Нозологическая роль Moraxella ovis в условиях горного овцеводства

УДК:579.8:57.08
DOI 10.33861/2071-8020-2024-5-6-8

Пименов Н. В., Иванникова Р. Ф., Мохаммед З. С., Фатахов К. Ф. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии -
МВА имени К.И. Скрябина», г. Москва

Известно, что инфекционный кератоконъюнктивит (далее, ИКК) крупного рогатого скота вызывается преимущественно Moraxella bovis и Moraxella bovoculi. Однако, некоторые исследователи указывают на патогенетическую или на ассоциативную роль Moraxella ovis в развитии данного заболевания как у крупного, так и мелкого рогатого скота. Так, Ortiz A. G. и соавт. обнаружили у овец с поражениями глаз Moraxella ovis, привели данные молекулярного, эпизоотического мониторинга и бактериальной устойчивости, а также отметили значительную роль в прогрессировании заболевания [7].

Клинические исследования, которые являются основой для научных изысканий, показали, что Moraxella ovis является основным патогеном, вызывающим ИКК у овец породы Тудж [9], хотя Moraxella bovis чаще всего известна как основной возбудитель ИКК. Сравнительные исследования между Moraxella ovis и Moraxella bovis, проведенные казахскими учеными показали, что первая может вызывать сопоставимые глазные заболевания, особенно когда присутствуют дополнительные стресс-факторы или инфекции, в том числе вирусной природы [4]. При этом исследования O’Connor и соавт. на телятах показали, что Moraxella ovis не была выделена из глаз животных с ИКК в монокультуре, в то время как Moraxella bovoculi и Moraxella ovis обнаруживались в глазах с поражениями и, редко, в здоровых глазах [6].

Многочисленными исследованиями были изучены вирулентные признаки Moraxella ovis, включая её способность прикрепляться к эпителиальным клеткам и выделять цитотоксины. Cern H. E. и соавт. отмечают способность бактерии повреждать ткани хозяина и способствовать инфекции, что увеличивает ее патогенный потенциал [1]. На основе полученных данных авторы делают вывод, что Moraxella ovis участвует в патогенезе ИКК, так как исследованные полевые изоляты бактерии производят один или несколько термолабильных экзотоксинов.

Ряд авторов утверждают, что Moraxella ovis играет важную роль в распространении глазных инфекций у овец, где экологические факторы и близкий контакт с другими животными могут подвергать их риску заражения. Исследователи отмечают, что данная бактерия вызывает кератоконъюнктивит и может приводить к серьезным повреждениям глаз и, в некоторых случаях, к слепоте, если не проводить лечебные мероприятия [2, 3]. На частоту инфекций Moraxella ovis у овец влияют ряд факторов, таких как погодные условия, общее состояние здоровья стада и методы содержания. Овцы в горных районах более подвержены офтальмологическим и респираторным заболеваниям, поскольку они часто подвергаются воздействию экстремальных температур и погодных условий [5, 8].

Создание эффективных мер лечения для горных овец требует понимания нозологической роли Moraxella ovis. Это включает раскрытие патогенеза, морфогенеза болезни, внедрение протоколов биобезопасности. Согласно исследованиям Saglam A.G. и др., раннее выявление и терапия могут значительно уменьшить негативные последствия от инфекции Moraxella ovis для здоровья и продуктивности овец [9].

В этой связи, с учетом недостаточных и противоречивых научных данных о патогенности возбудителя и его нозологической роли, интересным аспектом изучения являлось скрининговое исследование на Moraxella ovis образцов биоматериала из пораженных глаз овец и коз одной отары в сравнении с микробиотой здоровых глаз у животных содержащихся в одних и тех же условиях. Для осуществления поставленной цели была проведена экспедиция в горные районы Республики Дагестан для исследования животных, находящихся в условиях круглогодичного выпаса на горных пастбищах с загоном в ночное время в кошару.

Материалы и методы исследований. Материалом исследования являлись пробы биологического и клинического материала из глаз, а, именно, смывы из коньюнктивального мешка, отобранные общеизвестными методами на транспортные среды для бактериологических исследований. Пробы получали из одной отары от овец лезгинской породы и коз местных помесей разных половозрастных групп в количестве 15 голов: от клинически здоровых (n=10) животных и имеющих признаки катарально-гнойного коньюнктивита и сухого кератоконьюнктивита (n=5), содержащиеся в условиях интенсивного круглогодичного использования пастбищ села Рутул, Рутульского района, Республики Дагестан. Образцы из транспортных сред в лабораторных условиях были посеяны на пластины с 10% кровяным агаром. Пластины инкубировали при температуре 37°C в течение 24 часов.

Колонии, характерные для Moraxella spp. (мелкие колонии с ареолом гемолиза), были подвергнуты окрашиванию по Граму. Биохимические тесты, включая тесты на оксидазу и каталазу, были проведены для выявления Moraxella среди других микроорганизмов. Дальнейшая идентификация была подтверждена с использованием MALDI-TOF (время лазерной десорбции/иони-зации с помощью матрицы) для точного определения бактерий. Для этого после отбора хорошо изолированной колонии, которая демонстрирует типичные свойства моракселл, тонкую часть колонии удаляли с помощью стерильной петли, затем повторно суспендировали в 300 мкл дистиллированной воды, затем центрифугировали суспензию в течение 10 мин при 10000 об/мин, после чего в осадок добавляли 2 мкл реактогенного раствора и переносили на пластину MALDI и загружали в ионизационную камеру. Идентификация бактериальных культур осуществлялась методом матрично-активированной лазерной десорбции/иони-зации с времяпролётной масс-спектрометрией на анализаторе микробиологическом BactoSCREEN (ООО НПФ «ЛИТЕХ»). Время-пролетная масс-спектрометрия основана на сканировании микробных белков после ионизации, вызванной лазерным лучом.

Изолированные штаммы были протестированы также на чувствительность к антибиотикам с использованием диско-диффузионного метода. Для этого была приготовлена бактериальная суспензия из свежей культуры Moraxella ovis в жидкой питательной среде, чтобы достичь мутности, соответствующей стандарту 0,5 McFarland, которая равномерно распределялась по поверхности агаровой пластины Мюллера-Хинтона, после чего туда поместили диски с антибиотиком. Пластины инкубировались при температуре 37°C в течение 24 часов. Использовали следующие антибиотики: амоксициллин; ампициллин; гентамицин; эритромицин; стрептомицин; ципрофлоксацин; линкомицин; ванкомицин; тетрациклин.

Для определения патогенных свойств выделенной культуры проводили тесты на восьми кроликах в возрасте от 6 до 8 месяцев. Также была создана контрольная группа для сравнения, состоящая из двух здоровых голов.

Разведенный до желаемой концентрации инокулят (108 КОЕ/мл), OD = 600 нм = 1, полученный из чистой культуры Moraxella ovis, в дозе 100 мкл водили в конъюнктивальный мешок каждого глаза у подопытных кроликов для оценки патогенности.

Результаты исследований и их обсуждение. Из образцов биологического материала, полученного из здоровых глаз овец и коз, при скрининговых бактериологических исследованиях на кровяном агаре роста не выявили. Из пяти образцов клинического материала (трех овец, двух коз) было выделено 3 изолята с характерным ростом - мелкие колонии «S» формы беловато-серого цвета с р-ге-молизом: выделены в двух образцах от овец и одном от коз (60%).

При микроскопии мазков, окрашенных по Граму, изоляты характеризовались как грамотрицательные палочковидные и кокковидные бактерии, располагающиеся парами, тетрадами и короткими цепочками. Биохимические тесты дали положительный результат на каталазу и оксидазу. Использование MALDI-TOF подтвердило присутствие Moraxella ovis в выделенных образцах.

Среди образцов, выделенных от животных с поражением глаз, скрининговый рост культур на кровяном агаре отмечался в указанных пробах в монокультуре. Из двух других образцов клинического материала были выделены культуры Staphylococcus spp. (1 колония от маленького до среднего размера, круглая и непрозрачная, поверхность гладкая и блестящая), обладавшей в-гемолитическими свойствами, и Pentoea agglomerans (колонии в обеих пробах круглые, от маленького до среднего размера, выглядят влажными, гладкими, имеют бежевую окраску и ровный край), известная как Enterobacter agglomerans или Erwinia herbicola, грамотрицательная бактерия семейства Erwiniaceae, относящаяся к убиквитарной микробиоте, распространенной во внешней среде и регистрируемой как один из представителей раневой оппортунистической микрофлоры.

Таким образом, на примере овец и коз горного содержания отображается участие бактерий с факторами вирулентности в этиологии или развитии гнойно-воспалительных поражений органа зрения. Принимая во внимание, что в трех из пяти случаев зафиксировано представительство Moraxella ovis без ассоциативного присутствия потенциальных патогенов, а физико-химическое раздражение слизистой оболочки органа зрения в условиях открытых горных пастбищ в летний период минимизировано, складываются определенные основания считать Moraxella ovis этиологией кератоконъюнктивитов.

Интересны, в этой связи, данные по антибиотикорезистентности изолятов как фактора патогенности микроорганизма. Тест на чувствительность к антибиотикам показал, что все три изолята Moraxella ovis были устойчивы к ампициллину и тетрациклину. Один штамм был чувствителен к гентамицину, но два других были устойчивы к нему. Эти же два штамма были чувствительны к линкомицину, а один -устойчив. К эритромицину также были устойчивы 2 изолята, один обладал низкой чувствительностью. К остальным из тестируемых антибиотиков культуры Moraxella ovis проявили высокую (фторхино-лоны) или среднюю чувствительность. Не смотря на неоднородность резистентности к пенициллиновым в-лактамам, в итоге отмечается устойчивость изолятов моракселл к антибиотикам 3 и 4 групп, что говорит о проявлении МЛУ - множественной лекарственной устойчивости возбудителя.

Идентичность данных антибитикорезистентности по двум изоля-там позволяет полагать, что это - один эпизоотический штамм, и мы имеем два «полевых» штамма на отаре. Тем не менее, исследования в биопробе, как и было запланировано, мы провели со всеми тремя изолятами.

Биопробу, как было отмечено в материалах и методах, осуществляли инокуляцией суспензии суточной культуры Moraxella ovis в конъюнктивальный мешокобоих глаз кроликов двух опытных групп (по 2) и в один глаз (второй изолят одного штамма) кроликам третьей опытной группы.

Через 48-72 часа после ведения инокулята в конъюнктивальный мешок у кроликов наблюдались клинические признаки конъюнктивита и выделения из глаз. Были взяты образцы и исследованы из глаза, обнаружена Moraxella ovis. Кроме того, у одного кролика спустя 2 суток после клинического проявления конъюнктивита отмечали признаки кератита, появились выделения из носа, проблемы с дыханием, потеря аппетита и чувствительность к свету. У одного кролика, инфицированного в один конъюнктивальный мешок, через трое суток после проявления клинической манифестации развился катарально-гнойный конъюнктивит и на втором глазу. При бактериологическом контроле идентифицировали моракселлу овис.

Исходя из вышеописанного можно свидетельствовать, что эти изолированные бактерии являются патогенными. Moraxella ovis была выделена от овец и козы с выраженными клиническими признаками кератоконъюктивитов, воспроизводимость и моделирование болезни указывают на её нозологическую роль.

Заключение. В ходе скринингового исследования у животных с кератоконъюнктивитами в условиях горного овцеводства были выделены 3 изолята, идентифицированные как два полевых штамма Moraxella ovis. Проведены лабораторные эксперименты, которые показали вредоносный потенциал этих микроорганизмов для организма-хозяина. Выявлены факторы, указывающие на патогенность моракселл овис - гемолитическая активность, оксидазопозитивность, множественная антибитикорезистентность, инвазивность и воспроизводимость инфекционно-воспалительного процесса в бипробе на кроликах. Указанные результаты, а, также, монопредставительство в клинической микробиоте, свидетельствуют о нозологической роли M. ovis как возбудителя инфекционного кератоконъюнктивита у жвачных. Полученные данные расширяют знания в области частной микробиологии и инфекционных болезней животных в условиях горного овцеводства. Знание эпизоотологических особенностей M. ovis может помочь в разработке эффективных планов ведения животноводства для обеспечения благополучия животных и эффективности отрасли, особенно, интерполируя результаты - в мясном скотоводстве, где болезнь приносит ощутимые убытки из-за потери продуктивности.

Исследование выполнено за счёт гранта Российского научного фонда № 24-26-00168 «Зоопатогенная роль бактерий Moraxella и селекция активных гомологичных бактериофагов».

Список литературы:

1. Cern H. E. et al. Effects of Moraxella (Branhamella) ovis culture filtrates on bovine erythrocytes, peripheral mononuclear cells, and corneal epithelial cells // J Clin Microbiol. 2006. 44 (3). P. 772-776.

2. Elad D. et al. Moraxella ovis in cases of infectious bovine keratoconjunctivitis (IBK) in Israel //Zentbl. Veterinarmed. 1988. 35. P. 431-434.

3. Karthikeyan R. et al. Isolation and characterization of Moraxella ovis from ovine infectious keratoconjunctivitis in a sheep farm of Northern India // ICAR-Indian Veterinary Research Institute. 2021. P. 336-338.

4. Kuibagarov M. et al. Moraxella species diversity in infectious bovine keratoconjunctivitis in Northern Kazakhstan // National Center for Biotechnology. 2018. P. 8.

5. Maier G. U. et al. The role of environmental factors in the epidemiology of infectious bovine keratoconjunctivitis // Veterinary Clinics of North America: Food Animal Practice. 2021. 37(2). P. 309-320.

6. O’Connor A. M. et al. Descriptive epidemiology of Moraxella bovis, Moraxella bovoculi and Moraxella ovis in beef calves with naturally occurring infectious bovine keratoconjunctivitis (Pinkeye) // Vet Microbiol. 2012. 155 (2-4). P. 374-380.

7. Ortiz A. G, Characterization and antimicrobial resistance of Moraxella ovis isolates from clinical cases of contagious ovine keratoconjunctivitis in Mexico / R. M. Talavera, V. Soriano, R. EG. Palomares, G. E. Enriquez, M. C. Salgado, D. J. Acost // Rev Colomb Cienc Pecu. 2024. 37(1). P. 14-26.

8. Prescott J. F. et al. Pathogenesis of Bacterial Infections in Animals fifth edition // 2022. P. 344-360.

9. Saglam A.G. Moraxella ovis and Mycoplasma conjunctivae Isolation from an Ovine Infectious Keratoconjunctivitis Outbreak and Fortified Treatment Approaches. 2018. P. 552-555.

Резюме. Литературные данные отмечают инцидентность выявления Moraxella ovis при инфекционном кератоконъюнктивите крупного (реже) и мелкого (чаще) рогатого скота. Однако, мнения авторов относительно патогенности и нозологической роли данного микроорганизма разнятся. В этой связи целью настоящей работы являлся скрининг моракселлезной инфекции в отаре овец в условиях высокогоного выпаса и изучение нозологической роли данного микроорганизма. Материалом исследования являлись клинические образцы из глаз овец, а также конъюнктивальные смывы от здоровых животных. В работе использованы методы бактериологических исследований, масс-спектрометрия, диско-диффузное определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, биопроба на кроликах. Из 5 образцов (трех от овец, двух от коз) было выделено 3 изолята Moraxella ovis. В трех случаях зафиксировано представительство M. ovis без ассоциативного присутствия потенциальных патогенов. Изучены факторы вирулентности изолятов Moraxella ovis, в том числе антибиотикорезистентность. Установлены 2 эпизоотических штамма и смоделирована инфекция в биопробе на кроликах. Выявлены факторы, указывающие на патогенность M. ovis - гемолитическая активность, оксидазопозитивность, множественная антибитикорезистентность, инва-зивность и воспроизводимость инфекционно-воспалительного процесса в бипробе на кроликах. Полученные данные указывают на этиологическую роль Moraxella ovis в инфекционном кератоконъюнктивите у мелкого рогатого скота.

Ключевые слова: Moraxella ovis, инфекционный кератоконъюнктивит, мелкий рогатый скот, нозологическая роль, антибиотикорезистентность.

Сведения об авторах:

Иванникова Регина Фановна, кандидат биологических наук, доцент кафедры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина»; 109472, г. Москва. ул. Академика Скрябина, 23; тел.: 8-925-0263058; e-mail: regiotf@yandex.ru.

Мохаммед Захраа Сахиб, аспирант кафедры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»; 109472, г. Москва. ул. Академика Скрябина, 23; тел.: +9647710565277; e-mail: zahraasahib92@gmail.com.

Фатахов Курбан Фатахович, кандидат ветеринарных наук, старший преподаватель кафедры иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»; 109472, г. Москва. ул. Академика Скрябина, 23; тел.: 8-985-0988624; e-mail: fat.kurban1995@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Пименов Николай Васильевич, доктор биологических наук, профессор, профессор РАН, заведующий кафедрой иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии -МВА имени К.И. Скрябина»; 109472, г. Москва. ул. Академика Скрябина, 23; тел.: 8-909-9448012; e-mail: pimenov-nikolai@yandex.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей