Детекция ДНК эмерджентных инфекций, как инструмент мониторинга за распространением и циркуляцией Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium у крупного рогатого скота на территории Уральского региона

УДК 619:577.21:001.891.53:579:636.2
DOI 10.33861/2071-8020-2021-6-13-15

Безбородова Н.А., Порываева А.П., Шилова Е.Н., Кожуховская В.В., Красноперов А.С. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Уральский федеральный аграрный научно­-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук», г. Екатеринбург

Микоплазмоз крупного рогатого скота в XXI веке имеет яркие признаки эмерджентной инфекции, так как до этого боль­шинство европейских и североамериканских стран считались «свободными» от микоплазмоза. В настоящее время микоплазменная инфекция распространена по всему миру, ежегодно регистрируется до n-случаев заболевания микоплазмозом. Основными причинами, сдер­живающими оздоровление и защиту популяций крупного рогатого скота от микоплазмоза, является отсутствие эффективных вакцин и методов лечения, а также тенденция к увеличению устойчивости возбудителя к противомикробным препаратам [1, 11].

Виды Mycoplasma принадлежат к классу Mollicutes и характеризуют­ся небольшим размером генома [0,58-1,4 Mbp], низким содержанием G + C [23-40%] и отсутствием клеточной стенки. Это определяет их как простейшие и наименее самовоспроизводящиеся, и свободноживу- щие вне макроорганизма формы жизни [16].

Отсутствие клеточной стенки у микоплазм затрудняет распознава­ние этих патогенов иммунной системой животных, вследствие чего «им­мунный ответ» выражен слабо. Кроме того, большинство антибиотиков, которые действуют на клеточные стенки бактерии, в случае с возбудите­лями микоплазмоза не эффективны [9, 11].

Клинические формы микоплазмоза у животных варьируют от острых до латентных, бессимптомных и хронических [5]. Самым распростра­ненным клиническим проявлением микоплазмоза у коров является мастит, у молодняка - поражение дыхательных путей и суставов. Из­вестно, что некоторые виды микоплазм являются основными возбуди­телями болезней, другие же считаются сопутствующими и играют роль кофакторов в ассоциациях с бактериями и вирусами [3, 11, 15].

К наиболее распространенным клинически значимым видам от­носят двух основных возбудителей: Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium. Mycoplasma bovis считается наиболее опасным патоге­ном, поражающим верхние дыхательные пути, приводящим к пневмо­ниям, отитам, артритам, маститам, эндометритам и кератоконъюнкти­витам [11, 14, 16]. Mycoplasma bovis поражает все возрастные группы крупного рогатого скота и может сохраняться в стаде длительное время. Яцентюк С.П., Parker A.M., Haapala V. (2017-2018) отмечают, что возбу­дитель Mycoplasma bovis часто интродуцируется в закрытых и биобе- зопасных молочных стадах во время искусственного осеменения за счёт использования зараженной спермы, что в последствии приводит к вспышкам маститов [3, 12, 15]. В последнее время зарубежные ис­следователи отмечают, что в случаях пневмонии у коров и телят наблю­дался синергизм между Mycoplasma bovis и возбудителями семейства Pasteurellaceae, а также Mycoplasma bovis и M. haemolytica [9, 11].

Mycoplasma bovigenitalium вызывает маститы у коров, обнаружива­ется в репродуктивном тракте и часто ассоциирована с эндометритами, бесплодием, нарушением родовой деятельности [10, 11, 14]. Известно, что Mycoplasma bovigenitalium является возбудителем некротическо­го вульвовагинита у коров и, по мнению многих иностранных иссле­дователей, именно данное заболевание наносит наибольший ущерб сельскохозяйственным предприятиям. Так же, доказано, что наличие Mycoplasma bovigenitalium в сперме быков снижает подвижность спер­матозоидов [1, 11, 13].

Классическим лабораторным методом диагностики микоплазм является «культуральный метод» [1, 15]. Недостаток данного метода состоит в том, что питательные среды культивирования имеют достаточ­но сложный состав, культуры микоплазм растут медленно (7-10 дней), очень часто происходит подавление их роста другими бактериями. Идентификация микоплазм как кофакторов бактериально-вирусных ин­фекций этим методом очень сложна и, порой, невозможна [1, 5, 15].

В настоящее время для диагностики микоплазмозов широко приме­няется молекулярно-биологические методы - ПЦР с видоспецифичны­ми праймерами, которые позволяют выявлять ДНК патогена в различ­ных образцах биологического материала от животных [1, 2, 15].

Цель исследований - провести дифференциальный анализ выяв­ленных микоплазм от коров и телят с помощью ПЦР-диагностики на территории Уральского региона.

Материалы и методы исследований. Методом ПЦР в период 2019-2020 годов было исследовано 116 проб биоматериала от коров и телят из 13 сельскохозяйственных организаций Уральского региона. В качестве биоматериалов использовали: пробы молока, соскобы с влагалища у коров, кусочки плаценты, смывы с носоглотки телят, па­тологическим материалом стали пробы паренхиматозных органов от абортированных плодов, пораженные суставы от павших телят.

При проведении дифференциальных лабораторных исследова­ний использовали набор для выделения ДНК «Diatom DNA Prep 200» (компания ООО «ИзоГен», Москва), набор для определения «Chlamydia spp.» (компания ООО «ФакторМед», Москва), набор для определения видоспецифичных микоплазм у коров Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium (ООО «ИДС», Москва), комплект реагентов для идентифи­кации «С. pecorum», «С. abortus», «Mycoplasma spp.» крупного рогатого скота, инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота «Gen Pak DNA PSR Test BHV1» (компания ООО «ИзоГен», Москва), наборы для определения вируса диареи крупного рогатого скота (ООО «ИнтерЛаб- Сервис», Москва).

Амплификацию в режиме реального времени проводили с приме­нением оборудования Rotor-Gene 3000 (Corbett Life Science, Авста- ралия), QuantStudio 5 (США), термоциклера Appliede Biosystems 2720 (Сингапур).

Исследования выполнены в элекрофорезном варианте с примене­нием агарозного геля и мини-камеры Mini-Sub Cell GT (Bio-Rad, США) с визуализацией под ультрафиолетовым излучением в камере CHEMIDOC XRS+ с интерпретацией результатов с помощью гель-документации Gel Doc XR+ (Bio-Rad, США).

Результаты исследований и их обсуждение. Известно, что в норме микоплазмы обитают на слизистых оболочках респираторных и моче­половых органов животных, при снижении иммунной защиты организ­ма патоген размножается и колонизирует слизистые, что приводит к развитию инфекционного процесса. В большинстве случаев микоплаз­менная инфекция у животных протекает либо в субклинической, либо в латентной форме, что способствует развитию хронических воспали­тельных заболеваний репродуктивных органов у коров [5, 7]. В ранее проведенных нами исследованиях биопроб от крупного рогатого скота, содержащегося в хозяйствах Свердловской области (2018 год), были выявлены специфические участки ДНК только одного возбудителя ин­фекционного заболевания. Ассоциаций бактериальных и вирусных па­тогенов не наблюдалось. Наличие ДНК бактерий рода Mycoplasma spp. диагностировали в 7,6% случаев [5].

Клиническое проявление микоплазмоза, ассоциированного с Mycoplasma bovis, отмечали в молочных стадах у животных разного возраста. У телят проявлнение возбудителя отмечали в возрасте 1-1,5 месяцев при формировании смешанных групп (перегруппировке, пе­реводе в большие телятники). Течение данной инфекции характеризо­валось стойкими хроническими пневмониями, устойчивыми к анти­бактериальной терапии, в том числе, к использованию антибиотиков группы макролидов (тилозин, азитромицин). У телят также отмечались средние отиты (рисунок 1), полиартриты с преимущественным поражением запястных (рисунок 2), локтевых и скакательных суставов. У коров в данном стаде отмечали острые маститы с фибринозным или гангренозным поражением паренхиматозной ткани молочной железы, с тенденцией к дальнейшей хронизации воспалительного процесса.

Рис. 1. Односторонний отит у теленка, ассоциированный с Mycoplasma bovis (фотография Шиловой Е.Н.)

Рис. 2. Артрит запястного сустава у теленка, ассоциированный с Mycoplasma bovis (фотография Шиловой Е.Н.)

В период 2019-2020 годов количество положительных в ПЦР проб составило 17,2%. В биологических материалах от коров и телят были выявлены геномы Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium. ДНК Mycoplasma bovis выделена из биопроб синовиальной жидкости от телят, из смывов с носоглотки телят, соскобов с влагалища у коров и из гомогената паренхиматозных органов от абортированных плодов в 11,2% случаев. В исследованном биологическом материале геномы Mycoplasma bovigenitalium были обнаружены в смывах с носоглот­ки телят и соскобах с влагалища у коров (1,0%). Коинфицирование Mycoplasma bovis/M. bovigenitalium выявили в 2 образцах (смыв с носоглотки теленка, соскоб с влагалища у коровы).

Так же в одной из проб поступившего биоматериала (смывы с носоглотки телят) присутствовали ДНК Mycoplasma bovigenitalium и Chlamydophila pecorum, что говорит о наличии микст-инфекции. Сто­ит отметить, что в аналогичных пробах от телят из этой же сельскохо­зяйственной организации были обнаружены генетические материалы Chlamydophila pecorum и Bovine virus diarrhoea, что свидетельствует об активной циркуляции бактериальной и вирусной инфекции.

Во всех остальных исследуемых образцах биологических проб генетические материалы Chlamydia spp., Chlamydophila abortus, Chlamydophila pecorum, Bovine herpes virus (type 1) и Bovine virus diarrhoea отсутствовали.

При ретроспективном анализе результатов дифференциальной диагностики методом ПЦР было показано, что, несмотря на ветери­нарно-санитарные и зоогигиенические меры, некоторые из обсле­дованных хозяйств остаются неблагополучными по микоплазменной инфекции по настоящее время. Так, в 2019 году в биоматериалах, поступивших из одного такого хозяйства, специфические участки ДНК Mycoplasma bovis были выявлены в гомогенате паренхиматоз­ных органов от абортированных плодов, а также в синовиальной жид­кости пораженных суставов от павших 3-месячных телят (рисунок 3). В 2020 году при дифференциальной диагностике биологических проб, поступивших из этой же сельскохозяйственной организации, от телят в смывах со слизистых носовых ходов обнаружены два вида микоплазм - Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium. Необходимо подчерк­нуть, что во всех случаях результаты исследования образцов био­материала методом ПЦР на Chlamydophila pecorum, Chlamydophila abortus и Bovine herpes virus (type 1) были «отрицательными». Дан­ные диагностических исследований свидетельствуют о том, что среди молодняка и взрослого поголовья крупного рогатого скота происходит постоянная циркуляция двух видов микоплазм - Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium.

Рис. 3. Патологоанатомическое вскрытие правого коленного сустава трехмесячного теленка. Отбор проб биоматериала для ПЦР-диагностики микоплазменной инфекции (фотография Безбородовой А.Н.)

По мнению большинства исследователей, имеющих практиче­ский опыт в оздоровлении стад, для эрадикации возбудителя мико­плазмоза требуется длительное время. Инфекцию Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium практически невозможно идентифициро­вать на ранних стадиях заболевания, трудно контролировать, прежде всего, вследствие внутриклеточной природы патогена, его высокой генетической и антигенной изменчивости. Генетическая пластичность возбудителя, его способность к образованию биопленок обуславливает формирование резистентности у изолятов микоплазмы к противомик- робным препаратам, отсутствие клеточной стенки не дает возможность применять бактерицидные антибиотики.

Иммунобиологические препараты для вакцинопрофилактики мико- плазмозов крупного рогатого скота в настоящее время находятся в ста­дии разработки. Субклинический характер заболевания способствует распространению микоплазмы в стаде [9, 11].

Основными средствами, позволяющими проводить эффективное лечение крупного рогатого скота с манифестацией Mycoplasma bovis, является ограниченный спектр антибиотиков с бактериостатическим действием (тулатромицин, тилмикозин, препараты тетрациклинового ряда). Тем не менее, для снижения зависимости от антибиотиков, не­обходимо создавать «закрытые» стада с оптимальными параметрами биозащиты для предотвращения заноса возбудителей микоплазмоза из неблагополучных ферм.

Выводы и предложения. В результате проведенных ПЦР исследо­ваний на наличие микоплазменной инфекции в биологическом мате­риале (116 проб) от коров и телят были выявлены геномы Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium в 17,2% проб. В двух образцах биома­териалов (смыв с носоглотки теленка, соскоб с влагалища у коровы) при­сутствовало одновременно несколько видов микоплазм (Mycoplasma bovis + Mycoplasma bovigenitalium). В одной из проб (смывы с носо­глотки телят), поступившей на исследование, были обнаружены гено­мы Mycoplasma bovigenitalium + Chlamydophila pecorum, что говорит о микст-инфекции. При этом в биопробах, поступивших ранее, были обнаружены специфические участки Chlamydophila pecorum и Bovine virus diarrhoea.

Таким образом, анализ результатов исследований биологического материала за 2019-2020 годы методом ПЦР на видоспецифичную ми­коплазму показал, что в сельскохозяйственных организациях, находя­щихся на территории Уральского региона, на фоне циркуляции вирус­ных и бактериальных патогенов установлено наличие микоплазменных инфекций двух видов (Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium).

В связи с отсутствием эффективных вакцин против Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium важно проводить регулярный мони­торинг, скрининг для раннего выявления субклинических носителей в стадах крупного рогатого скота с использованием метода ПЦР для пре­дотвращения неконтролируемого распространения микоплазмозов [4, 6, 9, 11, 17]. В качестве профилактики и искоренения инфекции необ­ходимо проводить постоянную санитарную обработку ферм с исполь­зованием эффективных дезинфицирующих средств [8], использовать пастеризацию и термообработку молозива и сырого молока [12].

Исследования выполнены в рамках Государственного задания Минобрнауки России по теме 0532-2021-007 в отделе ветеринарно­лабораторной диагностики с испытательной лабораторией и в отделе мониторинга и прогнозирования инфекционных болезни ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН.

Список литературы:

1. Дифференциация Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, Mycoplasma californicum и выявление Ureaplasma diversum методом ПЦР в ре­альном времени/ А.Д. Козлова, Н.С. Горбачева, Р.Ф. Хаерова, М.С. Красникова// Сельскохозяйственная биология. 2019. Т. 54. № 2. С. 378-385.
2. Донник И.М., Шкуратова И.А. Молекулярно-генетические и иммунно-биохи­мические маркеры оценки здоровья сельскохозяйственных животных// Вестник Российской академии наук. 2017. Т. 87. № 4. С. 362-366.
3. Использование метода ПЦР для выявления возбудителей инфекционных бо­лезней в сперме крупного рогатого скота/ С.П. Яцентюк, Н.С. Горбачева, Е.А. Яра- лова, А.Д. Козлова// Russian Journal of Agricultural and Socio-Economic Sciences. 2017. № 10 (70). С. 331-337.
4. Колычев Н.М., Ощепков В.Г. Зоопатогенные бактерии и меры борьбы с ними: монография// Изд-во ОмГАУ. 2001. 632 с.
5. Полимеразная цепная реакция в диагностике латентных, бессимптомных и хронических форм инфекционных заболеваний крупного рогатого скота/ Н.А. Безбородова, В.В. Кожуховская, М.В. Петропавловский, О.Г. Томских// Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. 2019. № 4. С. 30-33.
6. Программы контроля инфекционных факторов, влияющих на репродук­тивную функцию высокопродуктивных молочных коров/ И.А. Шкуратова, Е.Н. Шилова, О.В. Соколова, М.В. Ряпосова// Ветеринария и кормление. 2020. № 2. С. 54-57.
7. Смирнова Л.И., Племяшов К.В., Темникова Л.В. Выделение и дифференциа­ция неферментирующих урогенитальных микоплазм от крупного рогатого скота// Ветеринария. 2008. № 8. С. 9-10.
8. Boddie R.L., Owens W.E., Ray C.H., Nickerson S.C., Boddie N.T. Germicidal activities of representatives of five different teat dip classes against three bovine mycoplasma species using a modified excised teat model// J. Dairy Sci. 2002. 85. pp. 1909-1912.
9. Calcutt M.J., Lysnyansky I., Sachse K., Fox L.K., Nicholas R.A. et al. Gap analysis of Mycoplasma bovis disease, diagnosis and control: an aid to identify future development requirements// Transbound Emerg Dis. 2018. 65. pp. 91-109.
10. Catania S., Tavella A., Gobbo F., Nicholas R.A. Isolation of Mycoplasma bovigenitalium from infertile dairy cattle// Veterinary Record Case Reports. 2014. 1 (2).
11. Dudek K., Nicholas R.A., Szacawa E., Bednarek D. Mycoplasma bovis Infections-Occurrence, Diagnosis and Control// Pathogens. 2020. 6 (8). pp. 640­645.
12. Haapala V., Pohjanvirta T., Vahanikkila N., Halkilahti J., Simonen H. et al. Semen as a source of Mycoplasma bovis mastitis in dairy herds// Veterinary Microbiology. 2018. 216. P. 60-66.
13. Hata E., Nagai K, Murakami K. Complete Genome Sequence of Mycoplasma bovigenitalium Strain HAZ 596 from a Bovine Vagina in Japan// Genome Announc. 2017. 5 (6).
14. Nicholas R.A., Fox L.K., Lysnyansky I. Mycoplasma mastitis in cattle: To cull or not to cull// Vet J. 2016. 216. pp. 142-147.
15. Parker A.M., House J.K., Hazelton M.S., Bosward K.L., Sheehy P.A. Comparison of culture and a multiplex probe PCR for identifying Mycoplasma species in bovine milk, semen and swab samples// PLoS ONE. 2017. 12 (3). pp. 1-14.
16. Timonen A.E., Autio T., Pohjanvirta T., Hakkinen L., Katholm J. et al. Dynamics of the within-herd prevalence of Mycoplasma bovis intramammary infection in endemically infected dairy herds// Vet Microbiol. 2020. 242.
17. Vahanikkila N., Pohjanvirta T., Haapala V., Simojoki H., Soveri T. et al. Characterisation of the course of Mycoplasma bovis infection in naturally infected dairy herds// Vet. Microbiol. 2019. 231. pp. 107-115.

Резюме. В данной статье проведен клинико-лабораторный анализ микро- плазменной инфекции у коров и телят в период 2019-2020 годов. Клиническое проявление видоспецифичного микоплазмоза отмечали в молочных стадах у жи­вотных разного возраста. У коров инфекция наблюдалась в виде острых маститов, у молодняка вызывала поражение дыхательных путей и суставов, проявлялась в виде отитов. Методами ПЦР было исследовано 116 биопроб от коров и телят из 13 сельскохозяйственных организаций Уральского региона. В результате ПЦР были выявлены геномы Mycoplasma bovis и Mycoplasma bovigenitalium в 17,2% проб. Mycoplasma bovis выделена из биоматериала синовиальной жидкости от телят, из смывов с носоглотки телят, соскобов с влагалища у коров и из паренхиматоз­ных органов от абортированных плодов в 11,2% случаев. Геномы Mycoplasma bovigenitalium были обнаружены в смывах с носоглотки телят и соскобах с вла­галища у коров (1,0%). В двух пробах (смыв с носоглотки теленка, соскоб с вла­галища у коровы) было обнаружено одновременное наличие генетического ма­териала нескольких микоплазм (Mycoplasma bovis + Mycoplasma bovigenitalium). А в одной из проб (смывы с носоглотки телят) были выявлены ДНК Mycoplasma bovigenitalium + Chlamydophila pecorum, что говорит о микст-инфекции. В пробах, поступивших ранее, были обнаружены геномы Chlamydophila pecorum и Bovine virus diarrhoea, что свидетельствует об активной циркуляции вирусно-бактериаль­ных патогенов на территории Уральского региона.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, телята, эмерджентные инфекции, микоплазменная инфекция, Mycoplasma bovis, Mycoplasma bovigenitalium, ге­ном, молекулярно-биологические методы, ПЦР-диагностика, инфекционный воз­будитель.

Сведения об авторах:

Порываева Антонина Павловна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»; 620142, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-922-1122095; e-mail: app1709@inbox.ru.

Шилова Евгения Николаевна., доктор ветеринарных наук старший научный сотрудник ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»; 620142, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2572044; e-mail: adelaida.gurgenovna@mail.ru.

Кожуховская Вероника Валентиновна, младший научный сотрудник ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»; 620142, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-950-6361400; e-mail: tetramegon@yandex.ru.

Красноперов Александр Сергеевич, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследова­тельский центр Уральского отделения Российской академии наук»; 620142, г. Ека­теринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-903-0833132; e-mail: marafon.86@list.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Безбородова Наталья Александ­ровна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Ураль­ского отделения Российской академии наук»; 620142, г. Екатеринбург, ул. Бе­линского, 112 а; тел.: 8-9049817214; e-mail: n-bezborodova@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей