Бактериальное сообщество в кишечном канале медоносных пчел

УДК 638.12:579
DOI 10.33861/2071-8020-2023-5-40-42

Стрельбицкая О. В., Тищенко А. С., Седашев А. П., Комлацкий В. И., Комлацкий Г. В., Лысенко А. А. Федеральное государственное
бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет
им. И.Т. Трубилина», г. Краснодар

Пчелиная семья высокоорганизованное сообщество насекомых. Медоносные пчелы важны из-за их большого агроэкологического и экономического потенциала благодаря производству ценных продуктов, таких как мед, воск, пыльца, прополис и маточное молочко [2, 3].

С учетом существенной значимости медоносных пчел, является важным изучение детальных физиологических процессов их организма, в том числе закономерности формирования микробных сообществ, населяющих кишечник насекомого. Известно, что наибольшее значение в микробиоценозе кишечника пчел занимают именно бактериальные сообщества, при этом их разнообразие (филотип) является ограниченным в отличие от таковых у теплокровных животных. Также установлено, что разные виды бактерий регулируют специфические модули метаболитов в гемолимфе, выработку витаминов, участвуют в регуляции различных биохимических и физиологических механизмов и играют важную роль в функционировании иммунной системы хозяина и индукции иммунных реакций [5, 7, 12, 10].

На разнообразие состава кишечной микробиоты влияют топографические и краткосрочные сдвиги в микробных сообществах, при этом специфические микроорганизмы населяют определенные ниши в организме хозяина во время определенных фаз его роста и развития. Вопросу исследования микробиоценоза кишечного тракта медоносных пчел посвящены работы ряда авторов [1, 4, 5, 6]. Социальные взаимодействия открывают возможности для переноса кишечных микроорганизмов, поэтому некоторые из наиболее устойчивых и специализированных сообществ кишечника, выполняющих важные функции в питании и защите, были идентифицированы у общественных насекомых, таких как медоносные пчелы [8].

Кроме того, кишечные микроорганизмы влияют на превращение цветочного нектара в мед, благодаря их свойствам ферментации [7]. Так же установлено, что лактобактерии эффективно защищают эпителиальные клетки кишечника человека и животных от кишечных вирусных инфекций [11, 13].

Таким образом, микробиом медоносных пчел играет значительную роль в поддержании здоровья особей, а его нарушение вызывает у насекомых восприимчивость к ряду заболеваний. Исследования были сосредоточены на кишечном микробиоме медоносных пчел, его роли и функционировании у клинически здоровых особей.

Цель исследований была направлена на выявление доминантных видов бактерий в микробном пуле различных отделов кишечного тракта здоровых особей пчел.

Материалы и методы исследований. Работа выполнена на базе лаборатории микробиологии центра биотехнологий ФГБОУ ВО Кубанский ГАУ имени И. Т. Трубилина. Объектом исследования служили медоносные пчелы карпатской породы - Apis mellifera carpatica, отобранные на пасеке МИП «Живпром».

Для выделения микроорганизмов из кишечного канала, насекомых усыпляли в морозильной камере при температуре минус 40°C. Поверхность тела пчел обрабатывали 70% этанолом, для предотвращения попадания симбионтной микрофлоры с брюшка, крыльев и конечностей, и промывали в стерильном физиологическом растворе. Извлеченные отделы пищеварительной трубки - медовый зобик, средний отдел кишечника и задний отдел (ректум) помешали в стерильные бюксы. Навеску кишечника гомогенизировали физиологическим раствором в соотношении 1:10, готовили серию 10-кратных разведений. Инокулировали по методу Дригальского в количестве 100 мкл на селективные среды: Левина, Энтерококкагар, Стафилококкагар, разлитые в чашки Петри по 20 мл, с последующим инкубированием при 35±1°C условиях 24 часа. Для выделения молочнокислых бактерий использовали агаризованную Бифидо-среду, указанным выше способом и инкубированием при 35±1°C, 4-6% CO2 в атмосфере, 48 часов. Подсчет микроорганизмов осуществляли по ГОСТ ISO 7218-2011.

Видовую идентификацию проводили с использованием матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с вре-мяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF MS). Цельноклеточные бактерии помещали на плашку-мишень MALDI-TOF MS с помощью пластиковой петли без проведения этапа экстракции и высушивали при комнатной температуре. Затем бактериальный образец покрывали 1 мкл 70% муравьиной кислоты, а далее 1 мкл раствора матрицы, содержащего 10 мг/мл HCCA (а-циа-но-4-гидроксикоричная кислота, Sigma-Aldrich, Польша), растворенного в 50% ацетонитриле (Sigma-Aldrich, Польша) и 2,5% TFA (трифторуксусная кислота, Sigma-Aldrich, Польша) и высушивали для кристаллизации на воздухе. Масс-спектры образцов снимали на MALDI-TOF MS спектрометре BactoSCREEN при помощи прилагающегося программного обеспечения (Литех, РФ). Перед анализом была проведена калибровка с использованием бактериального тест-стандарта (Литех, РФ), содержащего белковый экстракт E. ooli. Положительные ионы получали при ускоряющем напряжении 20 кВ в линейном диапазоне. Каждый спектр представлял сумму ионов, полученных от 350 лазерных ударов, проведённых автоматически или в ручном режиме по разным участкам одной ячейки. Спектры рибосомальных белков анализировали в диапазоне m/z от 3,500 до 20,000. О достоверности идентификации судили по значению коэффициента совпадения (Score values): 0,85-100 - идентификация до вида, 0,65-0,85 - идентификация до рода, 0-0,65 - идентификация не прошла.

Результаты исследований и их обсуждение. Исследование бактериального пула показали, что в разных отделах кишечного канала взрослой медоносной пчелы обитают энтеробактерии, молочнокислые бактерии, стафилококки, энтерококки, псевдомонады различные по количественному и видовому составу для разных отделов пищеварительной трубки (табл. 1).

Таблица 1 Количественный состав представителей микробиома кишечного канала медоносных пчел

Отдел кишечного канала	Представители	Количество микроорганизмов, lg/г
		июнь	июль	август
Медовый желудочек	Энтеробактерии
	Escherichia coli	3,60±0,08	2,30±0,08	1,0±0,08
	Лактобактерии
	Lactiplantibacillus plantarum	3,30±0,19	4,30±0,08	3,30±0,08
	Apilactobacillus kunkeei	6,60±0,08	7,47±0,08	8,6±0,08
	Стафилококки
	Staphylococcus capitis	7,60±0,08	6,42±0,08	6,6±0,08
Средний отдел	Энтеробактерии
	Buttiaxella saviniae	2,30±0,08	2,30±0,08	2,0±0,08
	Escherichia coli	4,30±0,08	4,60±0,19	4,30±0,08
	Enterococcus faecialis	7,47±0,08	6,30±0,08	6,47±0,08
	Pseudonomas stutzeri	4,30±0,08	5,0±0,08	5,0±0,08
Задний отдел	Энтеробактерии
	Acinetobacter iwoffi	3,47±0,08	3,30±0,08	3,0±0,08
	Enterococcus avium	5,47±0,08	4,30±0,08	4,0±0,08
	Enterococcus faecialis	7,0±0,08	6,30±0,08	5,47±0,08
	Escherichia coli	5,47±0,08	4,30±0,08	4,47±0,08
	Pantoea agglomerans	3,30±0,08	3,30±0,08	3,30±0,08
	Klebsiella pneumonae	2,30±0,08	2,30±0,08	2,30±0,08
	Klebsiella oxytoca	2,30±0,08	2,0±0,08	2,30±0,08
	Klebsiella aerogenosa	2,30±0,08	2,30±0,08	2,30±0,08
	Стафилококки
	Staphylococcus hominis	4,30±0,08	3,47±0,08	3,0±0,08
	Staphylococcus epidermitis	6,0±0,19	6,30±0,08	5,47±0,08
	Лактобактерии
	Lactobacillus acidophilus	4,0±0,08	4,0±0,08	4,0±0,08
	Актиномицеты
	Bifidobacterium asteroides	7,60±0,08	7,60±0,08	8,00±0,08

Примечание: * - р<0,05

Изолированная нами микрофлора из медового желудочка была представлена 4 видами бактерий. При этом, установлено, что энтеробактерии были представлены Escherichia coli, лактобактерии - Lactiplantibacillus plantarum, Apilactobacillus kunkeei, стафилококки - Staphylococcus capitis. В динамике летнего медосбора концентрация E. coli уменьшалась с июня по август на 36% и 72,2%, соответственно. Количество жизнеспособных клеток A. kunkeei напротив увеличивалось на 12,42% и 30,3%, соответственно. Таким образом, между признаками-факторами численности бактериальных клеток A. kunkeei и E. coli выявлена обратная сильная корреляция с коэффициентом - 0,95.

Микрофлора среднего отдела кишечника была представлена видами, включающими представителей энтеробактерий: Enterococcus faecialis, Escherichia coli, Buttiaxella saviniae, а также псевдомонад - Pseudonomas stutzeri. Количественный состав данных представителей имеет определенное постоянство, не зависящее от летней динамики, вероятно, это зависит от анатомического строения средней кишки, так как данный отдел выполняет функцию расщепления и всасывания питательных компонентов корма у данного вида насекомых - в слизистой оболочке имеются железы, выделяющие энзимы, необходимые в процессе пищеварения, а также протоки, участвующие во всасывании питательных веществ.

Микробиом заднего отдела кишечной трубки был представлен видами микроорганизмов, наибольшее число из которых принадлежало к энтеробактериям: Acinetobacter iwoffi, Enterococcus avium, Enterococcus faecialis, Escherichia coli, Pantoea agglomerans, Klebsiella pneumonae, Klebsiella oxytoca, Klebsiella aerogenosa, последние 4 вида относятся к тран-зиторным микроорганизмам, занесенным из окружающей среды, также присутствовали представители стафилококов: Staphylococcus hominis, Staphylococcus epidermitis, из лактобактерий был выявлен один представитель - Lactobacillus acidophilus, а также выявлен представитель семейства актино-мицетов - Bifidobacterium asteroides.

В течение летнего периода количество клеток E. faecialis, E. coli, E. avium, St. hominis, St. epidermitis уменьшилось на 21,8%, 23,7%, 26,8%, 30,2% и 8,8%, соответственно. Данный факт может быть обусловлен положительным влиянием активного лета пчёл и частого опорожнения кишечника в процессе медосбора, а также увеличением количества B. asteroides, которое увеличилось на 21%.

Заключение. Установлено, что интенсивный медосбор положительно влияет на количественный и видовой состав микробиома кишечного тракта медоносных пчёл. При этом выявлена специфичность видового разнообразия микрофлоры различных отделов пищеварительной трубки. Энтерофлора заднего отдела кишечного тракта более подвержена видовой вариации доминирующей микрофлоры, по сравнению с передним отделом. Средний же отдел кишечной трубки имеет более постоянный видовой и количественный состав. В медовом желудочке между признаками-факторами численности бактериальных клеток Apilactobacillus kunkeei и Escherichia coli выявлена обратная сильная корреляция с коэффициентом - 0,95. В заднем отделе пищеварительного тракта имеются наиболее благоприятные условия для жизнедеятельности микроорганизмов, семейства энтеробактерий, которые являются условно-патогенными видами для животных и человека, и условными фитопатогенами для растений, но не вызывают заболевания у медоносных пчёл.

Список литературы:

1. Бондырева, Л. А. Микрофлора кишечника пчел после зимовки / Л. А. Бондырева, А. С. Попеляев, В. Н. Гетманец // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2022. № 2 (208). С. 78-81.

2. Ендовицкий, Р. В. Характеристика отдельных показателей физиологического состояния пчел / Р. В. Ендовицкий, С. А. Пашаян, О. В. Стрель-бицкая // Инновационное развитие агропромышленного комплекса для обеспечения продовольственной безопасности Российской Федерации. 2020. С. 168-172.

3. Комлацкий, В. И. Значение продуктов пчеловодства в народном хозяйстве / В. И. Комлацкий, О. В. Стрельбицкая // Современные проблемы пчеловодства и апитерапии. 2021. С. 389-394.

4. Сердюченко, И. В. Микробиоценоз кишечного тракта взрослых медоносных пчел в условиях Краснодарского края / И. В. Сердюченко, В. И. Терехов, Д. А. Овсянников // Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2014. № 46. С. 204-206.

5. Сердюченко, И. В. Микробиоценоз кишечного тракта медоносных пчел и его коррекция / И. В. Сердюченко, В. И. Терехов // 2018. 124 с.

6. Сердюченко, И. В. Микробиоценоз кишечного тракта медоносных пчел и его коррекция : специальность 06.02.02 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология» : диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук / Сердюченко Ирина Владимировна. - Краснодар, 2013. 145 с.

7. Belkaid Y., Harrison O. Homeostatic Immunity and the Microbiota // Immunity. 2017. No. 46. Pp. 562-576.

8. Engel P., Moran N. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function // FEMS Microbiol. Rev. 2013. No. 37. Pp. 699-735.

9. Greiner T., Backhed F. Effects of the gut microbiota on obesity and glucose homeostasis // Trends Endocrinol. Metab. 2011. No. 22. Pp. 117-123.

10. Honeybee gut microbiota promotes host weight gain via bacterial metabolism and hormonal signaling /H. Zheng et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017. No. 114. Pp. 4775-4780.

11. Host-gut microbiota metabolic interactions / J. Nicholson, E. Holmes, J. Kinross et al. // Science. 2012. No. 336. Pp. 1262-1267.

12. Microorganisms in honey. Honey analysis. / M. Silva, Y. Rabadzhiev, Eller M. Renon et al. // IntechOpen. 2017. Pp. 233-258.

13. Molecular approaches to study the insect gut symbiotic microbiota at the ‘omics’ age / W. Shi et al. // Insect Sci. 2010. No. 17. Pp. 199-219.

Резюме. С учетом существенной значимости медоносных пчел, является важным изучение детальных физиологических процессов их организма, в том числе закономерности формирования микробных сообществ, населяющих кишечник насекомого. Как известно, наибольшее значение в микробиоценозе кишечника пчел занимают именно бактериальные сообщества. На разнообразие состава кишечной микробиоты влияют топографические и краткосрочные сдвиги в микробных сообществах, при этом специфические микроорганизмы населяют определенные ниши в организме хозяина во время определенных фаз его роста и развития. Кроме того, кишечные микроорганизмы влияют на превращение цветочного нектара в мед, благодаря их свойствам ферментации. Микробиом медоносных пчел играет значительную роль в поддержании здоровья особей, а его нарушение вызывает у насекомых восприимчивость к ряду заболеваний. Исследования были сосредоточены на кишечном микробиоме медоносных пчел, его роли и функционировании у клинически здоровых особей. В статье изучен бактериальный пул доминантной микрофлоры кишечного канала особей медоносной пчелы в летний период. Авторами представлены результаты количественного и видового состава микробиома. Результаты исследований позволили заключить, что состав лактофлоры микробиома кишечника увеличивался в результате медосбора. Также исследования показали, что в каждом отделе кишечного канала пчел микрофлора различна по видовому и количественному составу, наблюдается обратная коррелятивная зависимость между некоторыми представителями.

Ключевые слова: пчела медоносная, Apis mellifera, микробиоценоз кишечника, бактериальный пул, Bifidobacterium, Lactobacillus, лактофлора, эндобактерии, кишечный канал, времяпролетная масс-спектрометрия, медосбор.

Сведения об авторах:

Стрельбицкая Олеся Викторовна, кандидат сельскохозяйственных наук, старший преподаватель кафедры частной зоотехнии и свиноводства ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-918-9406616; e-mail: olesya-wet@mail.ru.

Тищенко Александр Сергеевич, кандидат ветеринарных наук, заведующий лабораторией микробиологии центра биотехнологий, доцент кафедры микробиологии, эпизоотологии и вирусологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-928-4692399; e-mail: mephisto83@inbox.ru.

Седашев Артем Петрович, лаборант лаборатории микробиологии центра биотехнологий ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-918-0511691; e-mail: sedashevartem@mail.ru.

Комлацкий Василий Иванович, доктор сельскохозяйственных наук, профессор, заведующий кафедрой частной зоотехнии и свиноводства ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-988-2422789; e-mail: kubanagro@list.ru.

Комлацкий Григорий Васильевич, доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры институциональной экономики и инвестиционного менеджмента ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-918-4487364; e-mail: gregwk@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Лысенко Александр Анатолиевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры терапии и фармакологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина,13; тел.: 8-961-5075415; e-mail: vet.kubgau@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей