Методы корректировки индукции суперовуляции с целью получения оптимального количества эмбрионов, пригодных к трансплантации

УДК 619:618:615.37:636.2

Косовский Г.Ю., Попов Д.В., Бригида А.В. ФГБНУ"Центр экспериментальной
эмбриологии и репродуктивных биотехнологий", г. Москва

Введение. Одной из проблем, ограничивающих широкое применение репродуктивных биотехнологий, является недостаточная разработанность их первого этапа - индукции суперовуляции у коров-доноров. До сих пор отсутствуют достаточно надежные прогнозы эффективности применяемых приемов индукции суперовуляции, недостаточно исследованными остаются вопросы индивидуальной изменчивости коров в ответ на применяемые схемы [1].

Следует подчеркнуть, что к настоящему времени разработано множество протоколов индукции суперовуляции в яичниках коров с использованием гонадотропинов в сочетании с простагландинами, в соответствующих методических рекомендациях приводится большое количество схем применения гормональных препаратов используемых в этих целях [9]. Все эти методы, в общем, позволяют вызвать множественную овуляцию в яичниках у определенного процента коров. Одним из существенных недостатков имеющихся приемов индукции суперовуляции является высокая вариабельность количества получаемых от обработанных животных эмбрионов [8, 11]. Принято считать, что лишь половина коров, реагирующих на введение гонадотропинов, может дать 4-5 эмбрионов, пригодных для трансплантации [7].

Можно ожидать, что эффективность индукции суперовуляции во многом зависит от работы гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы и напрямую связана с исходной активностью процессов, происходящих в этой нейроэндокринной оси конкретного организма [10]. Разнообразие реакции яичников связывается с различиями в индуцировании суперовуляции, таких как подготовка доноров, партия и общая доза основного индуктора, использование дополнительных гормонов, а также индивидуальные особенности животных. Все эти факторы могут лежать в основе вариабельности ответа на суперовуляцию при использовании известных схем ее индукции. Известные индукторы и протоколы их введения, созданные для усиления фолликулярной волны, всё же не способны исключить вариативность реакции на суперовуляцию [4]. Поэтому особую актуальность для решения этой проблемы приобретают вопросы выравнивания по разным биологическим характеристикам коров-доноров эмбрионов и подбор оптимального сочетания индукторов и режимов их введения для увеличения результативности суперовуляции у коров и получения относительно лучше прогнозируемого количества эмбрионов, пригодных для эмбриотрансплантаций [2, 3].

В настоящей работе апробированы методы и оценена эффективность применения иммуномодулятора тималин для подготовки ко-ров-доноров к индукции суперовуляции.

Материалы и методы. Практические и научные исследования проводили на базе отдела экспериментальной трансплантологии Федерального государственного бюджетного научного учреждения "Центра" экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, на поголовье здоровых коров черно-пестрой голштинизиро-ванной породы в возрасте 4-5 лет, в условиях промышленной молочной фермы ЗАО "Можайский", с участием специалистов хозяйства.

Опытные группы животных формировали по принципу пар-аналогов, исходя из физиологического состояния, возраста, продуктивности, живой массы и стадии полового цикла. Для исследований подбирали здоровых животных, в возрасте 4-5 лет, которые после отела в течение сервис-периода (3 месяца) проявляли полноценную половую цикличность (наличие всех феноменов полового цикла).

Первой группе коров-доноров с целью индуцирования суперовуляции применяли стандартную схему, включающую внутримышечное введение препарата ФСГ-супер на 9-, 10-, 11-, 12-е сутки спонтанного эстрального цикла в дозах 12, 8, 4, 4 мг/гол/ в сутки и простагландина магэстрофана - 4 мл/гол внутримышечно однократно, на 12-е сутки. Второй и третьей группам коров-доноров в дополнение к стандартной схеме с целью отработки метода корректировки индукции суперовуляции для получения оптимального количества эмбрионов, пригодных к трансплантации, внутримышечно вводили тималин 30 мг/гол/сут.. соответственно, на 1-5-е и 5-10-е сутки спонтанного полового цикла [2, 3, 5, 6, 7].

Тималин - пептидный препарат вилочковой железы. Пептиды тимуса обладают высокой избирательностью действия и эффективны в очень малых дозах. Показано, что кислые аминокислоты Glu, Asp являются как медиаторами, опосредующими синаптическое возбуждение в ЦНС млекопитающих, так и модуляторами синаптической передачи.

Результаты исследований. В результате проведенных исследований установлено, что наилучшие результаты по количеству коров-до-норов пришедших в состояние половой охоты, получены во 2-й группе (96,0%), а эффект синхронизации проявился лучше у животных 2-й и 3-й группах, где через 48 часов пришли в состояние половой охоты 95,8% животных, что на 15,6% больше, чем в 1-й группе (табл. 1). Во всех группах коров-доноров эффект синхронизации был наибольшим через 48 часов после введения F2a (магэстрофана). Полноценность протекания феноменов полового цикла (течка, половая охота и овуляция) была наиболее полной во второй группе (91,6%), не намного меньше она составила и в 3-й группе - 90,9%. В 1-й (контрольной) группе животных полноценное проявление стадии возбуждения полового цикла после обработки эстрофаном отмечено у 85,0% коров.

Таблица 1. Эффективность синхронизации феноменов полового цикла у коров-доноров.

Группа	Пришло в охоту через, час			Всего коров в охоте, гол. (%)	Полноценность протекания феноменов (синхронность), гол. (%)	Отсутствие половых циклов, гол. (%)
	24	48	72
1 контроль n=25	1	16	3	20 (80)	17 (85)	5 (20)
2 стандартная схема + тималин (0-­5 сут) n=25	0	23	1	24 (96)	22 (91,6)	1 (4)
3 стандартная схема + тималин (5-10 сут) n=25	1	21	0	22 (88)	20 (90,9)	3 (12)

В результате индукции суперовуляции и синхронизации охоты при стандартной схеме обработки коров-доноров, овуляция фолликулов затягивается по времени и спустя 7-8 суток после осеменения, при вымывании эмбрионов, определяются эмбрионы возраста 4-6 дней, которые не пригодны для дальнейшей трансплантации. Кроме этого фактора, отрицательно влияющего на качество эмбриопродуктивности коров-доноров, имеет место отрицательное влияние продолжительности индуцированной после гормональной обработки коров-доноров половой охоты и, соответственно, кратности искусственного осеменения на уровень оплодотворяемости яйцеклеток после суперовуляции.

Проведенные исследования показали, что у отдельных животных половая охота растягивалась на двое или трое суток и их осеменяли, соответственно, 3 и 4 раза с интервалом в 12 часов, в течение всего времени нахождения в состоянии охоты (табл. 2).

Таблица 2. Оплодотворяемость яйцеклеток у коров-доноров в зависимости от продолжительности половой охоты и кратности осеменений

Группа	Продолжи­тельность половой охоты, час	Кратность осеменений	Количество коров- доноров (%)	Количество вымытых эмбрионов	Количество вымытых неоплодо- творенных яйцеклеток, %
1 контроль (n = 20)	12	2	6(30)	50	16,7
	24	3	6(30)	78	9,8
	36	4	8(40)	70	26,1
2 (n = 24)	12	2	7(29,2)	49	8,3
	24	3	10(41,6)	53	4,6
	36	4	7(29,2)	95	12,2
3 (n = 22)	12	2	6(27,4)	34	14,1
	24	3	8(36,3)	99	7,9
	36	4	8(36,3)	103	18,3

Отмечено, что с увеличением продолжительности половой охо­ты увеличивается количество вымытых эмбрионов, что говорит об увеличении количества овуляций. Вместе с тем оплодотворяемость яйцеклеток была наилучшей во 2-й группе коров-доноров (4,6% неоп- лодотворенных яйцеклеток), что гораздо ниже показателей в 1-й (конт­роль) группе - 9,8% и в 3-й группе - 7,9%. Таким образом, у коров 2-й группы отмечен наибольший процент оплодотворяемости яйцеклеток в индуцированную охоту и наилучший показатель по синхронизации охоты по отношению к остальным группам коров-доноров.

Изучение влияния продолжительности половой охоты на стадию развития эмбрионов и их качество показано в таблице 3. Из представ­ленных данных видно, что общее количество вымытых эмбрионов на разной стадии развития составило: в 1-й группе - 198; 2-й - 187; 3-й - 236. Из них общее количество пригодных для трансплантации эмб­рионов по группам было: 1-я группа - 104 (52,5%); 2-я группа - 158 (84,5%); 3-я группа - 110 (46,6%).

Таблица 3. Синхронность развития вымытых эмбрионов при различных схемах индукции суперовуляции у коров-доноров

Группа	Средняя продолжительность половой охоты	Стадия развития вымытых эмбрио­нов	Количество доноров	Общее количество вымы­тых клеток	Количество вымы­тых клеток (на одного донора)	Общее коли­чество вымытых эмбрионов, пригодных для транс­плантации, (%)	Коли­чество вымытых эмбрионов, пригодных для трансплан­тации (на одного донора)
1 n=20 (контроль)	12	морулы бласто­цисты	5 6	31 19	6,2±1,6 3,1±0,8	15 (48,4) 10 (52,6)	3,0±0,8 1,7±0,4
	24	морулы бласто­цисты	6 6	53 25	8,8±1,4 4,2±0,8	44 (83,0) 12(48,0)	7,3±1,2 2,0±0,3
	36	морулы бласто­цисты	8 6	52 18	6,5±1,5 3,0±0,7	20 (38,5) 3 (16,7)	2,5±0,3 0,5±0,1
2 n=24	12	морулы бласто­цисты	6 7	32 17	5,3±1,3 2,4±0,3	26 (81,2) 15 (88,2)	4,3±0,6 2,1±0,2
	24	морулы бласто­цисты	10 7	35 18	3,5±0,7 2,5±0,4	32 (91,4) 12 (66,7)	3,2±1,4 1,7±0,3
	36	морулы бласто­цисты	7 7	65 30	9,2±1,2 5,1±0,6	53 (81,5) 20 (66,6)	7,5±1,4 2,8±0,3
3 n=22	12	морулы бласто­цисты	6 4	20 14	3,3±1,1 3,5±0,7	12 (60,0) 9 (64,28)	2,0±0,2 2,2±0,1
	24	морулы бласто­цисты	7 8	41 58	5,8±1,2 7,2±0,9	32 (78,0) 28 (48,3)	4,6±0,4 3,5±0,5
	36	морулы бласто­цисты	8 8	54 49	6,7±1,4 6,1±08	21 (38,9) 8 (16,3)	2,6±0,3 1,0±0,1

Таким образом, общее количество эмбрионов, пригодных для трансплантации, из расчета на одного донора по группам составило: 1-я (контроль) группа - 17,0; 2-я - 21,9; 3-я - 15,9. Наилучшие результаты по получению пригодных эмбрионов в зависимости от продолжительности половой охоты отмечены при ее продолжительности (во всех группах) 24 часа. Сравнение качества полученных эмбрионов вымытых на 7-е сутки после оплодотворения во время индуцированной половой охоты показало, что количество морул и бластоцист было больше к этому времени у коров-доноров 2-й группы по отношению к 1-й (контроль) группе и к 3-й группе.

Выводы.

1. После применения тималина на 0 - 5-е сутки в стандартной схеме вызывания суперовуляции пришли в состояние половой охоты после введения эстрофана (Ф2-альфа) 96 % животных, против 80 % в контроле и 88% после применения тималина на 5-10 сутки.
2. Синхронность проявления феноменов полового цикла составила: а) после применения тималина на 0-5 сутки - у 91,6 % животных; б) после применения тималина на 5-10 сутки - у 90,9% коров; в) в контрольной группе (только стандартная схема суперовуляции) - 85,0 % животных.
3. Оплодотворяемость яйцеклеток в индуцированную половую охоту у коров-доноров после применения тималина на 0-5 сутки отмечена у 95,4% животных (4,6% неоплодотворенных), в контрольной группе - 91,2 % (9,8% неоплодотворенных) и после применения тима-лина на 5-10 сутки - у 92,1 % (7,9% неоплодотворенных).
4. Синхронность развития вымытых эмбрионов после включения тималина в стандартную схему вызывания суперовуляции у ко-ров-доноров на 0-5 сутки составила 91,4 % на стадии морулы и 66,7% - бластоцисты. После применения тималина на 5-10 сутки - 78,0 % морул и 48,3 % бластоцист. В контрольной группе - 83,0 % морул и 48,0 % бластоцист.
5. Общее количество вымытых эмбрионов на одного донора после применения тималина на 0-5 сутки составило 21,9. После применения тималина на 5-10 сутки - 15,9 и в контрольной группе- 17,0.
6. Для повышения качества эмбриопродуктивности коров-доно-ров эмбрионов, к стандартной схеме гормональной индукции суперовуляции рекомендуется дополнительное внутримышечное введение на 0-5 сут спонтанного полового цикла препарата тималин в дозе 30 мл/гол/сут.

Список литературы:

1. Бабенков В.Ю. Усовершенствование способа индуцирования суперовуляции у коров доноров // Биотехнология и воспроизводство в животноводстве. Тезисы докладов. - Горки. 1991. С. 6-8.
2. Мадисон В., Мадисон Л. В помощь "новому" скотоводу // Молочное и мясное скотоводство. - 2003. - № 4. - С. 10-16.
3. Малинин В.В. Механизмы пептидной регуляции гомеостаза В.В.Малинин, В.Г.Морозов // Клиническая фармакология тимогена. — М., 2004.- гл. 1. - С. 7-18.
4. Попов Д.В. Безбородов Н.В. Повышение качества эмбриопродуктивности у коров-доноров./Вестник Орел ГАУ 4/11.
5. Попов Д.В. Безбородов Н.В.-Способ вызывания суперовуляции у коров-доноров/ Вестник Алтайского государственного аграрного университета № 9 (71), 2010.
6. Пташинская М. Краткое руководство по репродукции животных Intervet International BV. С- 176. 2009 год.- С.146.
7. Терновых С.В.- Физиологические основы повышения эффективности гормональной индукции полиовуляции у коров-доноров эмбрионов // Автореферат дис. канд.вет.наук/Терновых С.В. Воронеж-2001 год.
8. Betteridge KJ. Farm animal embryo technologies: Achievements and perspectives. Theriogenology 2006; 65: 905-913.
9. Chebel RC., Demetrio DGB., Metzger J. Factors affecting success of embryo collection and transfer in large dairy herds. Theriogenology 2008;69:98-106.
10. Ginther OJ., Beg MA., Donadeu FX., Bergfelt DR. Mechanism of follicle deviation in monovular farm species. Anim Reprod Sci 2003; 78:23 9-25 7.
11. Scherzer J., Fayrer-Hosken RA., Ray L., Hurley DJ., Heusner GL. Advancement in large animal embryo transfer and related biotechnologies.Reprod Domest Anim 2008;43:371-6.

Резюме. Сегодня использование технологий индуцирования суперовуляции и трансплантации эмбрионов в животноводческих хозяйствах довольно популярно. Для инициирования суперовуляции у крупного рогатого скота используются три различных типа гонадотропинов: ГнРГ из вытяжки гипофиза свиней или других домашних животных (ФСГ); лошадиный хорионический гонадотропин (eCG)/rcXK; человеческий менопаузальный гонадотропин (МГЧ). На сегодняшний день в промышленной пересадке эмбрионов для получения суперовуляции преимущество ФСГ перед ГСЖК является общепризнанным фактом. Однако все современные программы, созданные для регулирования фолликулярной волны и овуляции, все же не способны полностью устранить вариативность реакции на суперовуляцию. В работе показаны результаты исследования по применению иммуномодулятора тималин для подготовки коров-доноров к индукции суперовуляции гипофизарными гонадотропинами. Опытные группы животных формировали по принципу пар-аналогов, исходя из физиологического состояния, возраста, продуктивности, живой массы и стадии полового цикла. Для исследований подбирали здоровых животных, в возрасте 4-5 лет, которые после отела в течение сервис-периода (3 месяца) проявляли полноценную половую цикличность (наличие всех феноменов полового цикла). Авторами отмечено, что с увеличением продолжительности половой охоты увеличивается количество вымытых эмбрионов, что говорит об увеличении количества овуляций. По полученным результатам сделаны выводы и рекомендательные заключения для режимов введения препаратов для индукции суперовуляции, направленные на увеличение положительных ответов на введение индукторов и получение оптимального количества эмбрионов, пригодных к трансплантации.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, коровы-доноры, трансплантация, эмбрионы, суперовуляция, синхронизация половой охоты, половая цикличность, гонадотропин, фолликул, оплодотворяемость яйцеклеток.

Сведения об авторах:

Попов Дмитрий Владимирович, научный сотрудник ФГБНУ "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий"; 125480, г. Москва, ул. Костякова 12, стр. 4; e-mail: info-ceerb@mail.ru.

Бригида Артём Владимирович, научный сотрудник ФГБНУ "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий"; 125480, г. Москва, ул. Костякова 12, стр. 4; e-mail: info-ceerb@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Косовский Глеб Юрьевич, доктор биологических наук, директор ФГБНУ "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий"; 125480, г. Москва, ул. Костякова 12, стр. 4; тел.: 8-495-610-21-31; e-mail: info-ceerb@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей