Изменение функциональной активности гуморальных факторов неспецифического иммунитета карпа cyprinus carpio под влиянием антибактериального препарата и пробиотика

Гаврилин К.В. Московской ветеринорноя ихтиоклиника
Микряков Д.В., Силкина Н.И., Суворова Т.А. Институт
биологии внутренних вод им. ИД. Папанина РАН

Введение Поражение культивируемого в прудах карпа (Cyprinus carpio) подвижными аэромонадами является одной из основных составляющих эпизоотического неблагополучия рыбоводных хозяйств [10 12] Особенно остро данная проблема стоит в регионах с традиционно развитым прудовым карповодством. к которым относится и Краснодарский край.

В настоящее время мы можем наблюдать одновременное развития сразу двух основных направлений борьбы с аэромонозом Это классические методы борьбы с бактериозами культивируемых животных путем введения различных веществ, обладающих антибактериальной активностью, и неспецифическая иммунопрофилактика с применением пробиотиков.

Специалисты, работающие в сфере аквакультуры широко обсуждают достоинства и недостатки обоих групп методов. Одним из наиболее часто затрагиваемых вопросов является влияние антибактериальных и пробиотических препаратов на иммунный статус рыб Превалирующим является мнение что антибактериальные средства, в т.ч. и на основе ципрофлоксацина. являются мощными иммуносупрессорами в противоположность активным иммуностимуляторам - пробиотикам особенно на основе сенной палочки Bacillus subtilis [1. 13]. При этом экспериментальные данные по влиянию антибактериальных препаратов и пробиотиков на различные факторы иммунитета носят разрозненный и не всегда доказательный характер.

Учитывая большую практическую и теоретическую значимость этого вопроса, мы провели ряд исследований, направленных на комплексную оценку влияния антибактериального препарата на основе ципрофлоксацина Антибак 100 для карповых рыб (ООО "НВЦ Агроветзащита". г Москва) и пробиотика на основе Bacillus subtilis СУБ-ПРО (ООО "Вектор-Евро", г. Москва) на гуморальные факторы неспецифического иммунитета рыб.

Общеизвестно, что сыворотка крови животных, в том числе и рыб. обладает выраженными антимикробными свойствами Бактерицидная активность сыворотки крови является интегрированным выражением противомикробных свойств гуморального звена неспецифического иммунитета; лизоцима комплемента, пропердина. протеаз. С-реактивного белка, агглютининов преципитинов и т.д. [4.5].

Показано, что при инфекционных токсических и аутоиммунных болезнях у человека и животных появляются иммунные комплексы (ИК). Установлено что в кровяном русле почти постоянно присутствует широкий спектр ИК. в том числе и неспецифических [7]. ИК формируются в результате взаимодействия антигена и антитела образование которых является фазой нормального иммунного ответа организма, направленного на поддержание постоянства внутренней среды. ИК играют важную роль в регуляции иммунного ответа. Однако в случае длительного пребывания ИК в организме и несвоевременного удаления их из русла крови они вызывают супрессию иммунных реакций и обуславливают развитие не контролируемого иммуннокомлексного патологического процесса. Идентификация образования ИК в живых организмах свидетельствует о дисбалансе в системе клеточного и гуморального иммунитета и о непрерывном или хроническом попадании в русло крови чужеродных раздражителей, приводящих к нарушению постоянства внутренней среды.

В связи с вышеизложенным в качестве показателей демонстрирующих состояние гуморального иммунитета рыб выбраны бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК) и количество циркулирующих неспецифических ИК.

Материалы и методы. Работы были проведены в лаборатории иммунологии Института биологии внутренних вод РАН. (Ярославская область) в 2009-2010 гг. Объектом исследования служили клинически здоровые двухлетки карпа средней массой 150±10 г доставленные из ООО "Рыбхоз Нарские острова". Московская область.

Рыб для адаптации к новым условиям в течение 21 суток содержали в бассейне, в начале серии экспериментов рассаживали в аквариумы объёмом 200 л. В емкостях была обеспечена аэрация и механическая фильтрация воды Температура в течение опытов колебалась не значительно и составляла 18±1 5° С Основные гидрохимические параметры соответствовали рыбохозяйственным нормативам [8. 9].

Из карпов сформировали 8 равноценных групп по 15 экз. и поместили в отдельные аквариумы Параллельно отобрали еще 5 экз. для исследования первоначального уровня БАСК и ИК (группа К).

Группу N°1 содержали в аквариуме и через 3. 7 и 14 суток отбирали по 5 рыб для иммунологических исследований, с целью контроля возможных спонтанных изменений уровня БАСК и ИК.

Группу N°2 иммунизировали путём внутрибрюшинной инъекции 1 млрд. микробных тел на особь агаровой культуры Aeromonas hydrophila С целью контроля потенциала рыб формировать неспецифический иммунный ответ на введение антигена на 3, 7 и 14 сутки отбирали пробы.

Инъецирование бактериальной суспензией не вызвало появления характерной для аэромоноза клинической картины и гибели рыб Исключение составили четыре особи с незначительным покраснением брюшка, случайным образом распределившиеся по группам. Таким образом, можно утверждать, что LD50 для данного штамма в его состоянии на момент использования значительно более 1 х 109 микробных клеток на особь. Согласно классификации предложенной зарубежными исследователями. [15] все штаммы LD50 которых выше или равно 1 х 107 микробных клеток относятся к авирулентным Следовательно речь идет о вакцинации, а не об экспериментальном аэромонозе.

Группу N°3 согласно действующей инструкции прокармливали Антибаком 100 в дозе 0.5 г/кг живой массы в сутки пять суток подряд. На 1. 3 и 7 сутки после окончания кормления отбирали по 5 экз. для исследования Учитывали влияние антибактериального препарата на неспецифический иммунитет интактных рыб.

Группу N°4 иммунизировали (аналогично группе N°2) перед началом кормления с Антибаком 100 (согласно инструкции), а группу N°5 сразу после завершения кормления. Пробы из группы N°4 также отбирали на 1. 3 и 7 сутки после окончания кормления, а из группы N°5 на 3 и 7 сутки после кормления (2 и 6 сутки после введения антигена). Таким образом оценивали влияние Антибака 100 на способность рыб формировать неспецифический иммунитет в ответ на введение антигена.

Аналогично поступали с группами N°N° 6 7 и 8 только кормление осуществляли кормом с СУБ-ПРО. Препарат вводили согласно действующей инструкции в дозе 100 г препарата на тонну комбикорма пять дней подряд (норма кормления составляла 5% от общей живой массы)

Комбикорма с препаратами изготавливали в лабораторных условиях, на основе полноценного гранулированного корма для декоративных прудовых рыб Tetra Pond. На гранулы наносили желатиновую суспензию препарата с последующим их подсушиванием. Такой метод приготовления кормов и их быстрая поедаемость (в течение нескольких минут), практически исключал потерю препаратов за счет их вымывания в воду.

Для испытания были закуплены серийные партии обоих препаратов Антибак 100 для карповых рыб серия 020809. годен до августа 2011 г. СУБ-ПРО серия 00409. изготовленного 20.04. 2009 г.

Бактерицидную активность сыворотки крови определяли с помощью фотонефелометрического колориметрирования согласно методике, описанной О.В. Смирновой и ТА. Кузьминой [11]. адаптированной для рыб [6].

Неспецифические ИК изучали в сыворотке крови по Гриневич Алферову (1981) [4].

Результаты исследований подвергали статистической обработке при помощи стандартного пакета программ (приложение Statistica) с использованием t-теста при уровне значимости 0.05.

Результаты исследований. Уровень БАСК до начала формирования опытных групп составил 10.80±0.91. а ИК -12.06±0.16 (группа К). Остальные, полученные в ходе эксперимента, результаты представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Динамика изменения БАСК и ИК в интактной и вакцинированной группах рыб, не подвергавшихся действию препаратов

Группа	БАСК, %
	3 суток	7 суток	14 суток
Группа N°1	10.85±0.64	10.50±0.92	10.95±0.87
Группа N°2	17.00±1.87*	14.74±0.18*	11.50±1.25
ИК ус. ед.
Группа N°1	12.30±0.18	12.15±0.14	12.50±0.20
Группа N°2	21.02±0.56*	15.88±0.51*	14.57±0.23*

Таблица 2. Динамика изменения БАСК и ИК в вакцинированных и интактных группах рыб.

Уровень БАСК колебался в пределах ошибки метода от 10.80±0.91 до начала формирования групп до 10.95±0.87 на 14 сутки к концу эксперимента. Аналогичные результаты получены и при изучении уровня ИК До начала экспериментов он составлял 12.06±0 16 в конце 12.50±0.20. Это свидетельствовало о стабильности условий содержания рыб и практическом отсутствии факторов способных значительно влиять на учитываемые показатели.

Вакцинированные рыбы продемонстрировали нормальный иммунный ответ на введение антигена Достигнув максимума на 3 сутки после вакцинации (17.00il.87). показатели БАСК постепенно снизились и к 14 суткам остались на уровнях, несколько превышающих аналогичные показатели в контрольной группе (N°1). Полученные данные согласуются со схемой иммунного ответа рыб на введение антигена, описанной в литературных источниках [5. 14]. Содержание ИК также повысилось вначале наблюдения (21.02i0.56). а потом постепенно падало. Первоначальное повышение и последующее снижение содержания ИК указывает на нормальную реакцию иммунной системы на бактериальный антиген: обнаружение, нейтрализацию и выведение из организма.

Сравнивая уровни БАСК по группам N°N° 1. 3 и 6. можно проанализировать иммуногенную эффективность сопоставляемых препаратов. Антибак 100 и СУБ-ПРО положительно влияли на неспецифический иммунитет карпа, однако влияние было достаточно кратковременным. Уровень БАСК достигнул максимума в случае СУБ-ПРО на 1 сутки после кормления, а Антибака 100 к 3 суткам затем показатели во всех группах постепенно снижались хотя, даже к 7 суткам после завершения введения препарата, достоверно превышали контрольные (группа N°1)

При сопоставлении иммуногенной активности СУБ-ПРО и Антибака 100 очевидно преимущество последнего Уровень БАСК в группе рыб. прокормленной Антибаком 100. во все дни исследования был достоверно выше аналогичного показателя из группы, получавшей СУБ-ПРО.

Содержание ИК менялось в зависимости от применяемого препарата. Если при кормлении Антибаком 100 уровень иммунных комплексов у рыб снижался и на 3 сут даже был ниже, чем контрольных особей из группы 1, то у таковых в присутствии СУБ-ПРО - возрастал.

Результаты изучения иммуногенной активности Антибака 100 совпали с теоретически ожидаемыми. В литературных источниках имеются сообщения о способности ципрофлоксацина оказывать неспецифическое стимулирующее действие на иммунную систему теплокровных животных [2]. Имеются данные о положительном влиянии ципрофлоксацина и на иммунную систему рыб. полученные при лечении бактериальной геморрагической септицемии карпов кои [3]. Через 4 суток ципрофлоксацин полностью выводиться из организма рыб и показатель напряженности иммунитета в условиях отсутствия стимулирующего агента снижается Об иммуностимулирующем действии Антибака 100 также свидетельствует снижение содержания ИК в крови испытуемых рыб.

По-другому дело обстоит при анализе данных, полученных при исследовании группы, прокормленной СУБ-ПРО. Согласно общепринятым представлениям, механизм действия проби-отика заключается в колонизации кишечника рыбы полезными микроорганизмами которые за счет комплексного положительного влияния, повышают напряженность противоинфекцион-ного иммунитета Однако вместо ожидаемого длительного эффекта, иммуностимулирующее действие СУБ-ПРО оказалось даже короче, чем у Антибака 100 (максимальные значения уровня БАСК на 1 и 3 сутки соответственно, с последующим снижением). Кроме того, повышение уровня ИК на 3 и 7 сутки свидетельствует о супресии иммунологических реакций.

Для анализа иммуногенной эффективности препаратов в условиях антигенной нагрузки на организм рыб. в качестве контроля мы использовали результаты, полученные при иммунизации рыб, не подвергавшихся воздействию препаратов (группа N°2).

Антибак 100 оказал положительное влияние на уровень БАСК при введении антигена, как до начала кормления так и после него Если у рыб. не подвергавшихся действию препарата, максимальный уровень БАСК составил 17.СО±1.87. то у вакцинированных до кормления Антибаком -19.18±0.48 и 31.80±3.38 у вакцинированных после кормления. Уровень БАСК во все дни исследования превосходил таковой в группе N°2

Содержание ИК в сыворотки крови карпов, иммунизированных перед началом кормления указывает на положительный эффект воздействия Антибака 100: показатели ИК у опытных рыб были не только ниже, чем у интактных рыб из группы 2. но и постепенно снижались. В то же время количественные показатели ИК у особей вакцинированных после кормления были выше, чем у карпов 2 и 4 групп, что говорит об отсутствии положительного результата в проявлении нормального иммунологического ответа.

СУБ-ПРО, наоборот, оказывал отрицательное влияние на формирование неспецифического иммунного ответа на антиген. Максимальные уровни БАСК были ниже аналогичного показателя в вакцинированной группе, не подвергавшейся действию препаратов (N°2) на 19.4 % при введении антигена до кормления и на 27.2% после кормления. О супрессии иммунологических реакций также свидетельствуют повышенные уровни ИК на 1 и 3 сут наблюдения в присутствии СУБ-ПРО. Однако стоит отметить, что на 7 сут наблюдения содержание ИК в 7 и 8 группах значительно снижалось, что характеризует стимуляцию иммунологических реакций и обуславливает торможение неконтролируемого иммунопатологического состояния в присутствии патогенных аэромонад Анализируя полученные показатели БАСК и ИК после кормления СУБ-ПРО можно отметить, что исследуемый пробиотик начинал оказывать незначительное положительное влияние на гуморальные факторы неспецифического иммунитета к концу эксперимента. Вполне возможно, что СУБ-ПРО повышает иммунный статус рыб не сразу, а через неделю после применения, но для этого требуются дополнительные исследования.

Из материалов исследований следует, что иммунная система карпов на введение исследуемых препаратов отвечает изменением общей функциональной активности гуморальных факторов неспецифического иммунитета Во всех вариантах опыта после применения препарата Антибак 100 показатели БАСК повышаются тогда, как препарат СУБ-ПРО оказал положительное воздействие только на БАСК у интактных рыб. Полученные результаты позволяют предположить, что под влиянием препарата Антибак 100 активируется функция структур, ответственных за синтез врожденных факторов естественного иммунитета. Такой вывод подтверждают также результаты изучения образования ИК в крови рыб: в присутствии Антибака 100 снижается содержание иммунных комплексов у карпов получающих препарат перед началом кормления т.е. наблюдается нормализация баланса в системе клеточного и гуморального иммунитета. Кормление же рыб препаратом СУБ-ПРО. наоборот вначале вызывает супрессию иммунного ответа.

Заключение. Препарат Антибак 100 сильнее стимулирует формирование неспецифического иммунитета у рыб. по сравнению с препаратом СУБ-ПРО.

Препарат Антибак 100 усиливает неспецифический иммунный ответ на бактериальный антиген, как до так и после применения препарата.

Препарат СУБ-ПРО оказывает отрицательное влияние на гуморальные факторы неспецифического иммунитета при введении бактериального антигена.

Без проведения комплексных иммунологических исследований утверждать, что любой пробиотик является иммуностимулятором, а антибиотик иммуносупрессором нельзя Это необходимо учитывать при разработке методов и выборе средств борьбы со всеми бактериозами рыб и аэромонозом в частности.

Список литературы

1. Бычкова ЛИ. Юхименко Л.Н.. Ходак А.Г. Скоробогатько О.С. Пробиотический препарат СУБ-ПРО (субалин) - альтернатива антибиотикам // Рыбоводство. - 2008. N2. С. 48 - 49.
2. Виолин Б.В. Абрамов В.Е.. Ковалев ВФ Химиотерапия при бактериальных и паразитарных болезнях // Ветеринария 2001. N°1. С. 42-46.
3. Гаврилин КВ. Опыт борьбы с бактериальной геморрагической септицемией (БГС) в условиях декоративной аквариумистики // Мат-лы межд. науч -практ. конф. молодых ученых "Проблемы аквакультуры и функционирования водных экосистем". Киев. 2002. С 147-149.
4. Гриневич Ю.А Алферов А. Н. Определение иммунных комплексов в крови онкологических больных. - Лабор. дело.1981.1Ч 8.С.493-496.
5. Лукьяненко В.И. 1989. Иммунобиология рыб: Врожденный иммунитет М 272 с.
6. Микряков В.Р. Закономерности формирования приобретенного иммунитета у рыб. Рыбинск: ИБВВ РАН. 1991. 153 с.
7. Насонов Е Л Иммунные комплексы при ревматических заболеваниях. Итоги науки и техники: ВИНИТИ. Сер.иммунология 1984. т. 12. с.104-158.
8. Отраслевой стандарт. Охрана природы. Гидросфера. Вода для прудовых форелевых и карповых хозяйств. Общие требования ОСТ 15.282-83.
9. Отраслевой стандарт. Показатели качества воды прудовых хозяйств. ОСТ 15.247-81
10. Рудиков НИ . Грищенко ЛИ Микрофлора и бактериальные болезни рыб//Ихтиология (Итоги науки и техники) М.: ВИНИТИ. 1985. Т.1. С. 93-160.
11. Смирнова О.В.. Кузьмина Т.А. Определение бактерицидной активности сыворотки методом нефелометрии // Журн мик-робиол 1966. N° 4. С. 8-11.
12. Справочник по болезням рыб (под ред Осетрова B.C.). М.: Колос. 1978. 350 с
13. Юхименко Л.Н Бычкова Л.И.. Пименов А В . Литов А.В.. Лукьянова НА. Климов АВ. Белобородова М.Н Альтернатива антибактериальным препаратам в аквакультуре // Рыбоводство. 2008. N3-4. С. 38-39.
14. Anderson PD Diseases offish Book 4 // Fish immunology (eds Snieszko S F Axelrod R H.) - Neptune city T.F.H. Publication 1974. 239 p.
15. Lalher R.. Mittal K.R.. Leblanc D.. LaLonde G.. Oliver G. Rapid methods for the differentiation of virulent and non-virulent Aeromonas hydrophila strains // Serodiagn. and vaccines. Leetovvn 1981. P. 119-123.

Реферат

Исследовано влияние Антибака 100 для карповых рыб и СУБ-ПРО на бактерицидную активность сыворотки крови (БАСК) и уровень иммунных комплексов (ИК) карпа Cyprinus сагрю. Антибак 100 повышает уровень напряженности неспецифического иммунитета карпа. Отмечено положительное влияние на интактных и вакцинированных рыб. СУБ-ПРО увеличивает напряженность неспецифического иммунитета только у интактных рыб. При введении рыбам антигена он оказывает отрицательное влияние на формирование неспецифического иммунного ответа

Ключевые слова: карп, иммунитет. БАСК. ИК. Антибак. СУБ-ПРО

Summary

The effect of Antibak 100. for cyprinid fish, and SUB-PRO on bactericidal activity of blood serum (BABS) and immunity complex (1С) of carp Cyprinus carpio are investigated. The level of intensity nonspecific immunity carp are increase by Antibak 100. Register the positive effect of intact and vaccine fish SUB-PRO are increase of intensity nonspecific immunity of intact fish. When introduction antigen SUB-PRO are negative influence on formed nonspecific immunity response

Key words: carp, immunity. BABS 1С Antibak. SUB-PRO

Сведения об авторах

Ответственный за переписку с редакцией: Кирилл Владимирович Гаврилин, к.б.н., врач-ихтиопатолог, Московская ветеринарная ихтиоклиника. 129329 г. Москва ул. Кольская д 1, (495) 648-26-26, E-mail: flsh@vetmag.ru;

Даниил Вениаминович Микряков. к.б.н зав лабораторией.

Нина Иосифовна Силкина к.б.н. с.н.с.

Татьяна Александровна Суворова, аспирант. Институт биологии внутренних вод им. ИД. Папанина РАН. 152742 Ярославская область Некоузский р-н. пос. Борок. (485)4724681 E-mail daniil@ibiw.yaroslavl.ru

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей