Валидация рекомбинантного плазмидного вектора для коэкспрессии иммумодулирующих цитокинов в разработке пробиотических штаммов

УДК 579.2:577.2:615.015
DOI 10.33861/2071-8020-2026-2-19-22

Оригинальное эмпирическое исследование

Самойленко В. С., Лапина А. А., Горовая Л. А., Крутько С. Г. Федеральное государственное автономное образовательное
учреждение высшего образования «СевероКавказский федеральный университет», Ставропольский край, г. Ставрополь

Аннотация. В последние годы наблюдается растущий интерес к разработке рекомбинантных пробиотических штаммов для адресной доставки терапевтических молекул в желудочно-кишечный тракт сельскохозяйственных животных. Это связано с необходимостью поиска альтернатив антибиотикам и повышения эффективности животноводства. Особое внимание уделяется созданию систем коэкспрессии интерлейкинов ИЛ-10 и ИЛ-22, которые являются ключевыми регуляторами иммунного ответа и функции кишечного барьера. Клиническое применение этих цитокинов ограничено их коротким периодом полураспада и системными побочными эффектами. Разработка рекомбинантных штаммов Lactobacillus spp., экспрессирующих цитокины, позволяет осуществлять их локальное производство в месте патологии. Современные методы молекулярного клонирования (Golden Gate Assembly с коррекцией CRISPR) обеспечивают высокоэффективную сборку генетических конструкций и точность вставки генов. Создание таких штаммов открывает возможности для разработки новых средств профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний у продуктивных животных, способствуя улучшению их продуктивного здоровья и снижению использования антибиотиков.

Целью описанного исследования явилась валидация рекомбинантного плазмидного вектора на основе репликона pWV01 для коэкс-прессии иммуномодулирующих цитокинов IL-10 и IL-22 в разработке пробиотических штаммов Lactobacillus spp., а также сравнительный анализ эффективности современных методов молекулярного клонирования (Golden Gate Assembly с CRISPR-коррекцией, Gibson Assembly, PCR-сшивки) для сборки данной генетической конструкции.

Материалы и методы исследований. Исследование выполнено на базе Геномного Центра Северо-Кавказского Федерального университета (ФГАОУ ВО). Объектами исследования служили штаммы Lactobacillus spp. Разработан рекомбинантный плазмидный вектор на основе pWV01 для коэкспрессии оптимизированных генов цитокинов IL-10 и IL-22 крупного рогатого скота под контролем индуцируемого промотора PlacUV5. Конструкции валидировали комплексно с помощью колониевой ПЦР, рестрикционного анализа и секвенирования. Проведён сравнительный анализ эффективности методов молекулярного клонирования.

Результаты исследований и их обсуждение. Успешно сконструирован рекомбинантный плазмидный вектор pLacDualIL10/IL22 для коэкспрессии цитокинов в Lactobacillus spp. Проведён сравнительный анализ методов молекулярного клонирования, который показал, что комбинированный метод Golden Gate Assembly с CRISPR-коррекцией обеспечивает максимальную эффективность сборки (95-100%). Полученные конструкции валидированы с помощью ПЦР, рестрикционного анализа и секвенирования.

Заключение. Проведённое исследование показало, что комбинированный метод Golden Gate Assembly с CRISPR-коррекцией является оптимальным для конструирования рекомбинантной плазмиды pLacDualIL10/IL22, обеспечивая эффективность сборки до 95100%. Разработанный вектор представляет собой перспективную платформу для создания пробиотических штаммов нового поколения с заданными иммуномодулирующими свойствами для применения в ветеринарии и животноводстве.

Ключевые слова: рекомбинантные пробиотики, Lactobacillus spp., коэкспрессия цитокинов, интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-22 (IL-22), Golden Gate Assembly, CRISPR-коррекция, вектор pWV01, молекулярное клонирование, ветеринарная иммунология.

Современное животноводство остро нуждается в новых технологиях, позволяющих одновременно укреплять здоровье животных, повышать их продуктивность и минимизировать использование антибиотиков. Одним из перспективных решений является создание пробиотиков нового поколения на основе генетически модифицированных микроорганизмов, способных локально производить терапевтические молекулы непосредственно в желудочно-кишечном тракте [1]. Особый интерес в этой роли представляют иммуномодулирующие цитокины, в частности интерлейкины IL-10 и IL-22, которые критически важны для регуляции иммунного ответа и поддержания целостности кишечного барьера [2, 3].

IL-10 действует как мощный противовоспалительный агент, подавляя синтез провоспалительных медиаторов и блокируя сигнальный путь NF-?B, что актуально для терапии хронических энтеритов. IL-22, в свою очередь, играет ключевую роль в защите и регенерации кишечного эпителия, стимулируя выработку муцинов, антимикробных пептидов и ускоряя пролиферацию клеток. Однако прямое применение этих белков ограничено их быстрым разрушением в организме и системными побочными эффектами, что делает необходимым разработку систем для их локальной и контролируемой доставки [3, 4, 5].

Важным аспектом таких систем являются пробиотические бактерии рода Lactobacillus, благодаря их естественной устойчивости к желудочному соку, способности адгезироваться к эпителию, иммуномодулирующим свойствам и признанной безопасности. Поскольку лактобациллы от природы не синтезируют цитокины млекопитающих, для создания штаммов-продуцентов требуется генетическая модификация. Ключевыми задачами при этом являются обеспечение высокого уровня экспрессии функциональных белков, сохранение стабильности рекомбинантных плазмид без применения антибиотиков, поддержание жизнеспособности и полезных свойств бактерии-хозяина, а также корректный фолдинг чужеродных белков [6, 7].

Реализовать эти задачи позволяют современные методы синтетической биологии. Технологии высокоточной сборки ДНК, такие как Golden Gate Assembly, в комбинации с системой редактирования CRISPR-Cas9, обеспечивают создание сложных генетических конструкций для коэкспрессии нескольких терапевтических белков с максимальной эффективностью [8, 9]. Дополнительно необходимы оптимизация кодонового состава генов цитокинов для повышения экспрессии в лактобациллах, выбор эффективных промоторов и терминаторов для регулирования этого процесса, а также использование стабильных репликонов и двойных систем селекции для долговременного поддержания плазмид в клетках в отсутствие антибиотиков [11].

Цель исследования - разработать рекомбинантный плазмид-ный вектор для коэкспрессии цитокинов IL-10 и IL-22 в штаммах Lactobacillus spp. и провести сравнительную оценку эффективности методов молекулярного клонирования для его сборки.

Материалы и методы исследований. На базе Геномного Центра Северо-Кавказского Федерального университета, в период с 2024 по 2025 гг. проводились исследования по разработке и валидации рекомбинантного плазмидного вектора для коэкспрессии иммуномодулирующих цитокинов в штаммах Lactobacillus spp..

В качестве объектов исследования использовали штаммы пробиотических бактерий Lactobacillus spp. из музейной коллекции кафедры микробиологии. Для конструирования вектора применяли репликон pWV01 (5,2 тыс. п.н.), содержащий два селективных маркера: ген ermAM, обеспечивающий устойчивость к эритромицину, и ген cat, детерминирующий устойчивость к хлорамфениколу. Экспрессия целевых генов находилась под контролем индуцируемого промотора PlacUV5, активация которого осуществлялась добавлением изопро-пил-?-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в концентрации 1 мМ.

Синтетические последовательности цитокинов IL-10 и IL-22 крупного рогатого скота были оптимизированы по кодоновому использованию для высокоуровневой экспрессии в Lactobacillus spp. с доведением GC-состава до 52-55%. Для обеспечения ко-трансляции и самопроцессинга полипротеина между последовательностями цитокинов вставили кодирующий линкер T2A. Терминация транскрипции была обеспечена последовательностью rrnB T1/T2.

Валидацию рекомбинантных конструкций проводили комплексно: методом колониевой ПЦР со специфичными праймерами к участкам вставки, рестрикционным анализом с использованием эндонуклеаз EcoRI и XhoI, а также полным секвенированием кассет экспрессии цитокинов методом Сэнгера на секвенаторе Genetic Analyzer 3500 (Applied Biosystems). Сравнительный анализ эффективности сборки проводили на основе доли корректных клонов для каждого из примененных методов молекулярного клонирования.

Результаты исследований и их обсуждение. Разработка рекомбинантного плазмидного вектора pLacDualIL10/IL22 включала поэтапную оптимизацию методов сборки, верификацию конструкции и её функциональную оценку на уровне молекулярных характеристик. Основными результатами исследования стали получение стабильной плазмиды с подтверждённой структурой и демонстрация эффективности применённых методик сборки.

Конструирование рекомбинантной плазмиды pLacDualIL10/ IL22 начиналось с синтеза de novo генетических последовательностей, состоящих из 8 олигонуклеотидов длиной 60-80 нуклеотидов, кодирующих интерлейкины IL-10 и IL-22 телят. После гибридизации и ПЦР-сшивания олигонуклеотиды формировали полноразмерные генетические конструкции. Особое внимание было уделено оптимизации кодонового состава для последующей экспрессии в штаммах Lactobacillus spp., что включало адаптацию GC-состава до уровня 52-55% и выбор кодонов, предпочтительных для данных микроорганизмов. Длина каждого синтезированного гена составила приблизительно 500 пар нуклеотидов. Параллельно проводилась подготовка векторной основы на базе репликона pWV01 размером приблизительно 5,2 тыс. п.н. В его структуру была введена двойная система селекции, включающая гены устойчивости к эритромицину (ermAM) и хлорамфениколу (cat), что обеспечивало возможность последующего отбора рекомбинантных клонов. Также вектор был модифицирован путем добавления множественного сайта клонирования и промотора PlacUV5 для индуцируемой экспрессии целевых генов.

В результате применения различных методов молекулярного клонирования была успешно сконструирована плазмидная конструкция pLacDualIL10/IL22 размером 12,5 тыс. п.н. (рисунок 1).

 

Рис. 1. Структурная карта плазмиды pLacDualIL10/IL22

На рисунке представлена схематическая карта рекомбинантного плазмидного вектора pLacDualIL10/IL22, созданного для ко-экспрессии интерлейкинов IL-10 и IL-22 в пробиотических штаммах Lactobacillus spp. Карта имеет кольцевую структуру, где отображены все ключевые элементы конструкции. В верхней части карты расположен промотор PlacUV5, индуцибельный IPTG, инициирующий транскрипцию кассеты экспрессии. Непосредственно за ним локализован ген IL-10, оптимизированный по кодонам для экспрессии в Lactobacillus, далее показан линкер T2A, обеспечивающий разделение полипептида и независимую трансляцию второго белка. Следующим сегментом карты является ген IL-22, отвечающий за синтез второго цитокина, после чего расположены сильные транскрипционные терминаторы rrnB T1/T2, предотвращающие транскрипционное «протекание». В нижней части плазмиды находятся кассеты селекции: ermAM (устойчивость к эритромицину) и cat (устойчивость к хлорамфениколу), обеспечивающие стабильность вектора в грамположительных клетках. Репликон pWV01 ori, расположенный слева, отвечает за поддержание плазмиды в клетке-хозяине с умеренной копийностью.

Таким образом, представленный рисунок демонстрирует модульное устройство плазмиды pLacDualIL10/IL22, включающей промотор, две кодон-оптимизированные вставки IL-10 и IL-22, разделённые саморасщепляющимся пептидом T2A, двойную систему селекции и сильные терминаторы, что обеспечивает её функциональность как универсальной платформы для создания пробиотических систем экспрессии иммуномодулирующих белков.

Первоначальные попытки использовать классическое ре-стрикционно-лигазное клонирование оказались малорезультативными. Эффективность интеграции вставок в линию вектора не превышала 20-30%, а количество корректных конструкций после проверки ПЦР и секвенированием оставалось низким. Метод PCR-сшивки с использованием праймеров с гомологичными участками позволил увеличить эффективность до 40-50%, однако требовал сложной оптимизации температурных режимов и зачастую давал побочные продукты амплификации. Значительно более надёжные результаты показал метод Gibson Assembly, где корректность сборки достигала 65-75% при общем времени эксперимента около двух суток. Наиболее продуктивной стратегией оказалась комбинация Golden Gate Assembly и CRISPR-коррекции, обеспечившая до 95–100% правильных конструкций при минимальных временных затратах (табл. 1)

Таблица 1 Сравнительная эффективность методов сборки

Метод	Время	Точность	Эффективность
Рестрикционно-лигазное клонирование	3-5 дней	Низкая	20-30%
PCR-сшивка	2-3 дня	Средняя	40-50%
Gibson Assembly	2 дня	Средняя	65-75%
Golden Gate+CRISPR	1 день	Высокая	95-100%

Основным этапом работы являлась сборка плазмиды с использованием комбинированного метода Golden Gate Assembly с последующей CRISPR-коррекцией. На первом этапе проводили ПЦР-амплификацию синтезированных генов IL-10 и IL-22 с праймерами, содержащими уникальные сайты связывания для рестриктаз типа IIS (BsaI) на 5’- и 3’-концах. Одновременно подготавливали вектор pLacDual, модифицированный для совместимости с системой Golden Gate. Полученные фрагменты смешивали в оптимальном соотношении 3:1 (вставка:вектор) с добавлением фермента BsaI и T4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь подвергали термоциклированию по схеме: 10 циклов чередования температур 37°C в течение 5 минут и 16°C в течение 10 минут, что обеспечивало одновременное разрезание и лигирование фрагментов. На следующем этапе лигированную смесь трансформировали в компетентные клетки Lactobacillus spp., экспрессирующие систему CRISPR-Cas9. Специфичные guide RNA направляли комплекс Cas9 на разрезание плазмид с ошибочными вставками, что позволяло селективно отбирать только клоны с корректной сборкой. Отбор трансформантов проводили на питательных средах с добавлением эритромицина (50 мкг/мл) и хлорамфеникола (30 мкг/мл).

Для подтверждения корректности сборки отобранные колонии анализировали методом ПЦР с последующим полным секвенированием, что позволило исключить ошибки сборки и мутации в целевых последовательностях. Данный подход продемонстрировал исключительную эффективность клонирования на уровне 95-100%, что существенно превосходит традиционные методы молекулярного клонирования.

Заключение. Сравнительный анализ методов клонирования показал, что оптимальной стратегией для создания плазмиды pLacDualIL10/IL22 является комбинированный подход, интегрирующий технологию Golden Gate Assembly с последующей CRISPR-коррекцией. Эта методика обеспечила исключительную точность и эффективность сборки (95-100% корректных клонов), значительно превзойдя традиционные методы. Ключевым элементом конструкции стал T2A-пептид, обеспечивающий ко-транс-ляционное разделение полипротеина на индивидуальные функциональные цитокины IL-10 и IL-22. Такой подход гарантирует сбалансированную экспрессию обоих белков из единой транскрипционной единицы, что критически важно для достижения синергического терапевтического эффекта. Основным преимуществом созданной плазмиды является коэкспрессия двух цитокинов с взаимодополняющим действием: противовоспалительного IL-10 и регенераторного IL-22. Дополнительную стабильность обеспечивает система двойной селекции на основе генов устойчивости к эритромицину и хлорамфениколу, поддерживающая сохранность плазмиды при длительном культивировании. Модульная архитектура вектора также позволяет масштабировать конструкцию для добавления новых генетических кассет, открывая путь к созданию многофункциональных терапевтических платформ. В заключение следует констатировать, что разработанный рекомбинантный вектор pLacDualIL10/IL22 представляет собой перспективную основу для создания пробиотических штаммов нового поколения. Применение современной методологии сборки и коррекции обеспечило высокую эффективность процесса, а сама конструкция продемонстрировала необходимую стабильность и функциональную активность, подтверждая ее потенциал для разработки инновационных препаратов в ветеринарии и животноводстве.

Список литературы:

1. Coomes, S.M., Kannan, Y., Pelly, V.S., Entwistle, L.J., Guidi, R., Perez-Lloret, J., Nikolov, N., Muller, W. and Wilson, M.S. CD4+ Th2 cells are directly regulated by IL-10 during allergic airway inflammation. Mucosal Immunology, 10(1), 150–161 (2017).

2. Cochez, P.M., Michiels, C., Hendrickx, E., Van Belle, A.B., Lemaire, M.M., Dauguet, N., Warnier, G., de Heusch, M., Togbe, D. and Ryffel, B. AhR modulates the IL-22-producing cell proliferation/recruitment in imiquimod-induced psoriasis mouse model. European Journal of Immunology, 46(6), 1449–1459 (2016).

3. Avitabile, S., Odorisio, T., Madonna, S., Eyerich, S., Guerra, L., Eyerich, K., Zambruno, G., Cavani, A. and Cianfarani, F. Interleukin-22 Promotes Wound Repair in Diabetes by Improving Keratinocyte Pro-Healing Functions. Journal of Investigative Dermatology, 135(11), 2862–2870 (2015).

4. Tahvildari, M. and Dana, R. Low-Dose IL-2 Therapy in Transplantation, Autoimmunity, and Inflammatory Diseases. The Journal of Immunology, 203(11), 2749–2755 (2019).

5. Rodriguez-Beltran, J., DelaFuente, J., Leon-Sampedro, R., MacLean, R.C. and San Millan, A. Beyond horizontal gene transfer: the role of plasmids in bacterial evolution. Nature Reviews Microbiology, 19(6), 347–359 (2021).

6. Zhang, S. and Voigt, C.A. Engineered dcas9 with reduced toxicity in bacteria: Implications for genetic circuit design. Nucleic Acids Research, 46(20), 11115–11125 (2018).

7. Wang, T., Tague, N., Whelan, S.A. and Dunlop, M.J. Programmable gene regulation for metabolic engineering using decoy transcription factor binding sites. Nucleic Acids Research, 49(2), 1163–1172 (2021).

8. Pasini, M., et al. Using promoter libraries to reduce metabolic burden due to plasmid-encoded proteins in recombinant escherichia coli. New Biotechnology, 33(1), 78–90 (2016).

9. Potvin-Trottier, L., Lord, N.D., Vinnicombe, G. and Paulsson, J. Synchronous long-term oscillations in a synthetic gene circuit. Nature, 538(7625), 514–517 (2016).

10. Sheth, R.U., Yim, S.S., Wu, F.L. and Wang, H.H. Multiplex recording of cellular events over time on CRISPR biological tape. Science, 358(6369), 1457–1461 (2017).

11. Shao, B., et al. Single-cell measurement of plasmid copy number and promoter activity. Nature Communications, 12, 1475 (2021).

12. Plotka, M., Wozniak, M. and Kaczorowski, T. Quantification of plasmid copy number with single colour droplet digital pcr. PLOS ONE, 12(1), e0169846 (2017).

13. Specht, D.A., Xu, Y. and Lambert, G. Massively parallel CRISPRi assays reveal concealed thermodynamic determinants of dСas12a binding. Proceedings of the National Academy of Sciences, 117 (21), 11274–11282 (2020).

14. Kang, C.W., et al. Synthetic auxotrophs for stable and tunable maintenance of plasmid copy number. Metabolic Engineering, 48, 121–128 (2018).

15. Ali, M.Z. and Brewster, R.C. Controlling gene expression timing through gene regulatory architecture. bioRxiv, 2021.04.09.439163 (2021). PLoS Comput Biol. 2022 Jan 18;18(1): e1009745.

Сведения об авторах:

Самойленко Виктор Сергеевич, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры зоологии и паразитологии медико-биологического факультета ФГАОУ ВО «Северо-Кавказский федеральный университет»; 355017, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1; тел.: 8-934-0819398; e-mail: viktor_samoylenko_26@mail.ru.

Лапина Анастасия Александровна, студентка медико-биологического факультета, базовой кафедры генетики и селекции ФГАОУ ВО «Северо-Кавказский федеральный университет»; 355017, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1; тел.: 8-962-4538466; e-mail: anastasija.la2018@yandex.ru.

Горовая Людмила Алексеевна, ассистент базовой кафедры микробиологии медико-биологического факультета ФГАОУ ВО «Северо-Кавказский федеральный университет»; 355017, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1; тел.: 8-918-6822540; e-mail: ludmila.bespalova.00@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Крутько Софья Геннадьевна, студентка медико-биологического факультета ФГАОУ ВО «Северо-Кавказский федеральный университет»; 355017, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1; тел.: 8-928-2441364; e-mail: sonya.krutko.04@mail.ru.

Заявленный вклад авторов:

Самойленко В.С.: разработка концепции, проведение исследований, написание рукописи – рецензирование и редактирование.

Лапина А.А.: разработка концепции, проведение исследований, написание рукописи – рецензирование и редактирование.

Горовая Л.А.: проведение исследований, валидация результатов, визуализация, написание черновика рукописи.

Крутько С.Г.: проведение исследований, валидация результатов, визуализация, написание черновика рукописи.

Конфликт интересов: авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.