УДК 619:616.993.192
DOI 10.33861/2071-8020-2022-4-24-27
Клименко А.И. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный Ростовский
аграрный научный центр», Ростовская область, п. Рассвет
Чекрышева В.В., Зубенко А.А., Фетисов Л.Н., Кононенко К.Н., Святогорова А.Е. Северо-Кавказский зональный
научноисследовательский ветеринарный институт - филиал Федерального государственного
бюджетного научного учреждения «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»,
Ростовская область, г. Новочеркасск
Протозойные заболевания животных и птицы занимают значительную долю среди всех паразитарных болезней. Особо заметный ущерб наносят заболевания, вызываемые споровиками. При эймериозах (кокцидиозах) в отсутствие лечебнопрофилактических мер происходит массовая гибель молодняка. У цыплят и кроликов она достигает 80-100%. Лечение при этом заболевании направлено на подавление эндогенных стадий эймерий, то есть мерозоитов и шизонтов. К сожалению, антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны утратили свою антикокцидийную активность ещё в 80-х годах прошлого века. Причиной этому стала развившаяся у эймерий лекарственная устойчивость. В научной литературе можно найти многочисленные примеры попыток преодоления этой проблемы. Так, например, Ju Liu и др. (2022) [7], Assia Belhassan., Fatima En-nahli., (2020) [6], Ling Li., Sijie Yuan., Lin Lin (2022) [8] представили в своих статьях результаты изучения антипротозойной активности новых соединений в ряду хлоримидазолов. Снизить остроту проблемы распространения лекарственной устойчивости у паразитов сможет новое направление создания препаратов. Таким направлением синтеза и скрининга, по нашему мнению, станут соединения неантибиотического происхождения.
Исследованиями, проведенными в 2021-2022 годах, было установлено, что среди синтезированных нами органических веществ ряда бензимидазола, имидазола и других азотистых гетероциклических и алифатических веществ обнаружены соединения с антипротозойной активностью. Синтез соединений осуществляли с использованием как известных методов синтеза органических соединений, описанных в многочисленных руководствах, так и с применением разработанных нами методов, изложенных в описании к нашим патентам РФ № 2394824 [4] и РФ № 2477129 [5], в наших статьях и тезисах [1, 2, 3].
Цель настоящего исследования - синтез и скрининг веществ с высоким уровнем протистоцидной активности для применения их в качестве терапевтических субстанций при протозойных заболеваниях животных и птицы.
Материалы и методы исследований. Синтезировано свыше 200 новых органических соединений ряда бензтиофена, хиноксалина, галогенсодержащих имидазольных систем, производных пиридина и нитропиридина, а также других азотистых гетероциклических соединений. Установлена высокая антибактериальная и протистоцидная активность свыше 30 соединений с минимальными ингибирующими концентрациями 62,5-0,24 мкг/мл.
Так, производные нитропиридина: 2-(5-нитро-пиридинил-2-сульфо-нил)-1Н-бензимидазола и 2-(5-нитро-пиридинил-2-сульфонилметил)-1Н-бензимидазола обладают протистоцидной активностью на уровне 0,4 мкг/мл и 1,9 мкг/мл, соответственно. На эти соединения получен патент на изобретение № 27111098.
В ряду производных бензтиофена (15 соединений) протистоцидная активность высокого уровня (31,2-7,8 мкг/мл) установлена у трёх веществ; среднего уровня (125-62,5 мкг/мл) - у пяти веществ. Наивысшую антипротозойную активность показало производное азабензтио-фена.
Среди синтезированных нами галогенированных производных имидазольных систем (17 соединений) выявлены 55,5% веществ, обладающих средним и высоким уровнем протистоцидной активности. Алкилирование по атому азота приводит к усилению активности. Два соединения этого ряда обладают высокой активностью (15,6-0,48 мкг/мл), что в десятки раз выше, чем активность препаратов сравнения хлорохина и толтразурила. Восемь веществ обладают активностью (62,5-31,25 мкг/мл) выше среднего уровня. Соединение («ХБ-1») 2-имино-1-(В-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбнзил) бензимидазолин в виде гидробромида обладает наивысшей протистоцидной активностью в этой группе веществ - 0,24 мкг/мл.
Среди дитиокислот и тиоамидов ряда бензимидазола (13 соединений) обнаружено шесть веществ с высоким и средним уровнем антипротозойной активности. Дитиокислоты (2 соединения) обладают высокой протистоцидной активностью, превышающей активность препарата сравнения толтразурила в 4-8 раз. Тиоамиды бензимидазола (4 соединения) продемонстрировали средний уровень активности, который составлял 31,25-62,5 мкг/мл, то есть был равным или превышал в 2 раза уровень активности препарата сравнения толтразурила.
В ряду производных индазольных систем (14 соединений) установлено, что восемь веществ обладают высоким и средним уровнем активности в отношении простейших вида Colpoda steinii (реснитчатые) в условиях in vitro. Наилучшие результаты показали соединения, в которых аминогруппа является частью структуры мочевины (31,25 и 1,9 мкг/мл).
По совокупности полезных свойств (способу синтеза, протистоцид-ной активности и низкой токсичности) для дальнейших, углубленных исследований в том числе и терапевтической эффективности при кокцидиозах нами выбрано соединение 2-имино-1-(бета-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбензил) бензимидазолин в виде гидробромида. Условное название «ХБ-1».
Лечебно-профилактическую эффективность новых веществ, при эймериозе (кокцидиозе) кроликов изучали при спонтанной инвазии (E. media, E. magna, E. irresidua). Формировали опытные и контрольные группы, включая в каждую по 5 кроликов 21-45 дневного возраста. Диагноз на эймериоз ставили на основании клинических признаков (тимпания, чередующиеся запоры и диареи, отставание в росте) и результатов копрологических исследований. Соединение из ряда галогенированных производных имидазольных систем: 2-имино-1-(бета-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорбензил) бензимидазолин в виде гидробромида («ХБ-1») давали внутрь в виде порошка в дозе 10-20 мг/кг массы тела; азотсодержащие алифатические соединения «726»-амид миристиновой кислоты, «735»-амид пальмитиновой кислоты и «738»-амид олеиновой кислоты давали в виде 0,01% водных растворов свободной выпойкой. Контрольные животные получали воду, либо в качестве препарата сравнения байкокс 5% (5% раствор толтразурила). Терапевтическую эффективность оценивали по сохранности животных, длительности заболевания и по результатам копрологических исследований.
Лечебно-профилактическую эффективность новых веществ, при экспериментальном кокцидиозе цыплят определяли по следующей методике. Для заражения животных использовали спорулированые ооцисты кокцидий видов Eimeria acervulin, Eimeria necatrix и Eimeria tenella. Материал содержал не менее 70% спорулированых ооцист. В 1 мл содержалось 65-75 тыс. ооцист, объем заражающей дозы составлял 0,8 мл, заражение осуществляли путем введения в зоб. Цыплята опытных групп (14-дневного возраста) за 12 часов до заражения начинали получать испытуемые препараты. Соединение из ряда галогенированных производных имидазольных систем «ХБ-1» давали птице внутрь в виде порошка в дозе 10-20 мг/кг массы тела; азотсодержащие алифатические соединения («726»-амид миристиновой кислоты, «735»-амид пальмитиновой кислоты, «738»-амид олеиновой кислоты), давали птице в виде 0,01% водных растворов свободной выпойкой. В каждую группу брали по 5-10 цыплят. Контрольные птицы получали воду. Терапевтическую эффективность оценивали по сохранности, длительности заболевания, приросту массы тела и интенсивности кокцидийной инвазии. Массу тела цыплят определяли перед заражением, на 7-й, 14-й и 21-й дни опытов.
Результаты исследований и их обсуждение. Терапевтическая эффективность препарата ХБ-1 и в сравнении с Байкоксом при эймериозе кроликов представлена в таблицах 1 и 2.
Таблица 1 Лечебная эффективность вещества «ХБ-1» при введении внутрь в дозе 20 мг/гол зараженным эймериозом кроликам
| Группа | Препарат | № животных | Количество ооцист в пробах фецес кроликов | |
|---|---|---|---|---|
| До опыта | После окончания введения препарата | |||
| Опытная | «ХБ-1» | 1 | 75 | 2 |
| 2 | 115 | 19 | ||
| 3 | 175 | 0 | ||
| 4 | 80 | 2 | ||
| 5 | 180 | 0 | ||
| Контрольная | Не вводили | 1 | 200 | Пал |
| 2 | 100 | 150 | ||
| 3 | 75 | 120 | ||
| 4 | 80 | Пал | ||
| 5 | 117 | 120 | ||
Введение соединения «ХБ-1» в дозе 20 мг/гол с кормом в течение 7 дней приводит к резкому сокращению числа ооцист в фецес кроликов: от 75...180 до единиц или полного отсутствия. О положительном эффекте применения соединения «ХБ-1» говорило отсутствие падежа животных в группе, а также общее удовлетворительное состояние кроликов.
Таблица 2 Лечебно-профилактическая эффективность вещества «ХБ-1» в сравнении с Байкоксом при введении внутрь
| № группы | Препараты | Результаты по дням (количество живых кроликов) | Лечебно-профилактическая эффективность, % | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 1-й день | 10-й день | 20-й день | |||
| 1 | «ХБ-1» | 6 | 6 | 6 | 100.0 |
| 2 | Байкокс 5% | 6 | 4 | 1 | 16.6 |
К 20 дню в соскобах слизистой оболочки кишечника у павших кроликов контрольной группы, находили большое количество ооцист (до 50 в одном поле зрения микроскопа). В то же время в фекалиях кроликов опытной группы на 10-й и 20-й дни опыта находили лишь единичные цисты эймерий.
Результаты лечебно-профилактической эффективности новых веществ, при кокцидиозе цыплят представлены в таблицах 3 и 4 (опыт № 1), 5 (опыт № 2), 6 и 7 (опыт № 3).
Таблица 3 Лечебно-профилактическая эффективность новых соединений при экспериментальном кокцидиозе цыплят (опыт № 1)
| № группы | Препараты | Доза препарата | Результаты по дням опыта (количество выживших цыплят) | Эффективность, % | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1-й день | 10-й день | 20-й день | ||||
| 1 | «726» | 0,01% водный раствор свободной выпойкой в течение 5 дней | 8 | 8 | 8 | 100,0 |
| 2 | «ХБ-1» | 20 мг/кг в течение 5 дней | 8 | 8 | 8 | 100,0 |
| 3 | Контрольная | вода | 8 | 8 | 7 | 87,50 |
Таблица 4 Прирост массы тела при определении лечебнопрофилактической активности веществ «726» и «ХБ-1» у цыплят, зараженных ооцистами кокцидий (опыт № 1)
| № группы | Препараты | Доза | Прирост массы тела цыплят, г | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 1-й день | 10-й день | 20-й день | |||
| 1 | «726» | 0,01% водный раствор свободной выпойкой | 80 | 163,20 | 262,5 |
| 2 | «ХБ-1» | 20 мг/кг | 80 | 128,50 | 213,4 |
| 3 | Контрольная | вода | 80 | 124,10 | 208,5 |
Заражение эймериозом произошло, но картина заболевания не проявилась в острой форме - в контрольной группе погиб лишь один цыпленок. Соединение «726» обладает защитным действием, которое проявилось в полной сохранности цыплят, в больших привесах, в более интенсивном развитии. Соединение «ХБ-1» также обладает профилактической активностью при кокцидиозе птиц, но менее активно влияет на рост и развитие цыплят. Прирост массы тела относительно контроля составил 25,9% для соединения «726» и 2,36% - для соединения «ХБ-1».
В таблице 5 показаны результаты изучения лечебно-профилактической активности водных растворов новых веществ, при экспериментальном кокцидиозе цыплят. Растворы начали давать за несколько часов, до заражения, затем давали ежедневно с питьевой водой в течение 10 дней.
Таблица 5 Лечебно-профилактическая эффективность вещества «ХБ-1» в сравнении с Байкоксом при введении внутрь
| № группы | Вещество | Концентрация водных растворов веществ, % | Количество ооцист в одном поле зрения | |
|---|---|---|---|---|
| В слепых кишках | В тонком кишечнике | |||
| 1 | «726» | 0,01% | 5 | 10 |
| 2 | «735» | 0,01% | 2-5 | 0 |
| 3 | «738» | 0,01% | 10 | 15 |
| 4 | «753» | 0,01% | 100 | 50 |
| 5 | «783» | 0,01% | 10 | 20 |
| 6 | Контроль (вода) | - | >100 | >100 |
Копрологические исследования показали, что наиболее высокой протистостатической активностью обладает водный раствор амида пальмитиновой кислоты («735»). Вещества «726», «738» и «783» также показали значительную активность.
При вскрытии на 10-й день характерные изменения в кишечнике обнаружили у цыплят, которые получали вещество «753» и у контрольных: геморрагии, слизь, неприятный запах, метеоризм, утолщение стенки слепых кишок
Таблица 6 Лечебно-профилактическая эффективность новых веществ, при экспериментальном кокцидиозе цыплят (опыт № 3)
| № групп | Вещество | Раствор, % доза мг/кг | Средняя масса одного цыпленка, г. | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 1-й день | 7-й день | 14-й день | |||
| 1 | «735» | 0.01% | 126,25 | 138,0 | 154,57 |
| 2 | «737» | 0.01% | 120,50 | 108,80 | 123,20 |
| 3 | «738» | 0.01% | 125,25 | 137,0 | 145,50 |
| 4 | «752» | 0.01% | 119,60 | 99,0 | 184,0 |
| 5 | «783» | 0.01% | 122,60 | 96,4 | 83,0 |
| 6 | «ХБ-1» | 20 мг/кг | 120,0 | 111,3 | 131,0 |
| 7 | Контроль | вода | 137,0 | 132,8 | 135,20 |
Таблица 7 Количество павших и выживших цыплят по дням (опыт №3)
| Вещество | Дни опыта | Сохранность, % | |||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
| «735» | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 1/7 | 1/7 | 1/7 | 1/7 | 1/7 | 1/7 | 1/7 | 1/7 | 2/6 | 75,0 |
| «737» | 0/8 | 0/8 | 1/7 | 1/7 | 3/5 | 3/5 | 3/5 | 3/5 | 3/5 | 3/5 | 3/5 | 3/5 | 37,50 |
| «738» | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 100 |
| «752» | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 7/1 | 7/1 | 7/1 | 7/1 | 7/1 | 12,50 |
| «783» | 0/8 | 0/8 | 2/6 | 2/6 | 4/4 | 4/4 | 4/4 | 6/2 | 6/2 | 6/2 | 6/2 | 7/1 | 12,5 |
| «ХБ-1» | 0/8 | 0/8 | 0/8 | 2/6 | 2/6 | 2/6 | 2/6 | 2/6 | 2/6 | 2/6 | 2/6 | 2/6 | 75,0 |
| Контроль | 0/8 | 0/8 | 1/7 | 1/7 | 3/5 | 3/5 | 4/4 | 5/3 | 5/3 | 5/3 | 6/2 | 6/2 | 25,0 |
Примечание: число погибших/ число выживших
На 5-6 дни после заражения отметили нарастание признаков болезни, появился кровавый понос у цыплят всех групп и падёж в некоторых группах. У погибших цыплят при вскрытии обнаруживали в слепых кишках скопления недавно свернувшейся крови, геморрагическое воспаление тонкого и толстого отделов кишечника. При микроскопии соскобов слизистой оболочки слепых кишок находили ооцисты кокцидий.
Профилактическое действие при экспериментальном кокцидиозе проявили вещества «735» и «ХБ-1», их активность составила по 75%. Профилактическая эффективность вещества «738» - амида олеиновой кислоты составила 100%. Клиническое проявление заболевания у цыплят этих групп прекращалось в течение 2-3 дней, а в других группах оно нарастало.
Выводы:
1. Соединение «ХБ-1» 2-имино-1-(бета-фенокси)этил-3-(3,4-дихлорб нзил)бензимидазолин в виде гидробромида при эймериозе кроликов резко снижает число ооцист. Лечебно-профилактическая эффективность соединения «ХБ-1» при кокцидиозе кроликов достигала 100%, а байкокса - 16,6%.
2. При экспериментальном эймериозе цыплят лечебно-профилактическая активность установлена как у азотсодержащих алифатических соединений («726» - амид миристиновой кислоты, «735» - амид пальмитиновой кислоты, «738» - амид олеиновой кислоты), так и у галогенированного производного имидазольных систем «ХБ-1». Лечебно-профилактическая активность препаратов достигала 75-100%. В контрольных группах погибали до 75% цыплят.
Работа выполнена в рамках гос. задания 0710-2019-0044 и при поддержке РФФИ грант 20-03-00657/20
Список литературы:
1. Зубенко А.А., Фетисов Л.Н., Зубенко И.В., Саяпина Е.А. 1,2,4-[3,4-а]-фтала-зины: синтез, инсектицидная и фунгицидная активность// Материалы международной конфернции «Химия и биологическая активность синтетических и природных соединений». 2006. С. 216.
2. Зубенко А.А. Материалы Первой международной конференции «Химия и биологическая активность гетероциклов и алкалоидов»// 2002. Т. 2. С. 116.
3. Зубенко А.А. Тезисы IV международной конференции «Новые направления в химии гетероциклов»// 2010. С. 84-92.
4. Производные пиридо-[1,2-а]бензимидазола, обладающие антибактериальным действием, и способ их получения/ А.А. Зубенко, Л.Н. Фетисов, Л.Д. Попов// Патент № 2394824 С1. 2010.
5. Способ лечения кокцидиоза (эймериоза) сельскохозяйственных животных и птиц/ А.И. Клименко, А.А. Зубенко, Л.Н. Фетисов// Патент № 2477129 С1. 2013.
6. Belhassan Assia, Fatima En-nahli, Hanane Zaki et al. Assessment of effective imidazole derivatives against SARS-CoV-2 main protease through computational approach// Life Sciences. 2020. Vol. 262. 118469.
7. Liu Ju., Liu Fang, Li Zhen et al. Novel 4-phenoxypyridine derivatives bearing imidazole-4-carboxamide and 1,2,4-triazole-3-carboxamide moieties: Design, synthesis and biological evaluation as potent antitumor agents// Bioorganic Chemistry. 2022. Vol. 120. 105629.
8. Li Ling, Yuan Sijie, Chen Lin et al. Discovery of novel 2-aryl-4-bis-amide imidazoles (ABAI) as anti-inflammatory agents for the treatment of inflammatory bowel diseases (IBD)// Bioorganic Chemistry. 2022. Vol. 120. 105619.
Резюме. Проведенными в Северо-Кавказском зональном научно-исследовательском ветеринарном институте в 2021-2022 годах исследованиями было установлено, что среди синтезированных авторами органических веществ ряда бензимидазола, имидазола и других азотистых гетероциклических и алифатических веществ, обнаружены соединения с антипротозойной активностью. Синтез соединений осуществляли с использованием как известных методов синтеза органических соединений, описанных в многочисленных руководствах, так и с применением разработанных авторами методов. При эймериозах (кокцидиозах) в отсутствие лечебно-профилактических мер происходит массовая гибель молодняка. У цыплят и кроликов она достигает 80-100%. Лечение при этом заболевании направлено на подавление эндогенных стадий эймерий, то есть мерозоитов и шизонтов. К сожалению, антибиотики, сульфаниламиды и нитрофураны утратили свою антикокцидийную активность, причиной чему стала развившаяся у эймерий лекарственная устойчивость. По мнению авторов, снизить остроту проблемы распространения лекарственной устойчивости у паразитов сможет новое направление создания препаратов неантибиотического происхождения. Сотрудниками Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института синтезировано свыше 200 новых органических соединений ряда бензтиофена, хиноксалина, галогенсодержащих имидазольных систем, производных пиридина и нитропиридина, а также других азотистых гетероциклических соединений. Установлена высокая антибактериальная и протистоцидная активность свыше 30 соединений с минимальными ингибирующими концентрациями 62,5-0,24 мкг/мл. Одно из синтезированных веществ показало высокий терапевтический эффект при эйме-риозе кроликов.
Ключевые слова: сельскохозяйственные животные, сельскохозяйственная птица, эймериоз, мерозоит, шизонт, лекарственная устойчивость протистоцидная активность, антипротозойные препараты, производные нитропиридина, производные бензтиофена.
Сведения об авторах:
Клименко Александр Иванович, академик РАН, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, директор ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346735, Ростовская область, Аксайский район., п. Рассвет, ул. Институтская, 1; тел.: 8-928-6002785; e-mail: dzni@mail.ru.
Чекрышева Виктория Владимировна, кандидат ветеринарных наук, директор Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-918-5943886; e-mail: veterinar1987@mail.ru.
Зубенко Александр Александрович, доктор биологических наук, главный научный сотрудник творческого коллектива по химическому синтезу новых лекарственных соединений Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-928-6049743; e-mail: alexsandrzubenko@yandex.ru.
Фетисов Леонид Николаевич, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник творческого коллектива по химическому синтезу новых лекарственных соединений Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-908-1978224; e-mail: fetisoff.leonid2018@yandex.ru.
Кононенко Кристина Николаевна, научный сотрудник творческого коллектива по химическому синтезу новых лекарственных соединений Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-918-5943886; e-mail: velikayakrista@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Святогорова Александра Евгеньевна, младший научный сотрудник творческого коллектива по химическому синтезу новых лекарственных соединений Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346421, Ростовская область, г. Новочеркасск, Ростовское шоссе, 0; тел.: 8-988-9525755; e-mail: sviatogorova.a@yandex.ru.
http://vetkuban.com/num4_202208.html