Диагностика бешенства животных методом иммуноферментного анализа, сравнение прямого и непрямого сэндвич-варианта

Сухарьков А.Ю, Назаров Н.А., Метлин А.Е. ФГБУ ВНИИЗЖ

Бешенство - острая инфекционная болезнь животных и человека, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с летальным исходом. Бешенство регистрируется во многих странах мира, в том числе и в России.

Диагностика бешенства играет важную роль для оказания своевременной постэкспозиционной лечебной помощи людям и борьбы с бешенством среди животных [7]. Она должна быть быстрой и достоверной, так как это необходимо для оценки риска, который угрожает людям.

В настоящее время базовыми методами диагностики бешенства являются реакция иммунофлуоресценции (РИФ) и биологическая проба на мышах, а также выделение вируса на культуре клеток, постепенно заменяющее биологическую пробу на мышах [6]. Несмотря на высокую надежность и чувствительность этих методов, они имеют ряд недостатков. Основным недостатком биологической пробы на мышах и выделения вируса в культуре клеток является то, что для получения результатов исследования может потребоваться длительное время [11]. Точность постановки диагноза методом РИФ во многом зависит от наличия у персонала диагностических лабораторий необходимой квалификации. Кроме этого, для проведения диагностики с использованием этих методов, как правило, не годятся пробы с признаками частичного разложения мозговой ткани, в силу возможного получения лож-ноотрицательных результатов. Эти диагностические системы также малопригодны для широкомасштабного мониторинга бешенства. Перечисленных выше недостатков метод имму-ноферментного анализа (ИФА) не имеет. Этот метод в числе других рекомендован для диагностики бешенства Всемирной Организацией Здравоохранения (В0З) и Всемирной Организацией Охраны Здоровья Животных (OIE) [5]. Иммуноферментный анализ отличается простотой и быстротой выполнения, может обходиться без применения дорогостоящего оборудования в случае визуальной оценки результатов исследований. Он отлично подходит для проведения мониторинга бешенства, при этом позволяя интерпретировать полученные результаты с высокой степенью достоверности.

Ранее нами был разработан твердофазный непрямой сэндвич-вариант иммуноферментного анализа для диагностики бешенства животных, с использованием поликлональных антител, полученных на рибонуклеопротеин вируса бешенства [2]. Прямой сэндвич-вариант ИФА более быстрый по времени и менее затратный, чем непрямой.

Целью данной работы являлась разработка прямого сэндвич-варианта ИФА для диагностики бешенства и проведение сравнительных испытаний прямого и непрямого сэндвич-варианта ИФА.

Материалы и методы. Рибонуклеопротеин вируса бешенства (далее, РНП ВБ) выделяли из клеток ВНК-21, инфицированных вирусом бешенства (далее, ВБ), штамм ВНИИЗЖ, по методике, рекомендованной ВОЗ в руководстве "Лабораторная диагностика бешенства" [8]. Вирус бешенства, штамм ВНИИЗЖ, очищали и концентрировали из культурального вирусного сырья, инактивированного димером этиленимина [3]. Концентрацию белка в очищенных препаратах вируса и РНП вируса определяли по методу Лоури [9]. Степень чистоты полученных антигенов контролировали методом вертикального электрофореза в агарозном геле с додецилсульфатом натрия в денатурирующих условиях.

В качестве улавливающих использовали поликлональ-ные антитела к РНП ВБ, которые получали иммунизацией кроликов соответствующим антигеном. Очищенный РНП ВБ вводили животным внутримышечно три раза (0, 40, 54 дни) в дозе 400 мкг на голову.

В качестве детекторных использовали антирабические антитела морской свинки, которые получали иммунизацией животных очищенным ВБ. Антиген вводили животным внутримышечно четырехкратно в дозе 200 мкг на голову с интервалами в 1 неделю, 5 и 2 недели. При иммунизации морских свинок и кроликов первую инъекцию проводили с полным, а последующие - с неполным адъювантом Фрейнда "Sigma".

Через две недели после последней инъекции в сыворотках крови иммунизированных животных определяли титры специфических антител методом твердофазного непрямого варианта иммуноферментного анализа. Титровали с шагом три, начиная с разведения 1:1000. В дальнейшей работе использовали сыворотки крови с титрами антител к ВБ и РНП ВБ не ниже 1:243000. Из отобранных сывороток выделяли фракцию IgG методом трехкратного высаливания сульфатом аммония. Концентрацию белка в конечных препаратах определяли методом спектрофотомерии при длине волны 280 нм.

Поликлональные антирабические антитела морских свинок использовали для получения антирабического перокси-дазного коньюгата по методу Накане [4].

Для отмывки лунок планшетов от компонентов реакции использовали Трис-HCl буферный раствор с добавлением Tween-20 (ТБСТ).

В качестве субстрата для пероксидазы использовали ор-тофенилендиамин.

Для учета результатов непрямого сэндвич-варианта ИФА использовали антивидовой пероксидазный конъюгат к антителам морской свинки производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи (г. Москва) в разведении 1:1000.

Положительным контролем в ИФА служила инактивиро-ванная р-пропиолактоном [10] лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани кролика, инфицированного ВБ штамма CVS. В качестве отрицательного контроля использовалась лиофилизированная 20%-ная суспензия мозговой ткани неинфицированного кролика.

Исследуемые образцы (пробы ткани головного мозга животных) поступали в ФГБУ "ВНИИЗЖ" из разных региональных ветеринарных лабораторий. Поступивший биоматериал до использования хранили при минус 20°С. Образцы мозговой ткани для исследования готовили следующим образом. В пенициллиновый флакон с Трис - НС1 буферным раствором помещали кусочки ткани головного мозга из разных отделов (продолговатый мозг, мозжечок, аммоновы рога, кора больших полушарий) в количестве, необходимом для приготовления 30%-ной суспензии. Содержимое флакона тщательно гомогенизировали путем интенсивного встряхивания и подвергали однократному замораживанию. Далее пробу подвергали частичному размораживанию при комнатной температуре, и интенсивно встряхивали для более полной гомогенизации. Затем содержимое флакона переносили в пластиковую центрифужную пробирку с крышкой в объеме 1,5 мл и центрифугировали в течение 20 минут при 1000g. Для исследования использовали супернатант в цельном виде. Оставшийся в пенициллиновом флаконе материал хранили при минус 200С.

Кроме прямого сэндвич-варианта ИФА пробы исследовали методами РИФ [1] и непрямым сэндвич-вариантом ИФА [2]. При исследовании проб головного мозга в РИФ использовали ФИТЦ-иммуноглобулин производства ФГБУ "ВНИИЗЖ".

Результаты и обсуждение. Исследования проб в прямом сэндвич-варианте ИФА выполняли по следующей схеме.

Сенсибилизация планшетов. Для сенсибилизации планшетов в лунки вносили поликлональные кроличьи антитела к РНП ВБ по 100 мкл в лунку, разведенные в карбонатно-би-карбонатном буферном растворе (рН 9,5) до концентрации 5 мкг/мл, и инкубировали в течение 18-20 ч при 4°С. Сенсибилизированный планшет 3 раза отмывали ТБСТ.

Внесение исследуемых проб и контрольных препаратов. В лунки вертикального ряда по очереди в трех повторностях вносили положительный, отрицательный, безантигенный (промывочный буферный раствор) контроли и исследуемые пробы по 100 мкл в лунку. Планшет инкубировали 1 ч при 37°С и затем трижды отмывали промывочным буферным раствором.

Внесение пероксидазного антирабического конъюгата. Рабочее разведение антирабического конъюгата с перокси-дазой хрена готовили на ТБСТ с добавлением 5%-ной нормальной сыворотки лошади. В лунки планшета вносили по 100 мкл приготовленного коньюгата, инкубировали 1 ч при 37°С и отмывали 5 раз промывочным буферным раствором. Рабочее разведение антирабического пероксидазного конъюгата предварительно определяли в прямом сэндвич-варианте ИФА методом последовательных разведений, с использованием положительного и отрицательного контрольных препаратов, которое составило 1:1500.

Внесение субстрат-хроматогенной смеси. Раствор субстрат-хроматогена вносили по 100 мкл на лунку. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте, реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 3н H2SO4.

Учет результатов. Результаты реакции учитывали с помощью сканирующего спектрофотометра "BioRad PR 2100" при длине волны 490 нм. Определяли среднюю оптическую плотность (ОП) безантигенного, положительного и отрицательного контролей, а также среднюю ОП тестируемых образцов. После этого рассчитывали ОП тестируемых образцов, положительного и отрицательного контролей, вычитая среднюю ОП безантигенного ряда. Согласно рекомендациям ВОЗ, расчетная ОП (ОПр) отрицательного и положительного контролей должна быть не выше 0,1 и не ниже 1,5 единиц, соответственно. Исследуемые образцы считали положительными, если их ОПр превышала ОПр отрицательного контроля на 0,1 единицы [5].

Для оценки диагностической специфичности разработанного прямого сэндвич-варианта ИФА исследовали 30 проб головного мозга от разных животных, отрицательных по бешенству в РИФ. Расчетная оптическая плотность отрицательных проб составила 0,013±0,0004, что свидетельствует о высокой специфичности разработанного ИФА, которая в данном исследовании составила 100%.

С целью измерения предела чувствительности разработанного метода провели анализ с использованием РНП ВБ известной концентрации. Проведенные исследования показали, что предел чувствительности метода находится в диапазоне 15-30 нг/мл. При этом предел чувствительности непрямого сэндвич-варианта ИФА, разработанного нами ранее [2], составил такую же величину.

Для изучения эффективности диагностики бешенства разработанным прямым сэндвич-вариантом ИФА в сравнении с другими методами, в том числе и непрямым сэндвич-вариантом ИФА, было исследовано 100 проб головного мозга животных, направленных в ФГБУ "ВНИИЗЖ" для исследования на бешенство. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты исследований мозговой ткани животных, подозреваемых в заболевании бешенством, в прямом сэндвич-варианте ИФА, в сравнении с другими методами диагностики бешенства

Диагноз	Вид животного	РИФ	Прямой сэндвич-вариант ИФА		Непрямой сэндвич-вариант ИФА
			Положит.	Отрицат.	Положит.	Отрицат.
Положи­тельные	Волк	1	1	0	1	0
	Енот. собака	4	4	0	4	0
	Коза	2	2	0	2	0
	Кошка	4	4	0	4	0
	КРС	4	4	0	4	0
	Лисица	42	41	1	41	1
	Олень	3	3	0	3	0
	Собака	9	8	1	8	1
	Хорек	1	1	0	1	0
Отрицательные	Енот. собака	1	0	1	0	1
	Лисица	29	0	29	0	29
Всего		100	100		100

Из таблицы 1 видно, что результаты исследований в прямом и непрямом сэндвич-вариантах ИФА полностью совпали. При этом из 70 проб, положительных в РИФ, обоими методами было выявлено 68 проб, что составило 97,14 %. Две пробы 2008 года от собаки и лисицы оказались отрицательными. Получение в ИФА отрицательных результатов для положительных в РИФ проб связано с низкой концентрацией антигена ВБ в мозговой ткани, ниже предела чувствительности метода. Все пробы, отрицательные в РИФ, оказались так же отрицательными в обоих вариантах ИФА.

Следует отметить, что при проведении прямого сэндвич-варианта ИФА, в отличие от непрямого, не использовали этап блокирования лунок планшета после его сенсибилизации улавливающими антителами. В связи с этим разработанный вариант прямого сэндвич-варианта ИФА на два этапа (отсутствие блока и антивидового конъюгата) короче непрямого варианта, что дает выигрыш во времени и средствах, затраченных на проведение анализа, без снижения его эффективности. При этом использование в качестве улавливающих антител к РНП ВБ обеспечивает высокую диагностическую чувствительность и специфичность обоих методов ИФА.

Заключение. В результате проведенного исследования было установлено, что разработанный прямой сэндвич-вариант ИФА имеет такую же чувствительность и специфичность (97,14% и 100%, соответственно), как и ранее разработанный непрямой сэндвич-вариант ИФА. Предел чувствительности, как и в непрямом сэндвич-варианте, находился в диапазоне 15-30 нг/мл. Однако, разработанный прямой сэндвич-вариант ИФА в связи с уменьшением количества этапов быстрее и экономически более выгоден.

Список литературы

1. Диагностика бешенства животных с использованием реакции иммунофюоресценции: библиография / А.Е. Метлин, Н.А. Назаров, С.С. Рыбаков [и др.]. // Ветеринария. - 2006. - N° 2. - С. 20-23.
2. Разработка твердофазного непрямого сэндвич-варианта иммуно-ферментного анализа для диагностики бешенства животных / Н.А. Назаров, Н.М. Михайлина, С.С. Рыбаков [и др.] // Труды Федерального центра охраны здоровья животных - Владимир, 2006. - Т. 4 - С. 117-124.
3. Совершенствование метода очистки и концентрирования вируса бешенства / А.П. Пономарёв, Н.А. Назаров, С.С. Рыбаков [и др.] // Материалы междунар. конф. Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС, Крейтцфельда-Якоба и др. прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: тез. докл. - Покров, 2001. - С. 49-51.
4. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М. Егоров, А.П. Осипов, Б.Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова - М.: Высшая школа, 1991. - 288 с.
5. Bourhy, H., Perrin P. Rapid rabies enzyme immunodiagnosis (RREID) for rabies antigen detection // Laboratory techniques in rabies. - 4th ed. -Geneva: World Health Organization, 1996. - P. 105-113.
6. Meslin F.-X., Kaplan M.M. An overview of laboratory techniques in the diagnosis and prevention of rabies and in rabies research // Laboratory techniques in rabies. - 4th ed. - Geneva: World Health Organization, 1996. - P. 9-27.
7. Nandy S. Recent advancement in the diagnosis of rabies //Asian livestock. - 1994. - Vol. 19, N°11. - P. 150-152.
8. Perrin. P. Techniques for the preparation of rabies conjugates // Laboratory techniques in rabies. - 4th ed. - Geneva: World Health Organization, 1996. - P. 433-444.
9. Protein measurement with Folin phenol reagent / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr, R.J. Randall. // J. Biological Chemistry. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.
10. Singh H. р-Propiolactone-inactivated sheep brain vaccine // Laboratory techniques in rabies. - 4th ed. - Geneva: World Health Organization, 1996. - P. 234-242.
11. Webster W.A., Casey G.A. Virus isolation in neuroblastoma cell culture // Laboratory techniques in rabies. - 4th ed. - Geneva: World Health Organization, 1996. - P. 96-103.

Реферат

Разработан твердофазный прямой сэндвич-вариант иммунофер-ментного анализа для диагностики бешенства животных на основе поли-клональных антител к рибонуклеопротеину вируса бешенства и проведены сравнительные испытания прямого метода с непрямым сэндвич-вариантом иммуноферментного анализа, разработанным ранее. Испытание обоих методов показало сходство результатов в 100% случаев. Диагностическая чувствительность и специфичность составила, соответственно 97,14 % и 100 %. При равной диагностической ценности прямой сэндвич-вариант имеет преимущество над непрямым, как более экспрессный и менее затратный метод.

Ключевые слова: бешенство, рибонуклеопротеин вируса бешенства, диагностика бешенства, ИФА, головной мозг, антирабический пероксидаз-ный конъюгат.

Сведения об авторах

Назаров Николай Алексеевич, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ФГБУ "ВНИИЗЖ"; nazarov_na@arriah.ru.

Метлин Артём Евгеньевич, кандидат ветеринарных наук, заведующий лабораторией, ФГБУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ"); e-mail: metlin@arriah.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Сухарьков Андрей Юрьевич, аспирант, ведущий биолог ФГБУ "ВНИИЗЖ", andrey_33rus@mail.ru. 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец; тел./факс: (4922) 26-38-77, (4922) 26-06-14, (4922) 26-19-14.

UDC: 619:616.9:578.824.11: 57.083.3

DIAGNOSTICS OF ANIMAL RABIES BY ENZYME IMMUNOASSAY. COMPARISON OF DIRECT AND INDIRECT SANDWICH ELISA OPTIONS Sukharkov A.Yu., Nazarov N.A., Metlin A.E.

Summary

Diagnostics of rabies is important to provide timely post-exposure medical care for people and rabies control among animals. Currently, basic diagnostic methods of rabies are: reaction of immunofluorescence and biological test in mice, as well as virus isolation in cell culture. The main disadvantage of biological tests in mice and virus isolation in cell culture is duration of the study.

The authors have developed a direct sandwich ELISA option for diagnostics of rabies. Developed solid-phase direct sandwich enzyme immunoassay option for the diagnostics of animal rabies, based on polyclonal antibodies to rabies virus ribonucleoprotein, and comparative trials of the direct method with the indirect sandwich ELISA variant, previously developed. Probation of both methods showed similar results in 100% of cases. Diagnostic sensitivity and specificity was respectively 97,14% and 100%, respectively. In case of equal diagnostic value of direct sandwich option has an advantage over indirect, as more and express less costly method.

Key words: rabies, rabies virus ribonucleoprotein, diagnostics of rabies, ELISA, brain, rabies peroxidate conjugate.

References

1. Metlin A.E., Nazarov N.A., Rybakov S.S. Diagnostika beshenstva zhivotnykh s ispolzovaniem reaktsii immunofluorestsentsii: bibliografiya [Diagnostics of animal rabies using ELISA: bibliography]. - Veterinariya. - 2006. - pp. 20-23. - Print. (in Russ.).
2. Nazarov N.A., Mihaylina N.M., Rybakov S.S. Razrabotka tverdofaznogo nepryamogo sendvich-varianta immunofermentnogo analiza dlya diagnostiki beshenstva zhivotnykh [Development of solid-phase indirect sandwich ELISA options for the diagnostics of rabies]. - Vladimir (2006): pp. 117-124. - Print. (in Russ.).
3. Ponomaryov A.P., Nazarov N.A., Rybakov S.S. Sovershenstvovanie metoda ochistki i koncentrirovaniya virusa beshenstva [Improvement in the method of cleaning and concentration of rabies virus]. - Pokrov (2001): pp. 49-51. - Print. (in Russ.).
4. Egorov A.M., Osipov A.P., Dzantiev B.B., Gavrilova E.M. Teoriya i praktika immunofermentnogo analiza [Theory and practice of ELISA]. - Moscow (1991). - 288 p. - Print. (in Russ.).
5. - 10. Vide supra.

Author affiliation

Nazarov Nikolay A., Ph.D. in Biology, leading scientific researcher of the All-Russian Research Institute of Animal Health; e-mail: nazarov_na@arriah.ru.

Metlin Artem E., Ph.D. in Veterinary Medicine, laboratory manager of the All-Russian Research Institute of Animal Health (Federal Centre for Animal Health); e-mail: metlin@arriah.ru.

Responsible for correspondence with the editorial board:

Sukharkov Andrey Yu., postgraduate student, leading biologist of the All-Russian Research Institute of Animal Health; mcrd. Yurevets, Vladimir,

600901; phone: (4922) 26-38-77, (4922) 26-06-14, (4922) 26-19-14; e-mail: andrey_33rus@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей