Отработка условий хранения штаммов бактерий рода Aeromonas для формирования отраслевой исследовательской коллекции

УДК: 619:579.6:639.2.09
DOI 10/33861/2071-8020-2024-5-48-51

Токарева С. Б., Романова Н. Н., Сехина О. В., Кудинов П. В. Филиал по пресноводному рыбному хозяйству
Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научноисследовательский
институт рыбного хозяйства и океанографии» , Московская область, пос. Рыбное
Калошкина И. М. государственное казенное учреждение Краснодарского края «Краснодарская станция
по борьбе с болезнями животных», г. Краснодар

Создание и сохранение коллекции патогенных бактерий имеет важное научное и практическое значение для изучения возбудителей и диагностики болезней, для оценки эпизоотического состояния рыбоводных хозяйств и природных водоемов.

Практикуемым во многих ихтиопатологических лабораториях рыбохозяйственных научно-исследовательских институтов методом хранения штаммов бактерий является субкультивирование. Этот традиционный, достаточно простой метод поддержания и сохранения бактериальных культур позволяет контролировать чистоту штаммов, однако обеспечивает сохранность микроорганизмов в течение непродолжительного срока. Недостатками метода являются необходимость соблюдения сроков пересевов, потребность в большом количестве лабораторной посуды, питательных сред, значительные затраты времени, риск загрязнения культуры.

В настоящее время в ветеринарии и медицине разработаны эффективные методы долгосрочного хранения большого количества микроорганизмов, обеспечивающие сохранение их жизнеспособности, генетическую и фенотипическую стабильность [2]. В основе всех методов консервации, предлагаемых на сегодняшний день, лежит перевод клеток в состояние анабиоза, что ведет к снижению или прекращению всех метаболических процессов. В большинстве коллекций микроорганизмов используют методы лиофилизации, низкотемпературного замораживания и криоконсервации. Однако есть и недостатки у этих методов, например, титр жизнеспособных клеток микроорганизмов в результате лиофилизации часто оказывается низким. Многие неспорообразующие микроорганизмы не переносят используемые режимы лиофилизации и не могут храниться этим способом. У лиофилизированных культур гораздо чаще, чем у замороженных, наблюдаются генетические и морфологические изменения, повреждения ферментных систем, ДНК, нарушения проницаемости клеточных мембран.

В научно-исследовательской работе по отработке способов долгосрочного хранения бактерий р. Aeromonas - возбудителей аэромоноза объектов аквакультуры использовали замора живание при различных температурных режимах и хранение в охлажденном состоянии в столбике полужидкого агара под слоем стерильного минерального (вазелинового) масла. Род Aeromonas - сложная в таксономическом отношении группа бактерий. Первоначально данный род относили к семейству Vibrionaceae [4]. Позже с помощью метода молекулярной гибридизации было установлено, что Aeromonas не имеют родства с вибрионами и выделены в самостоятельное семейство Aeromonadaceae [1, 11]. В настоящий момент род Aeromonas объединяет в себе 45 видов [6].

Для формирования отраслевой коллекции патогенов рыбохозяйственных научно-исследовательских институтов на первом этапе актуальной является отработка эффективных способов долгосрочного хранения патогенов. Закладываемые на хранение патогены должны длительное время сохранять жизнеспособность и свойства и при необходимости их использования подвергаться быстрому восстановлению.

Целью исследований является отработка условий хранения штаммов бактерий р. Aeromonas для формирования отраслевой исследовательской коллекции.

Материалы и методы исследований. Для экспериментальных работ по долгосрочному хранению и установлению наиболее эффективного метода хранения патогенных бактерий при формировании отраслевой коллекции были отобраны три полевых штамма - Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii и Aeromonas salmonicida. Эти бактерии являются возбудителями высококонтагиозных бактериальных болезней - аэромоноза, бактериальной геморрагической септицемии и фурункулеза.

Штаммы бактерий были выделены от рыб из рыбоводных хозяйств Московской и Тверской областей в 2021-2023 гг. При подготовке штаммов проверяли чистоту культуры, ростовые, видовые и биохимические свойства аэромонад, их патогенность (ДНКазную активность) на ДНК-тест агаре (HIMEDIA). Культуры аэромонад с зоной деполимеризации до 2 мм являются слабовирулентными, 2-4 мм - вирулентными, более 4 мм - высоковирулентными [5,8].

На период закладки на хранения у штаммов бактерий Aeromonas hydrophila (выделенных из печени карпа) и Aeromonas veronii (из почек белого амура) ДНКазная активность составляла 3,0 мм, у штамма Aeromonas salmonicida (из кишечника радужной форели) - 1,0 мм.

Для каждого штамма были определены четыре температурных режима хранения (табл. 1).

Таблица 1 Условия хранения в эксперименте по подбору метода, обеспечивающего сохранность видовых и патогенных свойств бактерий р. Aeromonas

Условия хранения	t хранения, °С	Место хранения
Криоконсервация в атмосфере сжижен­ного азота	-196	сосуд Дьюара
Замораживание при ультранизкой температуре	-80	низкотемператур­ный морозильник Bio Ultra UL570
Замораживание	-18	бытовой морозиль­ник
Охлаждение	+ 4 - +8	фармацевтический холодильник «Pozis»
Цвет слизистых	Синюшные	Бледные

Подготовленную бактериальную смесь в защитной среде разливали по 0,6 мл в стерильные микропробирки вместимостью 1,5 мл с завинчивающимися крышками с уплотнительным кольцом из полипропилена.

Разлив культур для каждого режима замораживания провели в трех повторностях (пробирках) с учетом проведения промежуточных этапов проверки жизнеспособности аэромонад.

Особенности проведения работ по отработке условий хранения бактерий р. Aeromonas:

• при замораживании культур и хранении при -18°С использовали защитную среду с криопротектором ДМСО;
• при тестировании жизнеспособности размороженных культур при переносе на свежий питательный агар к содержимому одной из трех пробирок (для каждого штамма) добавляли такой же объем стерильного физраствора (37°С) для устранения негативного воздействия на микробные клетки ДМСО, обладающего, в числе прочих, бактериостатическими свойствами.

После заполнения укупоренные и маркированные микропробирки с культурами аэромонад в защитной среде помещали в штативы и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре в соответствии с методами, описанными И.В. Грачевой и А.В. Осина [3].

По литературным данным наилучшие результаты по выживанию и восстановлению бактериальных культур были получены в случае медленного охлаждения клеток, например, со скоростью 1°С/мин [7]. Медленного охлаждения проб для хранения в жидком азоте добивались следующим путем: микропробирки с культурами в лотке из нержавеющей стали помещали на 1 ч в морозильник при температуре -80°С, затем погружали их на 5 мин в баню с жидким азотом. Скорость охлаждения при этом составляет приблизительно 1,5°С/мин [7]. После этого пробы помещали на хранение при температуре -196 °С в сосуд Дьюара с жидким азотом.

Штативы с пробирками, подлежащими хранению при температурах -80°С и -18°С, после экспозиции в течение 30 минут при комнатной температуре помещали на постоянное хранение в низкотемпературный морозильник и бытовой морозильник соответственно. На протяжении всего периода хранения культур ежедневно осуществляли контроль температурных режимов.

Аэромонады, подлежащие хранению в полужидком питательном агаре, выращивали на скошенном эритритагаре при температуре 28°С в течение суток, засевали в лабораторные пробирки с ватно-марлевыми пробками со столбиком стерильного полужидкого агара 0,4% (питательный бульон ГРМ, агар бактериологический) и инкубировали при температуре 28°С в течение 24 ч. Затем в пробирки с выросшими культурами вносили стерильное вазелиновое масло слоем 0,5 см на поверхность столбика среды и помещали в холодильник на постоянное хранение при температуре +4 - +8°С.

Проведено исследование жизнеспособности бактерий через 40 суток, для чего с каждого режима хранения были сняты по 3 пробирки.

Быстрое нагревание замороженных микроорганизмов при оттаивании приводит к их быстрому восстановлению [7]. Для их оживления замороженные культуры в полипропиленовых пробирках быстро оттаивали на водяной бане при температуре 37°С при слабом встряхивании, пока не растает весь лед - в течение 60-120 с. Сразу же после оттаивания пробирки извлекали из водяной бани, дезинфицировали 70% этанолом, вскрывали и в стерильных условиях переносили весь объем культуры (0,6 мл) на поверхность эритритагара в чашках, распределяя по поверхности среды покачиванием. Инкубировали чашки с культурами при температуре 28°С.

Через 24 часа проводили оценку бактериального роста на чашках, проверку видовых свойств и биохимической активности культур аэромонад на первично-дифференцирующем агаре Кли-глера и проверку вирулентности (патогенности, ДНКазной активности) - на ДНК-тест агаре.

Результаты. В результате проверки жизнеспособности бактерий и их вирулентности (патогенности) после 40 дней от закладки на хранения выявили, что виды р. Aeromonas не одинаково реагируют на испытуемые условия.

У Aeromonas hydrophila за период хранения вирулентные свойства не снизились, но интенсивность роста на агаровой среде после размораживания уменьшилась. У культуры бактерий, хранившейся при охлаждении (+4 - +8°C), сохранялся обильный рост при пересеве на агар.

У Aeromonas veronii во всех вариантах режимов хранения наблюдали снижение вирулентных свойств. Обильный рост на агаре при проверке жизнеспособности наблюдали у культуры, хранящейся в атмосфере сжиженного азота (t= -196°С) и в условиях охлаждения.

У Aeromonas salmonicida лучшие результаты выживаемости культуры получены в условиях криоконсервации (t= -196°C), замораживании при ультранизкой температуре (t= -80°C) и при t= -18°C. При хранении в условиях температур +4 - +8°C вирулентные свойства аэромонады были утрачены.

Результаты по отработке условий хранения штаммов - бактерий для формирования отраслевой исследовательской коллекции представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты по оценке эффективности условий хранения бактерий рода Aeromonas через 40 суток

Условия хра­нения	Рост на питательной среде (эритритагар), % проб / ДНКазная активность, зона деполимеризации ДНК
	Aeromonas hydrophila	Aeromonas veronii	Aeromonas salmonicida
Криоконсерва­ция в атмосфе­ре сжиженного азота (t= -196°С)	100% - умеренный рост* / 3,0 мм	100% - обиль­ный - сливной рост / 2,0 мм	100% - обильный рост / 1,0 мм
Заморажи­вание при ультранизкой температуре (t= -80°С)	33% - уме­ренный рост; 67% - еди­ничный рост / 3,0 мм	67% - обиль­ный - сливной рост; 33% - уме­ренный рост/ 2,0 мм	100% - обильный рост / 1,0 мм
Заморажива­ние (t= -18°С)	67% - еди­ничный рост; 33% - отсут­ствие роста/ 3,0 мм	67% - обиль­ный рост; 33% - уме­ренный рост/ 2,0 мм	100% - обильный рост / 1,0 мм
Охлаждение (t= +4 - +8°С)	100% - обильный рост / 3,0 мм	100% - обиль­ный рост / 2,0 мм	100% - обильный рост / 0 мм

Примечание: * - рост на чашке Петри: единичный - от 1 до 10 колоний; умеренный - от 11 до 100 колоний; обильный - более 101 колоний.

При оценке роста размороженных бактериальных культур при всех режимах хранения на эритритагаре у штаммов Aeromonas veronii и Aeromonas salmonicida отмечали фенотипическую однородность колоний. У Aeromonas hydrophila в посевах отмечали наличие колоний четырех различных типов: крупных, диаметром 2-3 мм, приподнятых, с ровным краем и влажной поверхностью; колоний меньшего размера, уплощенных, с матовой поверхностью и ровными краями; матовых, с неровным краем; и очень мелких, точечных колоний. При проверке видовых свойств у всех 4-х типов колоний выявили сниженную биохимическую активность на агаре Клиглера, выраженную в замедленной реакции образования сероводорода, являющегося важным дифференцирующим признаком Aeromonas hydrophila. В пробирке, засеянной из колонии первого типа, черное окрашивание среды (образование сероводорода) появилось на 3-е сутки инкубирования, у трех остальных типов колоний образование сероводорода регистрировали на 5-6-е сутки. Изменения, отмеченные у культуры Aeromonas hydrophila, могут свидетельствовать о присутствии на чашке колоний на разных стадиях развития.

Заключение. Проведены исследования по определению эффективных условий хранения бактерий рода Aeromonas -Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii и Aeromonas salmonicida на протяжении 40 суток. Вирулентные аэромонады являются возбудителями бактериальных инфекций у рыб разных видов и возрастов. Сохранение их в отраслевой коллекции патогенов для их-тиопатологических лабораторий является актуальным вопросом. Получены первые результаты по оценке жизнеспособности и патогенности после длительного хранения у трех видов аэромонад, выделенных из паренхиматозных органов карпа, белого амура и форели при проявлении клинических признаков бактериальной инфекции. При «минусовых» температурах (t= -196°С, -80°С и -200°С) выявлена 100% сохранность только у слабовирулентной Aeromonas salmonicida. У двух других видов аэромонад снизились ростовые способности, у Aeromonas hydrophila выявили сохранность вирулентности, а у Aeromonas veronii - ее снижение. При хранении в условиях «плюсовых» температур (t= +4 - +8°С) отметили 100% сохранность ростовых способностей у всех трех видов аэромонад, но при этом у Aeromonas veronii и Aeromonas salmonicida снизилась вирулентность. По данным многих исследователей устойчивость микроорганизмов к замораживанию зависит от комплекса факторов, в том числе от биологических особенностей вида [3, 9, 10]. У Aeromonas veronii выявлена потеря вирулентных свойств во всех испытуемых условиях хранения, что необходимо учитывать при закладке на хранение аэромонад этого вида. В работе в качестве защитной среды для замораживания культур был использован стерильный питательный бульон ГРМ - 90% с добавлением криопротектора ДМСО - 10%, но спектр применяемых криопротекторов для консервации бактерий значительно шире и актуальным вопросом остаются испытание и других средств для длительного хранения бактерий рода Aeromonas.

Работа выполнена в рамках Государственной работы «Проведение прикладных научных исследований» (раздел 13 государственного задания ФГБНУ «ВНИРО» № 076-00001-24-01).

Список литературы:

1. Басанкина, В. М. Идентификация бактерий рода Aeromonas / В. М. Басанкина, С. В. Пруцаков, Н. Н. Кружнов // 2018. Т. 2. № 4. С. 127-135.

2. Выборнова, Т. В. Исследование влияния низких температур на сохранение жизнеспособности штаммов Streptomyces в процессе хранения / Т. В. Выборнова, Н. Ю. Шарова, А. А. Принцева // Техника и технология пищевых производств. 2018. Т. 48. № 3. С. 34-40.

3. Грачева, И. В. Низкотемпературная консервация коллекционных штаммов холерных вибрионов / И. В. Грачева, А. В. Осин // Проблемы особо опасных инфекций. 2014. С. 39-42.

4. Хоулта Дж. Определитель бактерий Берджи // 1997. 432 с.

5. Методические указания по определению патогенности аэромонад по степени ДНКазной активности // 1998. С. 150-151.

6. Общая характеристика бактерий вида Aeromonas veronii / А. Н. Минаева, А. А. Ломакин, Д. А. Васильев, А. Г. Шестаков // Евразийский Союз Ученых. 2021. № 2 (83). С. 7-9.

7. Похиленко, В. Д. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В. Д. Похиленко, А. М. Баранов, К. В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки, 2009. № 4 (12). С. 99-121.

8. Юхименко, Л. Н. Изучение вирулентности аэромонад по степени ДНКазной аквтиности / Л. Н. Юхименко // Рыбоводство и рыбное хозяйство. 2016. № 3. С. 28-34.

9. Цуцаева, А. А. Опыт долгосрочного хранения промышленных штаммов микроорганизмов / А. А. Цуцаева, А. Е. Ананьина, Л. М. Балыбердина // Микробиология, 2008. 77 (5). С. 696-700.

10. De Paoli P. Biobanking in microbiology: From sample collection to epidemiology, diagnosis and research. FEMS Microbiol. Rev. 2005. 29 (5). P. 897.

11. Carvalho M. J. et al. Phylogenetic diversity, antibiotic resistance and virulence traits of Aeromonas spp. from untreated waters for human consumption // Int J Food Microbiol. 2012. No. 159. P. 230-239.

Резюме. В статье представлены результаты оценки жизнеспособности и вирулентности (патогенности) после длительного хранения штаммов бактерий р. Aeromonas трех видов - Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii, Aeromonas salmonicida, выделенных из паренхиматозных органов карпа, белого амура и форели при проявлении клинических признаков бактериальной инфекции. После 40 дней от закладки на хранение при «минусовых» температурах (t= -196°С, -80°С и -20°С) выявлена 100% сохранность только у Aeromonas salmonicida. У Aeromonas hydrophila и Aeromonas veronii снизились ростовые свойства, у Aeromonas veronii выявлено снижение вирулентности. При хранении в условиях «плюсовых» температур (t= +4 - +8°С) отметили 100% сохранность ростовых свойств у всех трех видов аэромонад, но при этом у Aeromonas veronii и Aeromonas salmonicida снизилась вирулентность.

Ключевые слова: рыбоводство, карп, белый амур, форель, бактерии, род Aeromonas, отраслевая исследовательская коллекция, условия хранения штаммов.

Сведения об авторах:

Токарева Светлана Борисовна, главный специалист лаборатории ихтиопатологии Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»; 141821, Московская область, Дмитровский г.о., пос. Рыбное, 40 а; e-mail: tokareva@vniiprh.vniro.ru.

Сехина Ольга Васильевна, специалист лаборатории ихтиопатологии Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»; 141821, Московская область, Дмитровский г.о., пос. Рыбное, 40 а; e-mail: sekhina@vniiprh.vniro.ru.

Кудинов Павел Владимирович, главный специалист лаборатории ихтиопатологии Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»; 141821, Московская область, Дмитровский г.о., пос. Рыбное, 40 а; e-mail: kudinov@vniiprh.vniro.ru.

Калошкина Инна Муратовна, кандидат ветеринарных наук, начальник отдела противопаразитарных, ветеринарно-санитарных мероприятий ГКУ КСББЖ «Краснодарская»; 350004, г. Краснодар, ул. Калинина, 15/1; e-mail: beretarinna@gmail.com.

Ответственный за переписку с редакцией: Романова Наталья Николаевна, кандидат биологических наук, доцент, заведующая лабораторией ихтиопатологии Филиала по пресноводному рыбному хозяйству ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии»; 141821, Московская область, Дмитровский г.о., пос. Рыбное, 40 а; тел.: 8-495-1086856 (+132); e-mail: romanova@vniiprh.vniro.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей