Сравнение иммуногенной активности эпизоотических изолятов и производственных штаммов Escherichia Coli

УДК 636+619
DOI 10.33861/2071-8020-2022-6-11-13

Галиакбарова А.А. Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный
центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», г. Москва ,
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московская
государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина», г. Москва
Пименов Н.В. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии -МВА имени К.И. Скрябина»,
г. Москва

Инфекционные болезни наносят значительный экономический ущерб в виде снижения продуктивности, а также смертности сельскохозяйственных животных в раннем возрасте, что в свою очередь снижает рентабельность агропромышленной отрасли. К числу таких болезней инфекционной этиологии относится колибактериоз, широко распространенный во всем мире и представляющий серьезную угрозу развитию отрасли.

Одним из самых эффективных средств борьбы с колибактериозом, приносящим ущерб в виде гибели молодняка животных до 90%, снижения привесов и проявления вторичных инфекций на фоне угнетенного состояния на организм, является вакцинопрофилактика [6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13].

В настоящее время для этой цели используют живые и инактивированные вакцины. На территории Российской Федерации в обороте находятся отечественные и зарубежные живые и инактивированные вакцины. Живые вакцины используют для птиц, инактивированные -для молодняка крупного рогатого скота, пушных зверей, овец.

Преимуществом инактивированных вакцин является безопасность и их способность формировать у привитых животных и зверей напряженный и продолжительный поствакцинальный иммунитет [1, 2, 3].

Внедрение новых более иммуногенных штаммов в состав действующих инактивированных препаратов для профилактики колибак-териоза позволят сделать вакцины более эффективными, что в свою очередь снизит уровень проявления секундарных инфекций что, как следствие, уменьшает или полностью исключает применение антибиотиков с целью лечения. Это способствует получению экологически чистой, натуральной и безопасной продукции, не содержащей антибиотиков [5, 6, 7, 8].

Целью исследований стало изучение иммуногенных свойств изо-лятов, выделенных на территории Московской и Тульской областей, и производственных штаммов Escherichia coli, наиболее активных продуцентов адгезивных антигенов.

Материалы и методы исследований. Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина», отдельные исследования выполнены на базе лаборатории качества и стандартизации бактерийных лекарственных средств ИЦ ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

В работе использовали изоляты и штаммы эшерихий, питательные среды, реактивы, лабораторное оборудование и посуду, животных, а также бактериологические и биологические методы исследований.

Результаты исследований и их обсуждение. С целью изучения видового разнообразия эпизоотических штаммов эшерихий на территории Московской и Тульской областей в животноводческих хозяйствах и в частном секторе, а также поиском более вирулентных штаммов проводили ряд лабораторных исследований патологического и биологического материала. Из 100 образцов биологического материла нами был выделен 31 изолят E. coli от 27 животных. Помимо E. coli были выделены и представители других родов энтеробактерий, однако их дальнейшая идентификация не входила в цель наших исследований. Эшерихиии выделили из печени, тонкого и толстого кишечника, селезенки телят и поросят от 7- до 20-дневного возраста.

Иммуногенность изолятов определяли по величине LD50. Моновакцины готовили из культуры наиболее вирулентных изолятов E. coli во флаконах со средой Хотингера, для этого 2 см3 стерильной 40% глюкозы добавляли во флакон, куда потом добавляли культуру изоля-тов, культивировали 48 часов, периодически помешивая. Культуру проверяли на чистоту роста и концентрацию бактериальных клеток. Чистоту роста определяли методом микроскопии, мазки окрашивали по Граму, также культуры сеяли на среды Эндо, МПА, Китта-Тароцци, Сабуро. Инкубировали 18-24 ч на среде Эндо, МПА, Китта-Тароцци при температуре 37°C, на среде Сабуро - при температуре 22°C. За посевами наблюдали 7 суток.

Антиген инактивировали формалином (содержание формальдегида 36%). Формалин разводили дистиллированной водой в соотношении 1:1 и добавляли к бульонной культуре, тщательно помешивая. После перемешивания флаконы убирали в термостат при температуре 37°C на 3 недели для полной инактивации токсинов. Флаконы каждый день просматривали в проходящем свете и перемешивали. Инактивацию контролировали посевами на среды Хоттингера, 2,0 см3 культуры на 100,0 см3 среды. Посевы инкубировали в течение суток затем пересевали на среду Эндо. Антигены считали стерильными в случае отсутствия роста характерного для эшерихий в течение 72 часов по ГОСТ 28085.

Вариацию иммуногенности оценивали на белых мышах массой 18-20 г., которым подкожно вводили антигены по 1,0 млрд., 200,0 млн., 40,0 млн., 8,0 млн микр. клеток. В опыте на каждую дозу использовали по 5 мышей. Заражение иммунизированных животных проводили 5 LD50 на 14 день после иммунизации. Результаты учитывали через 3 дня. Вычисление LD50 проводили по формуле Кербера в модификации в модификации Ашм8/17 Га.Тул-Воробьева (П.И. Ашмарин и А.А. Воробьев): Lg ImD50 = IgD - о (ZLi - 0,5), где D - максимальная инфекционная доза в опыте, о - логарифм отношенй каждой последующей дозы к предыдущей. ZLi - сумма значений Li, отношения числа животных, выживших от введения данной дозы, к общему числу животных в группе.

Для определения иммуногенности отбирали наиболее вирулентные штаммы и изоляты. Оценку иммуногенности проводили в сравнении с производственными штаммами. Отбор культур проводили согласно наличию факторов вирулентности в том или ином штамме. Из отобранных штаммов изготавливали формолвакцину. Степень напряженности иммунитета оценивали по величине ImD50, по количеству микробных клеток, которое может обеспечить защиту 50% иммунизированных животных после заражения вирулентными штаммами (табл. 1).

Таблица 1 Иммуногенная активность штаммов и изолятов в опыте на белых мышах

№ п/п	Наимено­вание штамма Escherichia coli	Доза, микроб­ных клеток	Коли­чество белых мышей, голов	Результаты		ImD50, микробных клеток
				Живы	Пали
Музейные штаммы
1.	E. coli № 727	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	5 4 4 5	0 1 1 0	7*108
2.	E. coli б/н О101	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	4 4 4 5	1 1 1 0	6,11*108
3.	E. coli № Д616	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	4 5 4 5	1 0 1 0	7*108
4.	E. coli ГДР	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	3 4 4 5	2 1 1 0	4,39*108
5.	E. coli б/н 09	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	4 4 3 5	1 1 2 0	4,25*108
6.	E. coli № 397-37/14	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	4 3 5 5	1 2 0 0	7,20*108
7.	E. coli № 398-37/14	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	3 5 4 5	2 0 1 0	7,0*108
8.	E. coli № ТП-85	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	2 5 3 5	3 0 2 0	4,0*108
9.	E. coli № 2005	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	4 3 5 5	1 2 0 0	5,2*108
Наименование выделенных изолятов Escherichia coli
10.	E. coli 3/16 Га.Тул	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	0 1 3 4	5 4 2 1	0,8*108
11.	E. coli 9/17 Га.Мос	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	1 1 4 5	4 4 1 0	1,23*108
12.	E. coli 5/16 Гр.Мос	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	1 1 4 5	4 4 1 0	0,7*108
13.	E. coli 7/16 Г.Г.Тул	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	0 1 4 5	5 4 1 0	0,78*108
14.	E. coli 17/20 Га.Тул	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	5 5 5 5	0 0 0 0	3,5*108
15.	E. coli 24/21 Г.П.Мос	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	0 0 4 5	5 5 1 0	0,89*108
17.	E. coli 19/20 Г.Г.Тул	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	0 1 4 5	5 4 1 0	0,8*108
18.	E. coli 25/21 Г.П.Тул	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	5 5 5 5	0 0 0 0	3,5*108
19.	E. coli 20/20 Г.Г.Мос	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	0 0 3 5	5 5 2 0	0,47*108
20.	E. coli 28/21 Г.П.Мос	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	3 3 0 0	2 2 5 5	1,30*108
21.	E. coli 21/20 Г.Г.Мос	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	4 4 4 5	1 1 1 0	1,50*108
22.	E. coli 29/21 Г.П.Тул	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	3 3 5 5	2 2 0 0	1,40*108
23.	E. coli 22/20 Г.Г.Мос	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	5 5 2 0	0 0 3 5	0,75*108
24.	E. coli 23/20 Г.Г.Мос	2,0 млрд 400,0 млн 80,0 млн. 16,0 млн	5 5 5 5	1 2 0 0	4 3 5 5	1,45*108

Из данных таблицы 1 следует, что по сравнению с выделенными изолятами музейные штаммы показали более низкие показатели иммуногенности.

Самыми иммуногенными штаммами из коллекции оказались E. coli № ТП-85 ImD50 составил 4,0*108 (400 млн.), наименее иммуногенными - E. coli № 727 и E. coli № Д616 ImD50 составил 7,30*108 (730 млн.) и 7,11*108(711 млн.), соответственно.

Выделенные нами изоляты показали следующие результаты: наиболее иммуногенными оказались E.coli 22/20 Г.Г.Мос LD50 составил 0,46*108 (46 млн.) - ImD50 составил 0,75*108 (75 млн.); E. coli 3/16 Га.Тул - LD50 составил 0,47*108 (47 млн.) - ImD50 составил 0,8*108 (80 млн.); E. coli 20/20 Г.Г.Мос LD50 составил 0,47*108 (47 млн.) - ImD50 составил 0,47*108 (47 млн.); E.coli 24/21 Г.П.Мос LD50 составил 0,65*108 (65 млн.) - ImD50 составил 0,89*108 (89 млн.); E.coli 7/16 Г.Г.Тул LD50 составил 0,89*108 (89 млн.) - ImD50 составил 0,78*108 (78 млн.); E.coli 19/20 Г.Г.Тул LD50 составил 0,89*108 (89 млн.) - ImD50 составил 0,8*108 (80 млн.); E.coli 18/20 Г.Г.Мос LD50 составил 0,89*108 (89 млн.) - ImD50 составил 1,0*108 (100 млн.); E.coli 9/17 Га.Мос LD50 составил 1,2*108 (120 млн.) - ImD50 составил 1,23*108 (123 млн.); E.coli 5/16 Гр.Мос LD50 составил 1,20*108 (120 млн.) - ImD50 составил 0,7*108 (70 млн.); E.coli 28/21 Г.П.Мос LD50 составил 3,2*108 (320 млн.) - ImD50 составил 0,24*108 (24 млн.); E.coli 29/21 Г.П.Тул LD50 составил 6,1*108 (610 млн.) - ImD50 составил 1,40*108(140 млн.). Наименее иммуногенными оказались изоляты E.coli 25/21 Г.П.Тул и E.coli 17/20 Га.Тул и LD50 составила 22,36*108 (2 млрд. 236 млн.) - ImD50 составил 3,5*108 (350 млн.) каждого.

У изолятов, которые содержали по 2 адгезина, показатель ImD50 был в диапазоне от 150 до 350 млн, по 3 адгезина - от 100 до 150 млн. (иммуногенность была выше, чем у изолятов с двумя), по 4 адге-зина - от 70 до 99 млн. (иммуногенность выше чем у изолятов с тремя), по 5 адгезинов - 47 млн. (иммуногенность больше чем у изолятов с четырьмя). Следовательно, вирулентные штаммы, содержащие несколько адгезинов и токсинов, показали наиболее высокие результаты. Изоляты, которые содержали ImD50 менее 100 млн. микробных клеток, были более иммуногенными, тогда как изоляты, которые содержали от 500 млн. микробных клеток и более 1 млрд. микробных клеток, были авирулентными и менее иммуногенными.

Для дальнейшего более глубокого изучения изолятов Escherichia coli необходимо определить их антигенную и превентивную активность, что ставит задачи наших дальнейших исследований.

Заключение. Одним из перспективных путей совершенствования специфической профилактики и лечения эшерихиоза животных, по нашему мнению, является селекция штаммов-продуцентов адгезивных антигенов и энтеротоксинов, выделение их из бактериальных клеток и создание на их основе компонентных препаратов с высокими протективными и превентивными свойствами. Следует также отметить, что вакцины, состоящие из отдельных иммуногенных компонентов бактериальной клетки не только более эффективны, но и менее реактогенны, чем вакцины из целых клеток. Полученные нами данные подтвердили, что чем больше адгезинов в штамме, чем выше титры антител, тем более иммуногенными свойствами обладает данный изолят и тем выше превентивная активность, что согласовывалось с литературными данными. Результаты высокой иммуногенности полученных нами эпизоотических штаммов Escherichia coli продуцентов адгезинов подтверждены исследованиями защитных свойств сывороток, полученных при иммунизации моделей (кроликов) прототипами моновакцин. Таким образом, можно утверждать о перспективах поиска новых штаммов, поиска и апробации новых методов проверки штаммов, при помощи современного лабораторного обеспечения и о перспективах разработки и усовершенствования отечественных иммунопрепаратов. Наиболее активные продуценты адгезинов имеют больший потенциал в качестве штаммов-кандидатов в вакцинопрепа-раты против колибактериоза. Полученные сведения об этиологической значимости и иммуногенных свойствах позволят совершенствовать средства и методы специфической профилактики колибактериоза молодняка сельскохозяйственных животных, новые штаммы могут быть основой для развития антигенного потенциала и повышения протек-тивной активности отечественных вакцинопрепаратов без ущерба для эпизоотической обстановки в Российской Федерации.

Вклад авторов и конфликт интересов. Авторы внесли эквивалентный вклад в подготовку публикации и заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Список литературы:

1. Изучение антигенной активности вакцины против ИРТ, ВД-БС, ПГ-3 и хламидиоза крс на лабораторных животных/ И.Р. Акбашев, В.В. Евстифеев, В.Г. Гумеров, И.Г. Каримуллина, Г.И. Хусаинова// Ветеринарный врач. 2018. № 1. С. 29-33.

2. Получение лиофилизированного препарата антирабического иммуноглобулина и исследование его основных свойств/ Е.Г. Абрамова, Н.Н. Кочкалова, А.К. Никифоров, А.Ю. Бутырский, Ю.В. Иванов, Н.В. Синицына, Т.А. Михеева, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, Л.В. Савицкая, С.В. Генералов, М.Н. Киреев, Н.А. Шарапова// Проблемы особо опасных инфекций. 2011. № 2. С. 75-78.

3. Hur J., Lee H. Immune responses to new vaccine candidates constructed by a live attenuated Salmonella Typhimurium delivery system expressing Escherichia coli F4, F5, F6, F41 and intimin adhesin antigens in a murine model// J. Vet. Med. Sci. 2011. 73 (10): 265-1273.

4. Inns T., Cleary Р., Bundle N. et al. Novel application of the matched casecontrol design to compare food supply chains during an Escherichia coli O157 outbreak, United Kingdom, 2016// Euro Surveill. 2018. 23 (18): 17-00195. p. 1-5.

5. Iovine O., Dejuste C., Miranda F. et al. Isolation of Escherichia coli and Salmonella spp. from free-ranging wild animals// Braz. J. Microbiol. 2015. 46 (4): 1257-1263.

6. Jensen L., Birk T., Borck H0g B. et al. Cross and co-resistance among Danish porcine Escherichia coli isolates// Res. Vet. Sci. 2018. 119: 247-249.

7. Johnson C., Ridley H., Pengelly R. J. et al. The unstructured domain of colicin N kills Escherichia coli// Molecular microbiology. 2013. 89 (1): 84-95.

8. Kalita A., Hu J., Torres A.G. Recent advances in adherence and invasion of pathogenic Escherichia coli// Curr. Opin. Infect. Dis. 2014. 27 (5): 459-464.

9. Kanayama A., Yahata Y., Arima Y. et al. Enterohemorrhagic Escherichia coli outbreaks related to childcare facilities in Japan. 2010-2013// BMC Infect. Dis. 2015. 15: 539.

10. Kaneko T. Reproductive technologies for the generation and maintenance of valuable animal strains// J. Reprod. Dev. 2018. 64 (3): 209-215.

11. Kartsev N.N., Fursova N.K., Pachkunov D.M. et al. Molecular Characterization of Enterotoxin-Producing Escherichia coli collected in 2011-2012 in Russia// PLoS One. 2015. 10 (4): 1-12.

12. Kawanishi M., Abo H., Ozawa M. et al. Prevalence of Colistin Resistance Gene mcr-1 and Absence of mcr-2 in Escherichia coli Isolated from Healthy FoodProducing Animals in Japan// Antimicrob Agents Chemother. 2016. 61 (1): 1-3.

13. Khalil I., Troeger C., Blacker B.F. et al. Morbidity and mortality due to shigella and enterotoxigenic Escherichia coli diarrhoea: the Global Burden of Disease Study 1990-2016// Lancet Infect Dis. 2018. 18 (11): 1229-1240.

Резюме. В последнее время все более актуальной проблемой является индикация колибактериоза, который по значимости среди пищевых зоонозов занимает второе место после сальмонеллеза. К инфекции помимо человека восприимчив молодняк различных сельскохозяйственных животных - свиньи, крупный рогатый скот, лошади, овцы, куры, а также пушные звери. Самой эффективной мерой профилактики колибактериоза является - вакцинация. К сожалению, иммуногенная активность находящихся в обороте на территории России вакцин отечественного и иностранного производства со временем становится менее эффективной, и, в связи с этим, необходим поиск и отбор новых более эффективных штаммов микроорганизмов для внедрения в уже существующие отечественные вакцины. Одним из перспективных путей совершенствования специфической профилактики и лечения эшерихиоза животных, по нашему мнению, является селекция штаммов-продуцентов адгезивных антигенов и энтеротоксинов, выделение их из бактериальных клеток и создание на их основе компонентных препаратов с высокими протективными и превентивными свойствами. Следует также отметить, что вакцины, состоящие из отдельных иммуногенных компонентов бактериальной клетки не только более эффективны, но и менее реактогенны, чем вакцины из целых клеток. Полученные нами данные подтвердили, что чем больше адгезинов в штамме, чем выше титры антител, тем более иммуногенными свойствами обладает данный изолят и тем выше превентивная активность. Результаты высокой иммуногенности полученных нами эпизоотических штаммов Escherichia coli продуцентов адгезинов подтверждены исследованиями защитных свойств сывороток, полученных при иммунизации моделей (кроликов) прототипами моновакцин.

Ключевые слова: эшерихии, Escherichia coli, штамм, эпизоотические изо-ляты, патогенные биологические агенты, энтеробактерии, колибактериоз, иммуногенная активность, белые мыши, иммуногенность, вакцина.

Сведения об авторах:

Пименов Николай Васильевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»; 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23; e-mail: pimenov-nikolai@yandex.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Галиакбарова Алсу Анваровна, научный сотрудник отдела бактериологии ФГБУ «ВГНКИ», соискатель ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»; 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23; тел.: 8-915-0940959; e-mail: alsu.anvarovna.st@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей