лейкоцитов | ||
| Миелоциты нейтрофильные, тыс./мкл | 0,26±0,19 | 0,09±0,06 |
| Метамиелоциты нейтрофильные, тыс./мкл | 1,43±1,18 | 1,80±0,91 |
| Палочкоядерные нейтрофилы, тыс./мкл | 5,09±3,30 | 5,17±3,91 |
| Сегментоядерные нейтрофилы, тыс./мкл | 3,60±1,04 | 5,17±2,13 |
| Общее число нейтрофилов, тыс./мкл | 10,75±5,66 | 11,67±5,21 |
| Эозинофилы, тыс./мкл | 2,80±1,67 | 8,62±1,79* |
| Моноциты, тыс./мкл | 0,51±0,28 | 0,84±0,48 |
| Лимфоциты, тыс./мкл | 24,58±10,78 | 30,14±9,05 |
Примечание: *- различия достоверны относительно контрольной группы
Для оценки реактивности организма рыб на антибиотикоте-рапию рассчитали ЛИИ. Выявили у опытных групп рыб снижение ЛИИ: у карпа - в 2,75 раза, у гибрида осетра - в 1,95 раз относительно контрольных групп (рисунок 2). Более значимые колебания ЛИИ отмечены у карпа, что соответствует более выраженной степени интоксикации в организме после антибиотикотерапии.
Рис. 2. Лейкоцитарный индекс интоксикации у карпа и гибрида сибирского осетра
Заключение. Проведена экспериментальная работа по оценке воздействия антибиотикотерапии на показатели крови карпа и гибрида сибирского осетра х кулуги. Было выявлено, что показатели эритроцитарной картины являются неспецифическими маркерами, происходящие изменения характеризуют видовую ответную реакцию организма. Статистически достоверные изменения отмечали в лейкоцитарной картине. У рыб, получавших антибиотик, резко увеличивается количество лейкоцитов, что указывает на проявление стрессового лейкоцитоза, связанного с выбросом глюкокортикостико-идов в кровь и развитием второй стадии стрессовой реакции - резистентности (адаптации) в организме. В данном случае это объясняет происхождение лейкоцитоза и указывает, что антибиотикотерапия является стресс-фактором для организма рыб. Антибиотики являются одной из главных причин нейтропении и агранулоцитоза (увеличение количество моноцитов и лимфоцитов). Из литературных источников известно, что антибиотики оказывают ингибирующий эффект на нейтрофилы, что связано с изменением структуры антибактериальных препаратов вследствие метаболических процессов в организме, в результате чего продукты метаболизма становятся токсичными для самих фагоцитов. У гибрида СО х К, получавших антибиотик, мы отметили увеличение эозинофилов. Вероятно, эти клетки реагируют на антибиотикотерапию. С учетом их основной функции в организме -ответ на аллергическую реакцию, увеличение числа эозинофилов в периферическом русле можно отнести к прямым маркерам реакции гиперчувствительности осетровых. Рассчитанный лейкоцитарный индекс интоксикации позволил дать оценку реактивности организма рыб на антибиотикотерапию. Отмечено его снижение у рыб опытных групп: у карпа - в 2,75 раза, у гибрида СО х К - в 1,95 раз относительно контрольных групп. Наибольшие колебания ЛИИ проявились у карпа, что указывает на более выраженную степень интоксикации организма этого вида рыб. Таким образом, с учетом максимального 7-дневного применения высоких доз антибиотиков картина крови характерна для начальной стадии стресс-реакции организма, при которой мобилизуются защитные механизмы (увеличение количества лейкоцитов). На фоне проявления лейкоцитоза, нейтропении и лимфоцитоза у осетровых рыб выявлена эозинофилия, что является видоспецифическим маркером осетровых на антибиотикотерапию. Для коррекции иммуно-физиологического состояния после антибиотикотерапии целесообразно проводить курс кормления с пробиотическим препаратом [9, 11].
Список литературы:
1. Алмазов, В. А. Физиология лейкоцитов человека / В. А. Алмазов, Б. В. Афанасьев, А. Ю. Зарицкий // Наука. 1979. 230 с.
2. Иванова, Н. Т. Атлас клеток крови рыб / Н. Т. Иванова // 1983. 184 с.
3. Интерпретация лабораторных данных (справочное пособие) / Н. М. Батырханова, Г. К. Прмагамбетов, К. Б. Иманбекова [и др.] // КазМУНО. 2010. 40 с.
4. Методические указания по проведению гематологического обследования рыб // Сборник инструкций по борьбе с болезнями рыб. 1999. С. 69-97.
5. Портнягина, Е. В. Рациональная антибактериальная терапия и вопросы предупреждения бактериальной резистентности: учебное пособие / Е. В. Порт-нягина, Г. Г. Раднаев // ИГМУ. 2022. 135 с.
6. Применение препаратов «Левофлоксацин» и «СУБ-ПРО» при терапии бактериальной геморрагической септицемии у карповых рыб / Н. Н. Романова, Л. Н. Юхименко, В. В. Вараксина [и др.] // Труды ВНИРО. 2022. Т. 190. С. 116-124.
7. Провоторов, В. М. Роль и место эритроцитов в системе направленного транспорта различных фармакологических средств / В. М. Провоторов, Г. А. Иванова // Клиническая медицина. 2009. № 9. С. 4-8.
8. Особенности распределения цефтриаксона в организме теплокровных животных / А. А. Безъязычная, В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая [и др.] // Фармация. 2020. № 6. С. 51-56.
9. Оценка влияния пробиотика СУБ-ПРО на имунно-физиологический статус рыб/ Н. Н. Романова, П. П. Головин, Л. Н. Юхименко [и др.] // Современные проблемы ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии : мат. науч.-практ. конф. ЗооВетКнига. 2020. С. 142-148.
10. Хем, А. Гистология / А. Хем, Д. Кормак // Мир. 1983. 254 с.
11. Gilliland B.C. Drug-induced autoimmune and hematologic disorders // Immunol Allergy Clin North Am. 1991. No. 11. Рр. 525-553.
13. https://www.vidal.ru/drugs/levofloxacin__29985
14. https://www.megamix.ru/products/aviculture/kormovye-antibiotiki-vetpreparaty/khlortetratsiklin/
Резюме. Представлены изменения показателей крови после антибиотико-терапии, проведенной у молоди карпа и гибрида сибирского осетра х калуги. Выявлен ряд показателей эритроцитарной картины, которые являются неспецифическими маркерами, в связи с тем, что после курса применения антибиотиков у карпа и гибрида сибирского осетра х калуги изменения в крови различно и даже противоположно, что указывает на видовую ответную реакцию. Лейкоцитарная картина крови показывает аналогичные изменения как у карпа, так и у гибрида сибирского осетра х калуги. Общее количество лейкоцитов возрастает почти на 40%, что является проявлением стрессового лейкоцитоза, связанного с выбросом глюкокортикостикоидов в кровь и развитием второй стадии стрессовой реакции - резистентности (адаптации) в организме. У рыб, получавших антибиотики, отмечали нейтропению и агранулоцитоз, сопровождающиеся увеличением количества моноцитов и лимфоцитов. Кроме того, у гибрида сибирского осетра х калуги увеличивается количество эозинофилов, что может служить маркером для осетровых рыб на реакцию гиперчувствительности к антибиотикам. Для оценки реактивности организма на антибиотикотерапию рассчитали лейкоцитарный индекс интоксикации, который после курса применения антибиотиков у рыб опытных групп снижается: у карпа - в 2,75 раза, у гибрида сибирского осетра х калуги - в 1,95 раз относительно контрольных групп. Наибольшие колебания лейкоцитарного индекса интоксикации проявляются у карпа, что соответствует более выраженной степени интоксикации организма после антибиотикотерапии. Для коррекции иммуно-физиологического статуса рыб после антибиотикотерапии целесообразно проводить курс кормления с пробиотическим препаратом.
Ключевые слова: рыбоводство, антибиотикотерапия, карп, осетровые, гибрид сибирского осетра х калуги, иммуно-физиологический статус, кровь, гематология, показатели крови, лейкоцитарная картина крови.
Сведения об авторах:
Романова Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, доцент, заведующая лабораторией ихтиопатологии филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» («ВНИИПРХ»); 141821, Московская область, Дмитровский г.о., п. Рыбное, 40 а; тел.: 8-495-1086856; e-mail: romanova_nn@vniiprh.ru.
Сехина Ольга Васильевна, специалист лаборатории ихтиопатологии филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» («ВНИИ-ПРХ»); 141821, Московская область, Дмитровский г.о., п. Рыбное, 40 а; тел.: 8-495-1086856; e-mail: sekhina_ov@vniiprh.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Вишторская Антонина Александровна, специалист лаборатории ихтиопатологии филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «ВНИРО» («ВНИИПРХ»); 141821, Московская область, Дмитровский г.о., п. Рыбное, 40 а; тел.: 8-495-1086856; e-mail: vishtorskaya_aa@vniiprh.ru.
http://vetkuban.com/num5_202313.html