rus eng
Архив номеров / Номер 5, 2019 год Распечатать

Антибиотикоиндуцированная морфологическая пластичность кишечной палочки, изолированной от животных

УДК619:579.842.11

Корочкин Р.Б.,Красочко И.А., Гвоздев С.Н. УО «Витебская ордена «Знак Почета
государственная академия ветеринарной медицины», Республика Беларусь, г. Витебск
Кривонос Р.А. департамент ветеринарии Краснодарского края, г. Краснодар
Черных О.Ю. ГБУ КК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория», г. Кропоткин
Лысенко А.А. ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина», г. Краснодар

Введение. После открытия антибиотиков в середине прошлого века антибиотикотерапия позволила добиться снижения численности и тяжести проявления инфекционных болезней. Тем не менее, частым следствием их применения в производственной среде является появление резистентных штаммов микроорганизмов, причем механизмы развития антибиотикорезис-тентности у бактерий многосторонни, а фенотипическим следствием приобретения устойчивости к антибактериальным препаратам является появление морфологически абберантных разновидностей в микробиологическом явлении, называемом морфологической пластичностью. Морфологическая пластичность бактерий является особым феноменом, благодаря которому бактерии приобретают адаптивные преимущества для приспособления к изменяющимся условиям среды. В настоящее время, совокупность факторов окружающей среды, которые могут индуцировать образование фенотипически гетерогенных форм бактерий, в целом определена, но лежащие в основе молекулярные механизмы остаются в основном неизвестными. Физические и химические воздействия, вызывающие морфологические вариации у бактерий, в основном связаны с изменениями механизмов биосинтеза компонентов клеточной стенки. К таким факторам относят голодание, оксидативный шок, протестное хищничество, антимикробные агенты, температурные стрессы, осмотический шок и механические ограничения. Морфологическая абберация приводит к трансформации микроорганизмов в различные морфологические варианты, причем большинство из них в конечном итоге реверсируют к типичной морфологии клеток [5].

Характерная морфология бактерий поддерживается в течение бесконечного числа поколений и рассматривается в качестве видоспецифического фенотипического признака, однако периодически она может меняться в разные этапы жизненного цикла. Бактериальная форма генетически детерминирована, однако физические и химические факторы в настоящее время признаются в качестве основных участников морфогенеза бактерий.

Бактериальная морфология в основном определяется пептидог-ликано-вым (ПГ) экзоскелетом [6], полимерной макромолекулярной структурой, которая окружает цитоплазматическую мембрану и является основным жестким элементом в бактериальной оболочке. Пептидогликановая оболочка в бактериях обеспечивает постоянство морфологии бактерии, однако она также и достаточно пластичная, допуская динамические модификации. Пептидогликан представляет собой полимер гликановых цепей, сшитых пентапептидными мостиками [4]. Структура мономерной субъединицы, N-ацетилглюкозаминил-Ы-ацетилмурамил-1_-аланил-0-глутаминил-1_-(мезо) диаминопимелил-D-аланил-Э-аланин (GlcNAc-MurNAc-L-Ala-D-Glu-L-mesoDAP-D-Ala-D-Ala), устойчиво единообразна по всему филогенетическому древу бактерий. Немногочисленные вариации представляют собой либо изменение аминокислотной последовательности пептида (почти всегда диаминокислоты в положении 3), либо следствия дополнительных реакций, которые модифицируют основную субъединицу (например, O-ацетилирование сахаров или амидирование дикарбоновой аминокислоты) [1].

Фенотипическая пластичность известна у разных видов бактерий. В зависимости от селективного давления, физических ограничений, моделей роста и деления, морфология бактерий очень разнообразна даже у близкородственных родов. Для некоторых бактерий в их естественной среде обитания, таких как Caulobacter crescentus в пресной воде с ограниченным наличием питательных веществ и уропатоген-ной кишечной палочки Escherichia coli (UPEC) в мочевых путях млекопитающих, морфологическая пластичность играет ключевую роль в большей выживаемости в неблагоприятных условиях. Модуляция морфогенеза бактерий, вызванная различными факторами окружающей среды, чаще имеет взаимосвязь между воздействиями окружающей среды и молекулярными путями метаболизма, которые прямо или косвенно изменяют сборку пептидогликана, приводя к трансформации бактериальной морфологии. Например, превращение UPEC и Mycobacterium tuberculosis в филаментные (нитчатые) бактерии вызвано ингибированием дивисом через активацию SOS-системы бактерий или индуцировано продукцией активных форм кислорода [5]. Филаментация представляет одну из разновидностей морфологической пластичности бактерий.

Целью настоящей работы стало рассмотрение кишечной палочки (Escherichia coli) в качестве основной иллюстрации морфологической пластичности бактерий, чтобы обсудить причину морфологической аб-берации и вероятную связь антибиотикотерапии с появлением филаментных форм бактерии.

Материалы и методы исследований. Материалом для исследования служил биоматериал, полученный от 12 птиц и 8 свиней из двух различных сельскохозяйственных предприятий Гомельской области. Бактериологическому исследованию были подвергнуты пробы внутренних органов (печень, брыжеечные лимфатические узлы, селезенка, почки). Предприятия - источники происхождения биоматериала для исследования были благополучными по инфекционным болезням; противоэпизоотические мероприятия осуществлялись в полном объеме согласно плану. В поголовьях предприятий отмечаются единичные случаи падежа молодняка животных, регистрируемые как следствие незаразной патологии. В качестве лечебно-профилактических средств используются антибиотики различных групп, в том числе цефалоспоринового ряда.

У павших животных при жизни отмечали диарейный синдром средней интенсивности, животные подвергались лечению одним из антибиотиков цефалоспориновой группы.

Бактериологическое исследование проводили с целью идентификации возбудителя, учитывая возможный спектр диареагенных микроорганизмов (кишечная палочка, сальмонеллы, энтеробактерии ассоциативных кишечных инфекций). Первичную изоляцию микроорганизмов проводили на среде Эндо с последующей идентификацией по биохимическим тестам на цветном ряде. Исследование морфологии выделяемых микроорганизмов и определение подвижности проводили микроскопическим методом.

Таблица 1. Чувствительность изолята E. coli к антибиотикам (диско-диффузионным методом в мм)

Название

Чувствительность, мм

Название

Чувствительность, мм

Название

Чувствительность, мм

1

Тетрациклин

-

22

Бензилпеницилин

-

43

Рифампицин 94

-

2

Канамицином

-

23

Норфоксацин

-

44

Зеннат

10

3

Эритромицин

-

24

Амоксициллин

-

45

Флуконазол

-

4

Стрептомицин

-

25

Цефипин

5

45

Цефтозидин

-

5

Цефепим

-

26

Полимексин

-

47

Оксацилин

-

6

Азтреонам

-

27

Олеандромицин

-

48

Ломефлоксацин

-

7

Цефоперазон

-

28

Цефтазидим

-

49

Эритромицин

-

8

Гентамицин

10

29

Цефалексин

-

50

Цефтазидин

-

9

Ципрофлоксацин

-

30

Ампицилин

-

51

Левофлоксацин

-

10

Нетилмицин

-

31

Амикацин

5

52

Каномицин

-

11

Цефтазидим

-

32

Цефазолин

-

53

Цефаклор

5

12

Офлоксацин

5

33

Нетилмицин

15

54

Новобиоцин

-

13

Пиперациллин

-

34

Фурадонин

5

55

Петиллицин

-

14

Азлоциллин

-

35

Цефуроксим

-

56

Клиндамицин

-

15

Тобрамицин

10

36

Цефотоксин

-

57

Кларитромицин

-

16

Карбенициллин

-

37

Цефалотин

-

58

Фурагин

10

17

Полимиксин

-

38

Цефтриаксон

15

59

Доксициклин

-

18

Левамицин

-

39

Нортрил 5%

10

60

Энрофлоксацин

-

19

Мерапенем

-

40

Галлимицин

10

61

Боцитроцин

-

20

Цефиксин

-

41

Интрамицин

30

62

Solvasol

-

21

Ампицилин

5

42

Pogomuym

-

 

 

 

Результаты исследований и их обсуждение. В ходе бактериологического исследования из проб биоматериала (внутренних органов) была выделена кишечная палочка Escherichia coli, которая была идентифицирована по совокупности фенотипических признаков (биохимических свойств). Для более достоверного определения видовой принадлежности изолят был подвергнут повторной идентификации в автоматическом микробиологическом анализаторе Vitek 2, в ходе чего были подтверждены результаты первоначального лабораторного анализа. Выделенный изолят был подвергнут исследованию по морфологическим и культуральным признакам.

Выделенный микроорганизм имел нехарактерную для кишечной палочки форму в виде нитевидной (филаментной) морфологии. Филаментные клетки были в 10-50 раз длиннее, чем их типичные морфологические аналоги, сохраняли грамотрицательную окраску.

Изучение подвижности выделенного изолята проводили в минимальной питательной среде (калий-фосфатный буферный раствор с добавлением глюкозы). Нами было проведено наблюдение клеток на предметных стеклах на границе раздела жидкость-стекло с увеличением х40 при 28°C в образцах, взятых каждые 30 минут из культур, инкубируемых при 35°C. Изучение характера подвижности выделенной культуры проводили по сравнению с характером движения микроорганизма Escherichia coli ATCC 25922 в аналогичных условиях.

Как известно, у микроорганизма Escherichia coli имеется около шести жгутиков, расположенных случайным образом по всей поверхностей клетки, которые обеспечивают подвижность бактерии. При вращении жгутика против часовой стрелки они образуют пучок на одном конце клетки, что создает импульс движения бактерии вперед; это явление называется «пробегом» и обычно длится от 1 до 2 с. Когда вращение происходит по часовой стрелке, вектор движения разнонаправлен в противоположные стороны, в результате чего бактерия делает кувырок в течение времени продолжительностью менее секунды [3]. Данный характер подвижности демонстрировал микроорганизм, зарегистрированной в Американской типовой коллекции культур (American type culture collection) под номером ATCC 25922.

Филаментные формы кишечной палочки также были подвижными, могли осуществлять пробег, однако, бактериальные клетки имели значительную более вытянутую морфологию для осуществления кувырка, поэтому после фазы пробега наступала фаза остановки. В любой момент времени подвижные клетки составляли диапазон от 35 до 85% от общего числа наблюдаемых клеток; остальная часть клеток была предположительно прикреплена к поверхности стекла. Все подвижные филаментные бактерии непрерывно двигались и останавливались с 3-6 остановками в течение 10 секунд. Вектор движения после остановки сохранял либо то же направление, что во время фазы пробега, либо имел противоположную направленность.

После изучения морфологических свойств изолята проводили сохранение микроорганизма в лабораторных условиях в течение 4 недель (срок наблюдения) при 35°С с еженедельным контролем подвижности и морфологии. В течение всего срока наблюдения микроорганизм сохранял филаментную морфологию и характер подвижности, установленные в момент изоляции из биоматериала.

Фенотипические свойства изолята проводили по изучению его биохимической активности в отношении глюкозы и лактозы, по характеру роста на среде Симмонса, определению гемолитических свойств, продукции сероводорода, утилизации мочевины. Полученные в ходе опыта результаты по биохимической активности показали сохранение первоначального набора фенотипических при-знаков в течение всего срока наблюдения (4 недели).

Таким образом, сохранение абберантности морфологии выделенной кишечной палочки в течение месяца наблюдения в лабораторных условиях не-сколько противоречит цитируемым утверждениям о реверсии морфологических вариантных модификации бактерий к типичной морфологии [5]. Тем не менее, установление динамики реверсии выделенного изолята не лежало в фокусе на-ших исследований, поэтому нами констатируется лишь факт сохранения морфологической гетерогенности выделенной культуры в течение срока наблюдения (4 недели).

Отдельный интерес изучения фенотипических свойств выделенной филаментной формы кишечной палочки представляло изучение чувствительности изолята к антибиотикам, так как антибиотикотерапия является одной из наиболее вероятных причин морфологической модуляции микроорганизмов. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Результаты определения чувствительности выделенного микроорганизма к антибиотикам позволяют отнести его к числу мультире-зистентных штаммов, так как только 2 антибиотика - нетилмицин и интрамицин из общего количества использованных в опыте (3,2%) демонстрировали высокую активность. Абсолютная устойчивость бактерии к 46 антибиотикам (74,2%) свидетельствовала о высокой резистентности филаментной формы кишечной палочки к антибактериальным препаратам.

При дальнейшем анализе была изучена возможная причина появления абберантной формы кишечной палочки в производственной среде. Одной из наиболее частых причин морфологической пластичности бактерий является использование антибиотиков. Антимикробные агенты, включая антибиотики, антимикробные пептиды и литические ферменты, действуя на клеточную стенку, клеточные мембраны, нуклеиновые кислоты и белки, связанные с репликацией хромосом, приводят к появлению динамичных морфологических вариантов бактерий. В хозяйстве, откуда был получен биоматериал, животные подвергаются частым лечебно-профилактическим обработкам антибиотиками цефалоспоринового ряда, хотя результаты наших исследований демонстрируют (таб. 1), что все препараты этой группы имеют нулевую активность в отношении изолята, за исключением цефтриаксона, являющегося цефалоспориновым антибиотиком III поколения. Известно, что цефалоспорины характеризуются бактерицидным действием в отношении многих микроорганизмов и обладают тем же механизмом действия, что и другие в-лактамные антибиотики, но менее чувствительны к в-лактамазам. Цефалоспорины нарушают синтез пептидогликана [2], образующего клеточную стенку. Согласно отдельным работам [3], цефалоспориновые антибиотики за счет нарушения биосинтеза пептидогликана рассматриваются как наиболее частая причина появления морфологически абберантных бактерий, что нашло применение в лабораторных исследованиях морфологической пластичности бактерий.

Заключение.

1. Морфологическая пластичность бактерий является механизмом их адаптации к неблагоприятным экологическим нишам, в том числе связанным с антибиотикотерапией.

2. Филаментные формы кишечной палочки сохраняют свои патогенные свойства, так как могут быть изолированы из экстраинтести-нальных тканей при диарейной патологии.

3. Абберантные филаментные формы кишечной палочки сохраняют биохимическую активность, характерную для типичных форм бактерии, однако демонстрируют измененную морфологию и характер движения.

4. Неконтролируемое использование антибиотиков цефалоспоринового ряда может приводить к появлению морфологически абберан-тных форм кишечной палочки в производственной среде.

5. При проведении лабораторного анализа микробиологическим лабораториям следует учитывать возможность выделения нетипичных морфологических вариантов микроорганизмов.

Список литературы:

  1. Cava F. Peptidoglycan plasticity in bacteria: emerging variability of the murein sacculus and their associated biological functions/ F. Cava, M.A. de Pedro// Current opinion in microbiology. - 2014. - Vol. 18. - P. 46-53.
  2. Cefuroxime, a New Cephalosporin Antibiotic: Activity In Vitro/ C.H. O'Callaghan, R.B. Sykes, A. Griffiths, J.E. Thornton// Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 1976. - Vol. 9, Issue 3. - 511-519.
  3. Motility and Chemotaxis of Filamentous Cells of Escherichia coli/ N. Maki [et al.]// Journal of bacteriology. - 2000. - Vol. 182, Issue 5. - p. 4337-4342.
  4. Muriel van Teeseling C.F. Determinants of Bacterial Morphology: From Fundamentals to Possibilities for Antimicrobial Targeting/ C.F. Muriel van Teeseling, M.A. de Pedro, F. Cava// Frontiers in microbiology. - 2017. - Vol. 8. - P. 1264.
  5. Shen J.-P. Morphological plasticity of bacteria - Open questions/ Jie-PanShen, Chia-Fu Chou// Biomicrofluidics. - 2016 - Vol. 10, Issue 3. - P. 1-17.
  6. Weidel W. The rigid layer of the cell wall of Escherichia coli strain// W. Weidel, H. Frank, H.H Martin// General Microbiology. - 1960. - Vol. 22. - P. 158-166.

Резюме. Морфологическая пластичность, вызванная различными факторами окружающей среды, характеризуется появлением измененной морфологии у бактерий и рассматривается как стратегия адаптации к неблагоприятным условиям. Физические и химические воздействия, вызывающие морфологические вариации у бактерий, в основном связаны с изменениями механизмов биосинтеза компонентов клеточной стенки. В основном это такие факторы как голодание, оксидативный шок, протестное хищничество, антимикробные агенты, температурные стрессы, осмотический шок и механические ограничения. Эти факторы приводят к трансформации микроорганизмов в различные мор -фологические варианты, которые затем реверсируют к типичной морфологии клеток. В данном исследовании изучена одна из основных причин появления изменчивости и появления видоизмененных форм бактерий. Это действие антибиотиков, которые нарушают синтез пептидогликанового слоя. Известно, что цефалоспорины обладают бактерицидным действием в отношении многих микроорганизмов и обладают тем же механизмом действия, что и другие в-лактамные антибиотики, но менее чувствительны к в-лактамазам. Цефалоспорины нарушают синтез пептидогликана, образующего клеточную стенку. Бактериологические исследования проводили с целью идентификации возбудителей, учитывая возможный спектр диареагенных микроорганизмов, а именно кишечной палочки, сальмонелл, энтеробактерий и ассоциативных кишечных инфекций. Результаты определения чувствительности выделенного штамма кишечной палочки к 62 антибиотикам позволяют отнести его к числу мультирезистентных штаммов, так как только 2 антибиотика - из общего количества использованных в опыте (3,2%) демонстрировали высокую активность. Абсолютная устойчивость бактерии к 46 антибиотикам (74,2%) свидетельствовала о высокой резистентности филаментной формы кишечной палочки к антибактериальным препаратам. Таким образом авторами экспериментальными исследованиями подтверждено, что неконтролируемое использование антибиотиков цефалоспоринового ряда может приводить к появлению морфологически измененных форм кишечной палочки в условиях животноводческих предприятий.

Ключевые слова: морфологическая пластичность, кишечная палочка, филаментные формы, морфология бактерий, биосинтез, клеточная стенка, цефалоспорины, фенотип, антимикробные агенты, температурные стрессы, осмотический шок.

Сведения об авторах:

Корочкин Рудольф Борисович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры микробиологии и вирусологии УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»; 210027, Республика Беларусь, г. Витебск, ул. Доватора, 7/11; e-mail: rudolfvit@mail.ru.

Красочко Ирина Александровна, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»; 210027, Республика Беларусь, г. Витебск, ул. Доватора, 7/11; e-mail: rudolfvit@mail.ru.

Гвоздев Сергей Николаевич, ассистент кафедры микробиологии и вирусологии УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины»; 210027, Республика Беларусь, г. Витебск, ул. Доватора, 7/11; e-mail: rudolfvit@mail.ru.

Кривонос Роман Анатольевич, кандидат ветеринарных наук, руководитель департамента ветеринарии Краснодарского края; 350000, г. Краснодар, ул. Рашпилевская, 36; тел.: 8-861-2621923; е-mail: uv@krasnodar.ru.

Черных Олег Юрьевич, доктор ветеринарных наук, директор ГБУ КК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория»; 352380, г. Кропоткин, ул. Красноармейская, 303; тел.: 8-918-4956659; е-mail: gukkvl50@kubanvet.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Лысенко Александр Анатолиевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры терапии и фармакологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»; 350089, г. Краснодар, ул. Рождественская набережная, 29, кв. 7; тел.: 8-961-5075415; e-mail: vetkubgau@mail.ru.

 

   
2011 © Ветеринария Кубани Разработка сайта - Интернет-Имидж