Скрининг новых антипротозойных средств - определение терапевтической эффективности при эймериозах

УДК 619:616.993.192
DOI 10.33861/2071-8020-2022-4-24-27

Клименко А.И. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный Ростовский
аграрный научный центр», Ростовская область, п. Рассвет
Чекрышева В.В., Зубенко А.А., Фетисов Л.Н., Кононенко К.Н., Святогорова А.Е. Северо-Кавказский зональный
научноисследовательский ветеринарный институт - филиал Федерального государственного
бюджетного научного учреждения «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»,
Ростовская область, г. Новочеркасск

Протозойные заболевания животных и птицы занимают значительную долю среди всех паразитарных болезней. Особо заметный ущерб наносят заболевания, вызываемые споровиками. При эймериозах (кокцидиозах) в отсутствие лечебнопрофилактических мер происходит массовая гибель молодняка. У цыплят и кроликов она достигает 80-100%. Лечение при этом заболевании направлено на подавление эндогенных стадий эймерий, то есть мерозоитов и шизонтов. К сожалению, антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны утратили свою антикокцидийную активность ещё в 80-х годах прошлого века. Причиной этому стала развившаяся у эймерий лекарственная устойчивость. В научной литературе можно найти многочисленные примеры попыток преодоления этой проблемы. Так, например, Ju Liu и др. (2022) [7], Assia Belhassan., Fatima En-nahli., (2020) [6], Ling Li., Sijie Yuan., Lin Lin (2022) [8] представили в своих статьях результаты изучения антипротозойной активности новых соединений в ряду хлоримидазолов. Снизить остроту проблемы распространения лекарственной устойчивости у паразитов сможет новое направление создания препаратов. Таким направлением синтеза и скрининга, по нашему мнению, станут соединения неантибиотического происхождения.

Исследованиями, проведенными в 2021-2022 годах, было установлено, что среди синтезированных нами органических веществ ряда бензимидазола, имидазола и других азотистых гетероциклических и алифатических веществ обнаружены соединения с антипротозойной активностью. Синтез соединений осуществляли с использованием как известных методов синтеза органических соединений, описанных в многочисленных руководствах, так и с применением разработанных нами методов, изложенных в описании к нашим патентам РФ № 2394824 [4] и РФ № 2477129 [5], в наших статьях и тезисах [1, 2, 3].

Цель настоящего исследования - синтез и скрининг веществ с высоким уровнем протистоцидной активности для применения их в качестве терапевтических субстанций при протозойных заболеваниях животных и птицы.

Материалы и методы исследований. Синтезировано свыше 200 новых органических соединений ряда бензтиофена, хиноксалина, галогенсодержащих имидазольных систем, производных пиридина и нитропиридина, а также других азотистых гетероциклических соединений. Установлена высокая антибактериальная и протистоцидная активность свыше 30 соединений с минимальными ингибирующими концентрациями 62,5-0,24 мкг/мл.

Так, производные нитропиридина: 2-(5-нитро-пиридинил-2-сульфо-нил)-1Н-бензимидазола и 2-(5-нитро-пиридинил-2-сульфонилметил)-1Н-бензимидазола обладают протистоцидной активностью на уровне 0,4 мкг/мл и 1,9 мкг/мл, соответственно. На эти соединения получен патент на изобретение № 27111098.

В ряду производных бензтиофена (15 соединений) протистоцидная активность высокого уровня (31,2-7,8 мкг/мл) установлена у трёх веществ; среднего уровня (125-62,5 мкг/мл) - у пяти веществ. Наивысшую антипротозойную активность показало производное азабензтио-фена.

Среди синтезированных нами галогенированных производных имидазольных систем (17 соединений) выявлены 55,5% веществ, обладающих средним и высоким уровнем протистоцидной активности. Алкилирование по атому азота приводит к усилению активности. Два соединения этого ряда обладают высокой активностью (15,6-0,48 мкг/мл), что в десятки раз выше, чем активность препаратов сравнения хлорохина и толтразурила. Восемь веществ обладают активностью (62,5-31,25 мкг/мл) выше среднего уровня. Соединение («ХБ-1») 2-имино-1-(В-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбнзил) бензимидазолин в виде гидробромида обладает наивысшей протистоцидной активностью в этой группе веществ - 0,24 мкг/мл.

Среди дитиокислот и тиоамидов ряда бензимидазола (13 соединений) обнаружено шесть веществ с высоким и средним уровнем антипротозойной активности. Дитиокислоты (2 соединения) обладают высокой протистоцидной активностью, превышающей активность препарата сравнения толтразурила в 4-8 раз. Тиоамиды бензимидазола (4 соединения) продемонстрировали средний уровень активности, который составлял 31,25-62,5 мкг/мл, то есть был равным или превышал в 2 раза уровень активности препарата сравнения толтразурила.

В ряду производных индазольных систем (14 соединений) установлено, что восемь веществ обладают высоким и средним уровнем активности в отношении простейших вида Colpoda steinii (реснитчатые) в условиях in vitro. Наилучшие результаты показали соединения, в которых аминогруппа является частью структуры мочевины (31,25 и 1,9 мкг/мл).

По совокупности полезных свойств (способу синтеза, протистоцид-ной активности и низкой токсичности) для дальнейших, углубленных исследований в том числе и терапевтической эффективности при кокцидиозах нами выбрано соединение 2-имино-1-(бета-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбензил) бензимидазолин в виде гидробромида. Условное название «ХБ-1».

Лечебно-профилактическую эффективность новых веществ, при эймериозе (кокцидиозе) кроликов изучали при спонтанной инвазии (E. media, E. magna, E. irresidua). Формировали опытные и контрольные группы, включая в каждую по 5 кроликов 21-45 дневного возраста. Диагноз на эймериоз ставили на основании клинических признаков (тимпания, чередующиеся запоры и диареи, отставание в росте) и результатов копрологических исследований. Соединение из ряда галогенированных производных имидазольных систем: 2-имино-1-(бета-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбензил) бензимидазолин в виде гидробромида («ХБ-1») давали внутрь в виде порошка в дозе 10-20 мг/кг массы тела; азотсодержащие алифатические соединения «726»-амид миристиновой кислоты, «735»-амид пальмитиновой кислоты и «738»-амид олеиновой кислоты давали в виде 0,01% водных растворов свободной выпойкой. Контрольные животные получали воду, либо в качестве препарата сравнения байкокс 5% (5% раствор толтразурила). Терапевтическую эффективность оценивали по сохранности животных, длительности заболевания и по результатам копрологических исследований.

Лечебно-профилактическую эффективность новых веществ, при экспериментальном кокцидиозе цыплят определяли по следующей методике. Для заражения животных использовали спорулированые ооцисты кокцидий видов Eimeria acervulin, Eimeria necatrix и Eimeria tenella. Материал содержал не менее 70% спорулированых ооцист. В 1 мл содержалось 65-75 тыс. ооцист, объем заражающей дозы составлял 0,8 мл, заражение осуществляли путем введения в зоб. Цыплята опытных групп (14-дневного возраста) за 12 часов до заражения начинали получать испытуемые препараты. Соединение из ряда галогенированных производных имидазольных систем «ХБ-1» давали птице внутрь в виде порошка в дозе 10-20 мг/кг массы тела; азотсодержащие алифатические соединения («726»-амид миристиновой кислоты, «735»-амид пальмитиновой кислоты, «738»-амид олеиновой кислоты), давали птице в виде 0,01% водных растворов свободной выпойкой. В каждую группу брали по 5-10 цыплят. Контрольные птицы получали воду. Терапевтическую эффективность оценивали по сохранности, длительности заболевания, приросту массы тела и интенсивности кокцидийной инвазии. Массу тела цыплят определяли перед заражением, на 7-й, 14-й и 21-й дни опытов.

Результаты исследований и их обсуждение. Терапевтическая эффективность препарата ХБ-1 и в сравнении с Байкоксом при эймериозе кроликов представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 Лечебная эффективность вещества «ХБ-1» при введении внутрь в дозе 20 мг/гол зараженным эймериозом кроликам

Группа	Препарат	№ животных	Количество ооцист в пробах фецес кроликов
			До опыта	После окончания введения препарата
Опытная	«ХБ-1»	1	75	2
		2	115	19
		3	175	0
		4	80	2
		5	180	0
Контрольная	Не вводили	1	200	Пал
		2	100	150
		3	75	120
		4	80	Пал
		5	117	120

Введение соединения «ХБ-1» в дозе 20 мг/гол с кормом в течение 7 дней приводит к резкому сокращению числа ооцист в фецес кроликов: от 75...180 до единиц или полного отсутствия. О положительном эффекте применения соединения «ХБ-1» говорило отсутствие падежа животных в группе, а также общее удовлетворительное состояние кроликов.

Таблица 2 Лечебно-профилактическая эффективность вещества «ХБ-1» в сравнении с Байкоксом при введении внутрь

№ группы	Препараты	Результаты по дням (количество живых кроликов)			Лечебно-профилактическая эффективность, %
		1-й день	10-й день	20-й день
1	«ХБ-1»	6	6	6	100.0
2	Байкокс 5%	6	4	1	16.6

К 20 дню в соскобах слизистой оболочки кишечника у павших кроликов контрольной группы, находили большое количество ооцист (до 50 в одном поле зрения микроскопа). В то же время в фекалиях кроликов опытной группы на 10-й и 20-й дни опыта находили лишь единичные цисты эймерий.

Результаты лечебно-профилактической эффективности новых веществ, при кокцидиозе цыплят представлены в таблицах 3 и 4 (опыт № 1), 5 (опыт № 2), 6 и 7 (опыт № 3).

Таблица 3 Лечебно-профилактическая эффективность новых соединений при экспериментальном кокцидиозе цыплят (опыт № 1)

№ группы	Препа­раты	Доза препарата	Результаты по дням опыта (количество выживших цыплят)			Эффектив­ность, %
			1-й день	10-й день	20-й день
1	«726»	0,01% водный раствор свободной выпойкой в течение 5 дней	8	8	8	100,0
2	«ХБ-1»	20 мг/кг в течение 5 дней	8	8	8	100,0
3	Конт­роль­ная	вода	8	8	7	87,50

Таблица 4 Прирост массы тела при определении лечебнопрофилактической активности веществ «726» и «ХБ-1» у цыплят, зараженных ооцистами кокцидий (опыт № 1)

№ группы	Препа­раты	Доза	Прирост массы тела цыплят, г
			1-й день	10-й день	20-й день
1	«726»	0,01% водный раствор свободной выпойкой	80	163,20	262,5
2	«ХБ-1»	20 мг/кг	80	128,50	213,4
3	Конт­роль­ная	вода	80	124,10	208,5

Заражение эймериозом произошло, но картина заболевания не проявилась в острой форме - в контрольной группе погиб лишь один цыпленок. Соединение «726» обладает защитным действием, которое проявилось в полной сохранности цыплят, в больших привесах, в более интенсивном развитии. Соединение «ХБ-1» также обладает профилактической активностью при кокцидиозе птиц, но менее активно влияет на рост и развитие цыплят. Прирост массы тела относительно контроля составил 25,9% для соединения «726» и 2,36% - для соединения «ХБ-1».

В таблице 5 показаны результаты изучения лечебно-профилактической активности водных растворов новых веществ, при экспериментальном кокцидиозе цыплят. Растворы начали давать за несколько часов, до заражения, затем давали ежедневно с питьевой водой в течение 10 дней.

Таблица 5 Лечебно-профилактическая эффективность вещества «ХБ-1» в сравнении с Байкоксом при введении внутрь

№ группы	Вещество	Концентрация водных растворов веществ, %	Количество ооцист в одном поле зрения
			В слепых кишках	В тонком кишечнике
1	«726»	0,01%	5	10
2	«735»	0,01%	2-5	0
3	«738»	0,01%	10	15
4	«753»	0,01%	100	50
5	«783»	0,01%	10	20
6	Контроль (вода)	-	>100	>100

Копрологические исследования показали, что наиболее высокой протистостатической активностью обладает водный раствор амида пальмитиновой кислоты («735»). Вещества «726», «738» и «783» также показали значительную активность.

При вскрытии на 10-й день характерные изменения в кишечнике обнаружили у цыплят, которые получали вещество «753» и у контрольных: геморрагии, слизь, неприятный запах, метеоризм, утолщение стенки слепых кишок

Таблица 6 Лечебно-профилактическая эффективность новых веществ, при экспериментальном кокцидиозе цыплят (опыт № 3)

№ групп	Вещество	Раствор, % доза мг/кг	Средняя масса одного цыпленка, г.
			1-й день	7-й день	14-й день
1	«735»	0.01%	126,25	138,0	154,57
2	«737»	0.01%	120,50	108,80	123,20
3	«738»	0.01%	125,25	137,0	145,50
4	«752»	0.01%	119,60	99,0	184,0
5	«783»	0.01%	122,60	96,4	83,0
6	«ХБ-1»	20 мг/кг	120,0	111,3	131,0
7	Контроль	вода	137,0	132,8	135,20

Таблица 7 Количество павших и выживших цыплят по дням (опыт №3)

Вещест­во	Дни опыта												Сохран­ность, %
	1	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15
«735»	0/8	0/8	0/8	1/7	1/7	1/7	1/7	1/7	1/7	1/7	1/7	2/6	75,0
«737»	0/8	0/8	1/7	1/7	3/5	3/5	3/5	3/5	3/5	3/5	3/5	3/5	37,50
«738»	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	100
«752»	0/8	0/8	0/8	4/4	4/4	4/4	4/4	7/1	7/1	7/1	7/1	7/1	12,50
«783»	0/8	0/8	2/6	2/6	4/4	4/4	4/4	6/2	6/2	6/2	6/2	7/1	12,5
«ХБ-1»	0/8	0/8	0/8	2/6	2/6	2/6	2/6	2/6	2/6	2/6	2/6	2/6	75,0
Конт­роль	0/8	0/8	1/7	1/7	3/5	3/5	4/4	5/3	5/3	5/3	6/2	6/2	25,0

Примечание: число погибших/ число выживших

На 5-6 дни после заражения отметили нарастание признаков болезни, появился кровавый понос у цыплят всех групп и падёж в некоторых группах. У погибших цыплят при вскрытии обнаруживали в слепых кишках скопления недавно свернувшейся крови, геморрагическое воспаление тонкого и толстого отделов кишечника. При микроскопии соскобов слизистой оболочки слепых кишок находили ооцисты кокцидий.

Профилактическое действие при экспериментальном кокцидиозе проявили вещества «735» и «ХБ-1», их активность составила по 75%. Профилактическая эффективность вещества «738» - амида олеиновой кислоты составила 100%. Клиническое проявление заболевания у цыплят этих групп прекращалось в течение 2-3 дней, а в других группах оно нарастало.

Выводы:

1. Соединение «ХБ-1» 2-имино-1-(бета-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорб нзил)бензимидазолин в виде гидробромида при эймериозе кроликов резко снижает число ооцист. Лечебно-профилактическая эффективность соединения «ХБ-1» при кокцидиозе кроликов достигала 100%, а байкокса - 16,6%.

2. При экспериментальном эймериозе цыплят лечебно-профилактическая активность установлена как у азотсодержащих алифатических соединений («726» - амид миристиновой кислоты, «735» - амид пальмитиновой кислоты, «738» - амид олеиновой кислоты), так и у галогенированного производного имидазольных систем «ХБ-1». Лечебно-профилактическая активность препаратов достигала 75-100%. В контрольных группах погибали до 75% цыплят.

Работа выполнена в рамках гос. задания 0710-2019-0044 и при поддержке РФФИ грант 20-03-00657/20

Список литературы:

1. Зубенко А.А., Фетисов Л.Н., Зубенко И.В., Саяпина Е.А. 1,2,4-[3,4-а]-фтала-зины: синтез, инсектицидная и фунгицидная активность// Материалы международной конфернции «Химия и биологическая активность синтетических и природных соединений». 2006. С. 216.

2. Зубенко А.А. Материалы Первой международной конференции «Химия и биологическая активность гетероциклов и алкалоидов»// 2002. Т. 2. С. 116.

3. Зубенко А.А. Тезисы IV международной конференции «Новые направления в химии гетероциклов»// 2010. С. 84-92.

4. Производные пиридо-[1,2-а]бензимидазола, обладающие антибактериальным действием, и способ их получения/ А.А. Зубенко, Л.Н. Фетисов, Л.Д. Попов// Патент № 2394824 С1. 2010.

5. Способ лечения кокцидиоза (эймериоза) сельскохозяйственных животных и птиц/ А.И. Клименко, А.А. Зубенко, Л.Н. Фетисов// Патент № 2477129 С1. 2013.

6. Belhassan Assia, Fatima En-nahli, Hanane Zaki et al. Assessment of effective imidazole derivatives against SARS-CoV-2 main protease through computational approach// Life Sciences. 2020. Vol. 262. 118469.

7. Liu Ju., Liu Fang, Li Zhen et al. Novel 4-phenoxypyridine derivatives bearing imidazole-4-carboxamide and 1,2,4-triazole-3-carboxamide moieties: Design, synthesis and biological evaluation as potent antitumor agents// Bioorganic Chemistry. 2022. Vol. 120. 105629.

8. Li Ling, Yuan Sijie, Chen Lin et al. Discovery of novel 2-aryl-4-bis-amide imidazoles (ABAI) as anti-inflammatory agents for the treatment of inflammatory bowel diseases (IBD)// Bioorganic Chemistry. 2022. Vol. 120. 105619.

Резюме. Проведенными в Северо-Кавказском зональном научно-исследовательском ветеринарном институте в 2021-2022 годах исследованиями было установлено, что среди синтезированных авторами органических веществ ряда бензимидазола, имидазола и других азотистых гетероциклических и алифатических веществ, обнаружены соединения с антипротозойной активностью. Синтез соединений осуществляли с использованием как известных методов синтеза органических соединений, описанных в многочисленных руководствах, так и с применением разработанных авторами методов. При эймериозах (кокцидиозах) в отсутствие лечебно-профилактических мер происходит массовая гибель молодняка. У цыплят и кроликов она достигает 80-100%. Лечение при этом заболевании направлено на подавление эндогенных стадий эймерий, то есть мерозоитов и шизонтов. К сожалению, антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны утратили свою антикокцидийную активность, причиной чему стала развившаяся у эймерий лекарственная устойчивость. По мнению авторов, снизить остроту проблемы распространения лекарственной устойчивости у паразитов сможет новое направление создания препаратов неантибиотического происхождения. Сотрудниками Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института синтезировано свыше 200 новых органических соединений ряда бензтиофена, хиноксалина, галогенсодержащих имидазольных систем, производных пиридина и нитропиридина, а также других азотистых гетероциклических соединений. Установлена высокая антибактериальная и протистоцидная активность свыше 30 соединений с минимальными ингибирующими концентрациями 62,5-0,24 мкг/мл. Одно из синтезированных веществ показало высокий терапевтический эффект при эйме-риозе кроликов.

Ключевые слова: сельскохозяйственные животные, сельскохозяйственная птица, эймериоз, мерозоит, шизонт, лекарственная устойчивость протистоцидная активность, антипротозойные препараты, производные нитропиридина, производные бензтиофена.

Сведения об авторах:

Клименко Александр Иванович, академик РАН, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, директор ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346735, Ростовская область, Аксайский район., п. Рассвет, ул. Институтская, 1; тел.: 8-928-6002785; e-mail: dzni@mail.ru.

Чекрышева Виктория Владимировна, кандидат ветеринарных наук, директор Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-918-5943886; e-mail: veterinar1987@mail.ru.

Зубенко Александр Александрович, доктор биологических наук, главный научный сотрудник творческого коллектива по химическому синтезу новых лекарственных соединений Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-928-6049743; e-mail: alexsandrzubenko@yandex.ru.

Фетисов Леонид Николаевич, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник творческого коллектива по химическому синтезу новых лекарственных соединений Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-908-1978224; e-mail: fetisoff.leonid2018@yandex.ru.

Кононенко Кристина Николаевна, научный сотрудник творческого коллектива по химическому синтезу новых лекарственных соединений Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-918-5943886; e-mail: velikayakrista@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Святогорова Александра Евгеньевна, младший научный сотрудник творческого коллектива по химическому синтезу новых лекарственных соединений Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-988-9525755; e-mail: sviatogorova.a@yandex.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей