Применение метода Е-розеток и выявление розеткообразующих лимфоцитов в крови и лимфоидных органах здорового и больного туберкулезом крупного рогатого скота

УДК 619:616.98:579.873.21Т:636.2
DOI 10.33861/2071-8020-2023-5-7-9

Баратов М. О. Прикаспийский зональный научноисследовательский ветеринарный институт - филиал Федерального
государственного научного учреждения «Федеральный аграрный научный центр Республики Дагестан»,
Республика Дагестан, г. Махачкала
Семененко М. П. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Краснодарский научный
центр по зоотехнии и ветеринарии», г. Краснодар

Методы интенсификации Т-и В- систем иммунитета человека и экспериментальных животных в последние годы получили большое распространение. При этом изучаются их функциональные свойства, а также разрабатываются способы получения отдельных популяций из крови и лимфоидных органов [8, 9, 13].

Для изучения Т-системы иммунитета наиболее распространёнными методами являются бластрансформация лимфоцитов, непрямая иммунофлюоресценция, цитотический тест, с применением антити-моцитарной сыворотки, спонтанное розеткообразование и др. Однако чаще всего применяется феномен розеткообразования лимфоцитов, основой которого является наличие специфических рецепторов для эритроцитов барана на поверхности лимфоцитов [1, 2, 4].

При соответствующих условиях постановки реакций лимфоциты крови и лимфоидных органов образуют спонтанные розетки и выявляют Т-популяцию лимфоцитов, которые ответственны за клеточный иммунитет. Кроме общей Т- популяции лимфоцитов, в зависимости от постановки реакции, создается возможность определить Т-клетки-хелперы, Т-клетки-супрессоры, В-клетки с рецепторами для Ес-фрагментов иммуноглобулинов, а также В-клетки с рецепторами для третьего компонента комплимента. Следовательно, выявление отдельных популяций и субпопуляций лимфоцитов свидетельствует о больших возможностях метода розеткообразо-вания. Поэтому количественная и функциональная характеристика Т- и В- лимфоцитов в норме и патологии представляют большой интерес и являются важным критерием для определения иммунологического статуса организма [3, 10, 11, 14].

Особое значение придается исследованию иммунокомпетентной системы при туберкулезном поражении лимфоидной ткани, поскольку появились работы о том, что иммунологическая реактивность организма сопровождается функциональными нарушениями в отношении клеточного иммунитета. Некоторые авторы считают, что туберкулезный процесс способствует изменению поверхности свойств лимфоцитов, которые способны только частично выполнять свои функции [6, 12, 15].

Следует отметить, что Т- и В- системы иммунитета в основном изучаются у человека и лабораторных животных. Однако исследования иммунокомпетентных клеток лимфоидной ткани при туберкулезе крупного рогатого скота пока находятся в начальной стадии [5, 7, 15].

В связи с этим, целью нашей работы явилось изучение оптимальных условий и возможностей применения теста спонтанного розеткообразования для определения количества популяций Т-лимфоцитов в крови и лимфоидных органах здорового и больного туберкулезом крупного рогатого скота.

Материалы и методы исследований. Материалом для исследования служили лимфоциты, выделенные из крови, тимуса, лимфатических узлов, селезенки и костного мозга 72 здоровых и 96 больных туберкулезом коров.

Для выделения лимфоцитов из крови и лимфоидных органов из яремной вены бралась кровь в количестве 10 мл, которая перемешивалась с 2,7% раствором ЭДТА. Затем кровь разводилась 1:2 01 М фосфатным буфером (или сбалансированным раствором Хенкса с рН=7,2). Для выделения лимфоцитов применялся 1% верографин по инструкции. Далее, разведенная кровь осторожно наслаивалась над верографином и затем центрифугировалась в течение 40 мин. при 2200 об/мин при температуре 4оС. После центрифугирования взвесь лимфоцитов в интерфазе собиралась пастеровской пипеткой и дважды отмывалась от верогра-фина сбалансированным раствором Хенкса. Готовилась рабочая концентрация лимфоцитов (6x106 клеток/мл), которые применялись для постановки реакции спонтанного розеткообразования (РСР). В приготовленных суспензиях содержалось 90-95% лимфоцитов (результаты цитоморфологических исследований), жизнеспособность которых была выше 90%. Кроме того, одновременно проводился ряд экспериментов по выделению клеток из крови крупного рогатого скота с помощью 3% желатина, 6% декстрана и 83% хлористого аммония.

При приготовлении эритроцитов барана и эмбриональной сыворотки в качестве стабилизатора свертывания крови барана в качестве антикоагулянта применялся раствор Ольсвера (рН=6,1). Кровь смешивалась с раствором Ольсвера в отношении 1:1 и до ее применения хранилась при температуре 4оС. Перед употреблением эритроциты барана (далее, ЭБ) трижды отмывались раствором Хенкса в течение 10 мин, при 1500 об/мин, после чего образовавшийся лейкоцитарный слой удалялся и готовилась концентрация 3x108 клеток в 1 мл суспензии.

В течение всех исследований для стабильности стандартных условий использовались эритроциты одного и того же барана.

При определении розеткообразующих лимфоцитов крупного рогатого скота в тесте розеткообразования применялась эмбриональная сыворотка. Источником эмбриональной сыворотки служила кровь, полученная из эмбрионов крупного рогатого скота возрастом 4-6 месяцев. Эмбриональная сыворотка выделялась после свертывания крови, затем инактивировалась при температуре 56оС в течение 30 мин и адсорбировалась эритроцитами барана при температуре 37оС в течение 1 часа.

Методика постановки спонтанного образования розеток заключалась в том, что к 0,25 мл взвеси лимфоцитов (6x106 клеток/мл) добавилось 0,25 мл ЭБ (3x108 клеток/ мл) и 30 % эмбриональной сыворотки. После тщательного ресуспендирования взвесь клеток помещалась в ультратермостат (УТ-10) при температуре 25оС в течение 40 мин. Затем суспензия клеток осаждалась центрифугированием при 1000 об/мин в течение 5 минут, затем пробирки с клетками ставились в ледяную ванну при температуре 4оС на 12 часов, после чего часть супернатанта удалялась, а взвесь клеток осторожно ре-суспендировалась легким покачиванием. Перед началом подсчёта розеткообразующих лимфоцитов в пробирку с взвесью добавлялась 1-2 капли 0,5% трипанового синего для определения мертвых клеток. Подсчитывалось не менее 200 лимфоцитов и определялось количество розеток в процентах. Для морфологического изучения розеткообразующих клеток готовились препараты, которые окрашивались азур эозином по Романовскому-Гимза.

Кроме описанных условий розеткообразования с лимфоцитами крупного рогатого скота, также проводилась постановка реакций спонтанного розеткообразования (далее, РСР) по методам M. Biozzi, M. Jandal и J. Bach.

Результаты исследований и их обсуждение. При использовании различных методов выделения лимфоцитов из крови крупного рогатого скота обнаружилась их различная эффективность. Получение лейкоцитарной взвеси с применением 5% декстрана и 3% желатина в различных соотношениях с кровью (1:1, 2:1, 3:1) было непригодным для осуществления седиментации эритроцитов крови. Поэтому взвесь лейкоцитов была получена лизированием эритроцитов 0,83% хлористым аммонием. Подготовленные таким способом лимфоциты применялись в реакции спонтанного розет-кообразования. По-видимому, нам удалось выявить только часть розеткообразующих лимфоцитов в крови крупного рогатого скота. Предполагается, что хлористый аммоний оказывает побочное влияние на клетки, изменяя их поверхностные структуры.

Наиболее эффективным методом оказалось выделение лимфоцитов из крови подопытных животных на 17% верографине. После выделения клеточные суспензии были приготовлены на средах 199, «Игла», фосфатном буфере и в растворе Хенкса. Однако более подходящими из них были сбалансированный раствор Хенкса (рН=7,2) и фосфатный буфер (рН=7,2).

При постановке РСР по методам M. Biozzi (1966), M. Jandal (1972), J. Bach (1973), нами были получены, соответственно, 2,18%, 5,62% и 1,33% розеткообразующих клеток в крови здоровых животных. Исходя из результатов исследования, можно отметить, что данные условия постановки РСР, по-видимому, непригодны для осуществления идентификации Т-популяции лимфоцитов у этого вида животных. В связи с этим, необходимо в некоторой степени модифицировать постановку РСР и применять ее для исследования Т-лимфоцитов крупного рогатого скота.

Таким образом, для выявления популяции Т-лимфоцитов следует соблюдать некоторые условия. Во-первых, особенно важным является получение лимфоцитов методом, сохраняющим поверхностные структуры самой клетки. Для проведения РСР применялось соотношение лимфоцитов с эритроцитами барана 1:50. При этом данное соотношение не является строго фиксированным и может варьировать в отношении количества эритроцитов барана.

Представляет интерес тот факт, что для образования розеток лимфоцитами коров, в отличие от клеток человека, требуется ингибирование взвеси клеток при температуре 25оС, а затем длительная инкубация в ледяной ванне. Однако до настоящего времени нет единого мнения по поводу влияния этих двух факторов на формирование розеток. В результате исследований также было доказано, что для проведения РСР необходимо наличие сыворотки эмбриона крупного рогатого скота. Предполагается, что наличие эмбриональной сыворотки способствует стабильности образовавшихся розеток.

С целью изучения степени адгезивной способности лимфоцитов, из полученных суспензий были приготовлены препараты и проведен дифференциальный учет розеткообразующих клеток в зависимости от количества связанных эритроцитов барана. Все лимфоциты, образующие розетки, по количеству связанных ЭБ были разделены на четыре группы: 3-5, 6-10, 11-15 и 16-20 эритроцитов. Полученные результаты свидетельствуют, что лимфоциты крови здорового крупного рогатого скота, в основном, связывают от 3 до 10 эритроцитов и составляют 40-50% таких розеток. Изучение распределения розеток по количеству связанных (3-10) ЭБ показало, что при туберкулезе животных число розеткообразующих клеток колебалось в пределах 20-25%. Большая часть туберкулезных лимфоцитов адсорбировала на своей поверхности 16-20 ЭБ и составляла 35-45% от общего количества розеткообразующих лимфоцитов. Таким образом, туберкулезные лимфоциты проявляют более выраженную способность связывать эритроциты барана.

Количественное изучение розеткообразующей популяции лимфоцитов в крови и различных лимфоидных органах показало, что наибольшее количество этих клеток отмечалось в тимусе больных туберкулезом животных (табл. 1).

Таблица 1 Розеткообразующая популяция лимфоцитов в лимфоидных органах здорового и больного туберкулезом крупного рогатого скота

Орган	Здоровые		Больные
	Число опытов	Е-розеток, %	Число опытов	Е-розеток, %
Тимус	22	86,63±0,85	16	71,75±4,79
Лимфатические узлы	10	41,87±4,10	10	18,87±4,09
Селезенка	10	22,30±1,72	12	14,83±1,90
Костный мозг	10	0	9	1,66±1,21
Пятикратно	1	4,0	4	16,0

Следовательно, клетки лимфатических узлов интактных животных образовали, соответственно, в два раза меньше розеток, по сравнению с тимоцитами.

Более резкое снижение количества розеток было установлено у клеток, полученных из лимфоузлов от больного туберкулезом крупного рогатого скота. Следует отметить, что незначительная часть лимфоцитов костного мозга (1-2 %) больных коров образовала спонтанные розетки. Однако выявить розеткообразующие лимфоциты среди этих клеток у здоровых животных не удалось. В связи с чем, для окончательного объяснения полученных фактов, необходимы дальнейшие исследования.

Относительное содержание розеткообразующих лимфоцитов в периферической крови здоровых коров составляло 48,85±3,27%. У отдельных животных популяция этих клеток колебалась от 24% до 72% (табл. 2).

При сравнительном изучении Е-розеток у неспецифически и специфически реагирующих на ППД-туберкулин животных (20-30 и 30-50 тыс. лейкоцитов в 1 мм3 крови) различий между относительными результатами не было установлено. Более резкое снижение (2,33±1,20%) наблюдалось в группе с патологоанатомически выраженным туберкулезом.

Поскольку в каждой группе больных туберкулезом коров количество лейкоцитов и лимфоцитов было увеличено, мы сочли важным вычислить величину абсолютного содержания розеткообразующих клеток. Как показали результаты, абсолютное количество розеток свидетельствовало об увеличении популяции данных клеток. В зависимости от степени развития туберкулезного процесса, количество этих клеток увеличивается.

Таблица 2 Изменение содержания розеткообразующей популяции лимфоцитов в крови в зависимости от степени развития туберкулезного процесса

Группа животных	Число опытов	Кровь
		Лейкоцитов в 1 мм3, тыс.	Лимфоцитов, %	Е-розеток, %	Абсолютное содержание розеток в мм3 крови
Здоровые	20	7,38±0,43	47,31±0,97	48,85±3,27	1705,58±190,82
Неспецифически реагирующие на ППД-туберкулин	27	20-30	89,40±0,74	17,22±1,13	3679,32±240,91
Специфически реагирующие	17	30-50	87,35±0,94	17,35±1,63	5740,79 ±537,65
Патологоанатомически выраженный туберкулез	5	200-600	98,33±0,32	2,33±1,20	91643,56±279,47
Пятикратно		1	4,0	4	16,0

Следует отметить, что на основании полученных данных сложно судить о функциональных свойствах лимфоидных органов, но можно предполагать, что розеткообразующие лимфоциты являются Т-лимфоцитами. В пользу такого предположения свидетельствуют следующие факты: наибольший процент Е-розеток содержится среди клеток тимуса и значительно меньший - в селезенке; анти-тимоцитарная сыворотка преимущественно действует на розеткообразующие лимфоциты (цитотоксический тест, ингибирование спонтанного розеткообразования).

Заключение. Для идентификации Т-популяции лимфоцитов в крови и лимфоидных органах крупного рогатого скота пригоден метод спонтанного розеткообразования. Установлено, что 48,85% лимфоцитов крови, 86,63% тимуса, 41,87% лимфатических узлов, 22,30% селезенки и 0% костного мозга здоровых коров образуют спонтанные розетки (Т-лимфоциты). Относительное содержание Т-лимфоцитов в крови и лимфоидных органах больных туберкулезом коров значительно снижено.

Список литературы:

1. Баратов, М. О Розеткообразующие лимфоциты в оценке иммунологического состояния при туберкулезе крупного рогатого скота // Ветеринарный врач. 2019. № 3. С. 34-38.

2. Ветеринарная микробиология и иммунология / Радчук Н. А., Дунаев Г. В., Колычев Н. М. [и др.] // Агропромиздат. 1991. 383 с.

3. Донченко, А. С. Туберкулез КРС, верблюдов, яков, овец и пантовых оленей / А. С. Донченко, В. Н. Донченко// 1994. 352 с.

4. Жаров, А. В. Влияние Т- и В- активинов на крыс при экспериментальном сальмонеллезе / А. В. Жаров, Е. В. Зимина // Ветеринария. 2001. № 9. С. 23-26.

5. Иммунофизиология / В. А. Черешнев, Б. Г. Юшков, В. Г. Климин, Е. В. Лебедев // УРО РАН. 2002. 260 с.

6. Карпенко, Л. Ю. Иммунобиохимические характеристики организма собак разных возрастов и при гломерулонефрите: автореф. дисс. ... канд. ветер. наук // 2001. 20 с.

7. Коляков, Я. Е. Ветеринарная иммунология // Агропромиздат. 1986. С. 270.

8. Лабораторная гематология / С. А. Луговская, В. Т. Морозова, М. Е. Почтарь, В. В. Долгов // 2002. 120 с.

9. Петров, Р. В. Основы иммунитета и иммунная биотехнология / Р. В. Петров, Р. М. Хаитов // Вестник Российской академии медицинских наук. 2000. № 11. С. 18-21.

10. Радченков, В. П. Розеткообразующие лимфоциты крупного рогатого скота и рациональные методы их выявления / В. П. Радченков, И. И. Соколовская // Лечебное дело. 1980. № 8. С. 476-478.

11. Сравнительная оценка иммунного статуса бычков различных пород / З. Г. Бикбулатов, Н. Ш. Мамлеев, М. Я. Вырская, Р. Т Маннапова // Ветеринария. 1998. № 6. С. 45.

12. Узенбаева, Л. Б. Морфобиохимические показатели и метаболизм лейкоцитов крови у норок-стригунов / Л. Б. Узенбаева, В. А. Илюха // Сель-скохозяйствиенная биология. 2001. № 4. С. 78-82.

13. Moller G. The B-cell antigen receptor complex // Immunol Rev. 2019. No. 132. Pp. 5-15.

14. Moss P. The human T-cell receptor in health and disease / P. Moss, W. Rosenberg, J. Bell // Annu. Rev. Immunol. 2017. No. 10. Pp. 71-78.

15. Tizard I. R., Saunders W. B. Veterinary Immunology / 2003. 890 p.

Резюме. Авторами проведено сравнительное изучение реакций спонтанного розеткообразования для определения Т-лимфоцитов в крови здорового и больного туберкулезом крупного рогатого скота. В работе использовались лимфоциты, изолированные из крови и лимфоидных органов 72 здоровых и 96 больных туберкулезом коров. Наиболее эффективным оказался метод выделения лимфоцитов на 17% верографине. Для приготовления суспензии были использованы среды 199, «Игла», на фосфатном буфере и в растворе Хенкса, из которых наиболее подходящими оказались сбалансированный раствор Хенкса (рН=7,2) и фосфатный буфер (рН=7,2). Установлено, что большая часть туберкулезных лимфоцитов адсорбировала на своей поверхности 16-20 эритроцитов барана (35-45% от общего количества розеткообразующих лимфоцитов). Наибольшее количество этих клеток отмечалось в тимусе больных туберкулезом животных. Относительное содержание розеткообразующих лимфоцитов в периферической крови здоровых коров составило 48,85±3,27%. У отдельных животных популяция этих клеток колебалась от 24% до 72%. Более резкое снижение (2,33±1,20%) розеткообразующих лимфоцитов отмечено в группе с патологоанатомически выраженным туберкулезом. Абсолютное количество розеток увеличивалось в зависимости от степени развития туберкулезного процесса. Таким образом установлено, что лимфоциты крови здоровых коров образуют спонтанные розетки. Количество Т-лимфоцитов в крови и лимфоидных органах больных коров значительно снижено. Для окончательного объяснения полученных противоречивых фактов необходимы дальнейшие исследования.

Ключевые слова: Т-лимфоциты, розеткообразование, туберкулез, бла-странсформация, крупный рогатый скот, лимфоидные органы, Ес-фрагменты иммуноглобулинов, периферическая кровь.

Сведения об авторах:

Семененко Марина Петровна, доктор ветеринарных наук, доцент, врио директора Краснодарского научно-исследовательского ветеринарного института - обособленного структурного подразделения ФГБНУ «Краснодарский научный центр по зоотехнии и ветеринарии»; 350004, г. Краснодар, ул.1-я Линия, 1; тел.: 8-918-4612663; е-mail: sever291@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Баратов Магамед Омарович, доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник, заведующий лабораторией инфекционной патологии Прикаспийского зонального научно-исследовательского ветеринарного института -филиала ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Республики Дагестан»; 367000, Республика Дагестан, г. Махачкала, ул. Дахадаева, 88; тел.: 8-928-5010948; е-mail: alama500@rambler.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей