Детекция провирусной ДНК BLVВ иксодовых клещах

УДК 619:616:98:578

Генджиева О.Б., Руденко А.В., Басангова Р.В., Убушиева А.В., Генджиев А.Я., Моисейкина Л.Г.
ФГБОУ ВПО "Калмыцкий государственный университет", г. Элиста

Несмотря на многочисленные исследования, посвященные этиологии, эпизоотологии, методам профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота, интерес специалистов к разным аспектам данной проблемы продолжает оставаться очень высоким. Одним из наиболее дискуссионных вопросов, обсуждаемых в научной литературе, является вопрос об этиологической связи вируса лейкоза крупного рогатого скота с определенными факторами риска развития заболевания [1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 13, 14]. На территории России обитает множество видов клещей. Ареал каждого вида определяется температурой среды, влажностью микроклимата, составом растительности и наличием видов животных, на которых они паразитируют во все фазы развития. Условия среды меняются под воздействием хозяйственной деятельности человека, поэтому ареалы распространения иксодовых клещей меняются. Иксодовые клещи являются переносчиками патогенных бактерий, вирусов и возбудителей кровепаразитарных болезней. Являясь основными компонентами природных очагов инфекции, иксодовые клещи наряду с функцией переносчика выполняют роль резервента заразного начала в природе [5, 15, 16, 19].

Молекулярные методы выявления возбудителей инфекций в клещах хорошо себя зарекомендовали как методы, обладающие высокой специфичностью и чувствительностью, а также относительно небольшим временем получения результата [11]. Развитие молекулярных методов расширило знания о биологии возбудителя инфекционных заболеваний, об их эволюции и нашло свое отражение в развитии новых методов диагностики и совершенствовании эпизоотического мониторинга [17, 20]. В последние годы расширился спектр диагностических наборов для детекции бактериальных и вирусных патогенов, передаваемых клещами. Проблема заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами, представляется чрезвычайно актуальной для многих регионов Российской Федерации.

Нами была поставлена цель выявить роль иксодовых клещей как переносчиков возбудителей лейкозной инфекции и фактора распространения ими инфекции.

Материалы и методы. На базе молекулярно-генетической лаборатории Центра коллективного пользования ФГБОУ ВПО "КалмГУ" была апробирована методика детекции провирусной ДНК лейкоза крупного рогатого скота. Изучение видового состава и сезонной динамики численности иксодовых клещей на животных в юго-восточных и центральных районах Калмыкии проводилось нами путем регулярных сборов клещей с животных в период их массового паразитирования. Всего было обследовано на заклещеванность 7 512 голов крупного рогатого скота, собрано и определено 12 786 клещей. Сезонная динамика численности клещей определялась регулярными полными сборами клещей с 10-15 животных в течение года. Выделение ДНК проводили с использованием набора "Ампли Прайм ДНК-сорб-В", для выделения ДНК из тканей. Для амплификации участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота использовали тест-систему ПЦР-комплект реагентов вариант FRT-50 F (изготовитель ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора). ПЦР-амплификацию и детекцию продуктов амплификации проводили с использованием приборов "Real-time", "Rotor-Gene" 6000 ("CorbettResearch", Австралия). При анализе результатов амплификации специфического участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота использовали программу JOE/YellowRotor-Gene 6000 версии 1.7 (build 67).

Результаты исследований. В Республике Калмыкия отмечается увеличение площади естественных пастбищ для животных, и поэтому в значительной степени места обитания иксодид расширены. Видовой состав обследованных клещей составлял: Hyalomma marginatum (61%), Hyalomma anatol^um (24%), Hyalomma scupense (11 %). Dermacenter marginatus (3%), Rhipicehalus pumilio (0,8%). Видовой состав иксодид на территории Калмыкии не отличается большим разнообразием. Клещи Н. marginatum, Н. scupense, D. marginatus встречаются повсеместно; а клещи Н. anatolicum обнаружены в пунктах, прибрежной зоны Каспийского моря, расположенных до 100 км. от морского побережья. Сезонная динамика паразитирования клещей на животных приведена в таблице 1.

Таблица 1. Сезонная динамика численности клещей (сбор с 10 животных)

Вид клещей	Месяцы
	IV	V	VI	VII	VIII	IX	X	XI	XII	I	II	in
Н. marginatum	174	195	84	10	8	5	5	2	-	-	-	3
Н. anatolicum	4	186	123	49	9	11	3	3	-	-	-	-
Н.scupense	85	2	-	-	-	-	-	2	38	82	127	97
D. marginatus	7	12	-	-	-	3	3	3	-	-	-	-
Rh. pumilio	-	-	2	14	2

Самым многочисленным и наиболее распространенным видом на территории Калмыкии, расположенной к востоку от Элисты, являются клещи Hyalomma marginatum. Они регистрируются повсеместно. Сезон паразитирования Н. marginatum начинается со второй - третьей декады марта и продолжается до ноября с максимумом в третьей декаде апреля - первой декаде июня. По средним многолетним данным первые клещи этого вида в Лаганском и Черноземельском районах обнаруживались на крупном рогатом скоте во второй декаде марта, а к концу месяца их численность в среднем на одно животное составила 1,3 экземпляра. С повышением температуры воздуха количество клещей постепенно нарастало и во второй декаде апреля составило 14,3 экземпляра на животное. В мае - начале июня кривая паразитирования достигала вершины - 17,5 экземпляров, а, начиная со второй декады июня, отмечается резкое снижение количества паразитирующих клещей до 1 - 0,5 экземпляра на голову в июле - августе. В сентябре - октябре численность продолжает убывать. В ноябре на скоте удавалось обнаружить только самцов.

Районы черноземья характеризуются значительно меньшим количеством клещей в связи с обеднённостью их животного и растительного мира. По мере продвижения на запад из зоны полупустыни в степную зону (Яшкульский, Целинный районы) плотность популяции

Н. plumbeum на крупном рогатом скоте увеличивалась. Значительное увеличение клещей на животных отмечено повсеместно в последние 3-4 года. Вероятно, этот всплеск активности связан со значительным изменением климатических условий (общее потепление, увеличение количества осадков, увеличение нагрузки на пастбища и другие факторы) [15].

Вторым видом, имеющим широкое распространение на территории Калмыкии, являются клещи Hyalomma scupense. Сезон паразитирования их начинается в октябре, ноябре одного года и завершается в мае следующего.

Первые нимфы Н. scupense обнаружены нами на крупном рогатом скоте в октябре, а первые имаго в конце ноября - начале декабря. Максимальное количество нимф отмечено в декабре-январе. Во второй половине февраля в основном встречаются половозрелые клещи. В этот же период появляются первые напитавшиеся самки. Массовое насыщение кровью и отпадение сытых самок происходит во второй половине марта - первой декаде апреля. В середине апреля заклещёванность скота этим видом резко снижается. В мае клещи обнаруживались крайне редко. Замечено, что плотность популяций Н. scupense возрастает по мере продвижения с востока на запад вглубь республики. Если на Каспийском побережье заклещёванность крупного рогатого скота равнялась 70-80%, то в Целинном районе клещей обнаруживали на 90-100% обследованных животных.

Лейкоз крупного рогатого скота распространен во всех субъектах Российской Федерации и, по официальным данным, насчитывается более 3 тысяч неблагополучных пунктов. Уровень инфицирован-ности составляет от 12 до 15 % (в отдельных регионах значительно выше), а уровень заболеваемости 3-4 %. Продолжительность неблагополучия сохраняется уже в течение более 20 лет. Не менее сложной является эпизоотическая ситуация в племенных хозяйствах. С 1997 года в структуре инфекционной патологии лейкоз крупного рогатого скота занимает первое место [8, 21].

На территории Республики Калмыкия наибольшее распространение лейкоз крупного рогатого скота имеет в Городовиковском, Лаганском и Целинном районах - 28,2 %, 6,9 % и 1,4 %, соответственно [7].

Учеными определены причины длительного неблагополучия по лейкозу крупного рогатого скота в скотоводстве и выявлены причины их обуславливающие. К их числу относят: использование репродуктивного потенциала животных, инфицированных вирусом лейкоза, а в некоторых случаях и коров с клинико-гематологической формой проявления болезни; пренатальное и раннее постнатальное инфицирование потомства коров с различным уровнем копрометации по лейкозу и другим инфекциям с генитальной формой проявления; хозяйственное использование потомства инфицированных и больных лейкозом животных; иммунологическая толерантность (ареактивность), которая формируется в организме в фетальный период при трансплацентарном переходе вируса, или на ранних этапах постнатального онтогенеза [8, 9, 10, 12, 18]. Однако выявление циркуляции вируса в природных очагах проводится впервые. Для обнаружения провирусной ДНК лейкоза крупного рогатого скота (BLV-провирус) нами были проведены исследования клещей, как естественных резервуаров инфекционных возбудителей с применением ПЦР с гибридизационно-флюоресцент-ной детекцией. Исследованию подвергались клещи вида Hyalomma marginatum (январь, февраль) и Hyalomma scupense (апрель, май). Определена частота встречаемости провируса в клещах и количество коров, реагирующих в ПЦР на вирус лейкоза крупного рогатого скота (табл. 2).

Таблица 2. Частота встречаемости провирусной ДНК (FRT BLV-провирус) в клещах

№	Наимено­вание хозяйства	Количество исследованных голов/клещей	Частота встречаемости провируса BLV		Количество реагирующих коров в ПЦР на ВЛКРС
			Hyalomma marginatum	Hyalomma scupense
1	п. Дружба Городовиковский район	20 (124)	0,60	0,30	7
2	п.Торячи Малодербетовского района	22 (168)	0,10	0	1
3	с.Приютное Приютненский район	20 (120)	0,20	0	1
4	КФХ Баина Лаганский район	20 (100)	0,10	0	0
5	КФХ АлтнГасн Лаганского района	20 (100)	0,10	0	1
6	и/сектор г.Лагань Лаганского района	20 (100)	0	0	0
7	с. Северное Лаганского района	20 (100)	0	0	0
8	п. Гашун Бургуста Кетченеровский район	20 (80)	0	0	0
9	п. Ачинеры Черноземельский район	25 (140)	0	0	0

Анализ данных таблиц показывает, что среди видового состава клещей снятых с крупного рогатого скота разных районов республики провирусные ДНК (BLV-провирус) присутствуют у Hyalomma marginatum, Hyalomma scupense, что доказывает присутствие возбудителя инфекции в одном из природных резервуаров - в иксодо-вых клещах. При этом частота встречаемости BLV-провируса в клещах, снятых со скота, в разных районах отличается. Так, наибольшая частота встречаемости BLV-провируса (0,60) отмечается в клещах Hyalomma marginatum, собранных с животных Городовиковского района в феврале. С частотой 0,20 встречается провирус в клещах этого же вида в п. Торячи Малодербетовского района и с. Приютное Приютненского района. В трех населенных пунктах: КФХ "Баина" Ла-ганского района, КФХ "АлтнГасн" Лаганского района и в п. Торячи Малодербетовского района частота встречаемости составляет 0,10. Ни одного случая обнаружения провируса BLV в клещах не зарегистрировано в четырех населенных пунктах - хозяйства населения г. Лагань Лаганского района, с. Северное Лаганского района, п. Гашун Бургуста Кетченеровский район, п. Ачинеры Черноземельского района. В клещах вида Hyalomma scupense, снятых с коров п. Дружба Городови-ковский район, п. Торячи Малодербетовского района, также найден BLV-провирус. Таким образом, впервые методом ПЦР с гибридиза-ционно-флюоресцентной детекцией выявлен BLV-провирус в клещах Hyalomma marginatum и Hyalomma scupense.

Проведены исследования методом ПЦР на лейкоз крупного рогатого скота 187 проб крови животных, с которых сняли клещей. Среди 20 исследованных животных Городовиковского района методом ПЦР обнаружено положительно реагирующих 7 голов. При исследовании 22 голов коров п.Торячи Малодербетовского района, 20 голов с.Приютное Приютненский район, 20 голов КФХ Алтн Гасн Лаганского района, молекулярный (ПЦР) анализ выявил по одному положительному случаю BLV-провируса. Следует отметить сопоставимость данных частоты встречаемости провирусной ДНК в клещах и носителей инфекции животных в населенных пунктах районов республики. Так, в Городовиковском районе инфицированность среди исследованных коров наибольшая и составляет 30-35% [6].

ПЦР-анализ крови коров из этих же хозяйств на наличие вируса лейкоза крупного рогатого скота показал, что имеется связь между частотой встречаемости провируса и количеством коров, положительно реагирующих на вирус. Самая большая частота встречаемости провируса в клещах обнаружена в п. Дружба Городовиковского района, где наблюдается наибольшая инфицированность крупного рогатого скота вирусом лейкоза в Республике Калмыкия.

Заключение. Таким образом, нами установлен трансмиссивный путь передачи вируса лейкоза крупного рогатого скота, осуществляемый переносом провируса BLV клещей. Поэтому необходимо уделять больше внимания защите крупного рогатого скота от кровососущих паразитов в помещениях и на пастбище.

Список литературы:

1. Амироков М. А. Комплексная оценка факторов, влияющих на особенности проявления и распространения лейкоза крупного рогатого скота, и совершенствование системы, обеспечивающей эпизоотическое благополучие. / М. А. Амироков//Автореф. дис. ... д-ра ветерин. наук. Барнаул, 2011. 39 с.
2. Апалькин В.А. Эколого-эпизоотологическое обоснование разработки и реализации новой схемы ветеринарно-профилактических мероприятий в Алтайском крае./ В.А. Апалькин //Автореф. дис... д-ра ветерин. наук. Новосибирск, 1998. 45 с.
3. Бусол В.А Лейкозогенность крови, молока и выделений больных лейкозом и серопозитивных животных. / В.А. Бусол, Е.А. Андриян, В.И. Цымбал, В.А. Хохлов, Н.Г.Ененко // Эпизоот., диагн. и меры борьбы при лейкозе крупного рогатого скота. Персиановка. 1990. С. 12-16.
4. Валихов А.Ф. Лейкоз крупного рогатого скота (вирусологические аспекты) / А.Ф. Валихов, В.П. Шишков, Л.Г БурбаМ.: 1977. 23 с.
5. Ганиев И.М. Эколого-фаунистические исследования иксодовых клещей и эпи-зоотология гемоспоридиозов сельскохозяйственных животных Западного Прикаспия. АН СССР. / И.М. Ганиев //1-е акарологическое совещание. Тезисы докл. M.-JL: Наука, 1966 г.С. 61-62.
6. Генджиева О.Б. Эпизоотология лейкоза в мясном скотоводстве/ О.Б. Генджиева, М.И. Гулюкин // Ветеринария. 2012. № 7. С. 23-26.
7. Генджиева О.Б. Эффективность оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота на территории Республики Калмыкия / О.Б. Генджиева // Ветеринария и кормление. 2010. №3. С. 22-23
8. Гулюкин М.И. Особенности инфекционного процесса, индуцированного вирусом лейкоза крупного рогатого скота. /М.И. Гулюкин, А.Ф. Валихов, В.М. Нахмансон, Л.А. Иванова К.П. Грек, С.В. Лопунов // Сб. науч. статей по матер. междунар. науч-практ. конф. к 110-летию ВИЭВ. М.: 2008.С.106-113.
9. Джупина С.И. Эпизоотический процесс лейкоза крупного рогатого скота и перспективы девастации возбудителя инфекции / С.И. Джупина// Ветеринарная патология. 2014. №1. С. 98-103
10. Дмитриев А.Ф. Рекомендации по недопущению распространения вируса лейкоза неблагополучными хозяйствами на основе применения совершенствованных противолейкозных мероприятий / А.Ф.Дмитриев, В.А. Беляев, А.Н. Трегубов.Ставрополь. 2014. 48 с.
11. Карань Л.С. Применение ПЦР в режиме реального времени для диагностики различных клещевых инфекций / Л.С. Карань, Н.М. Колясникова, М.Г Топоркова, М.А. Махнева, М.В. Надеждина //Микробиология. 2010. №3. С. 72-77
12. Логинов С.И. Эпизоотологические показатели для оценки проявления эпизоотического процесса лейкоза крупного рогатого скота./ С.И. Логинов, В.В. Храмцов, А.В. Высочин, В.В. Табакаев// Вестник НГАУ. 2011. № 1 (17).С. 96-100.
13. Магер С.Н. Меры профилактики и борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в личных подсобных хозяйствах граждан./ С.Н.Магер, П.Н. Смирнов, В.В. Храмцов, Н.А. Осипова, Т.А. Агаркова// Вестник НГАУ. 2011. № 1 (17).С. 100-104.
14. Руденко А.В. Профилактика протозойных заболеваний в промышленных комп-лексах./ А.В.Руденко // Межвузовский сб. научных статей. Элиста, 1985. С. 86-92
15. Руденко А.В. Иксодовые клещи - паразиты животных Калмыкии / А.В. Руденко, Н.Э. Горяев // Матер.пятой междунар. заочнойнаучн. конф. "Проблемы сохранения и рационального использования биоразнообразия Прикаспия и сопредельных регионов", Элиста, 2006. С. 79-82
16. Сивков Г.С. Изучение роли иксодовых клещей в передаче вируса лейкоза крупного рогатого скота/ ГС. Сивков, Ю.В. Глазунов, Д.А. Подшивалов, А.Г Степанов, И.М. Донник, А.Т Татарчук // Ветеринария,2009. № 12. С.14-17.
17. Eaves F.W. Afield evaluation of the polymerase chain reaction procedure for the detection of bovine leukemia virus pro viral DNA in cattle./ F.W.Eaves^. Molloy,C.K. Dimmock,L.E. Eaves //Vet. Microbiol.1994.39. P. 313 — 321.
18. Gillet N. Mechanisms of leukemogenesis induced by bovine leukemia virus: prospects for novel anti-retroviral therapies in human. / N. Gillet, A. Florins, Boxus M. ,C. Burteau, A. Nigro, F. Vandermeers, H. Balon,A.-B. Bouzar, J. Defoiche, A. Burny, M. Reichert, R. Kettmann, L.Willems // J. Retrovirol.2007.N4.P18-50.
19. Kurdi A. Serologic and virologic investigations on the presence of BLVinfections in a dairy herd in Syria./ A. Kurdi, P. Blankenstein. // Berl Munch. TierarztlWochenschr, 1999. Jan.,l12(1).P 18-23.
20. Lewin H. Evidence for BoLA-linked resistance and susceptibility to subclinical progression of bovine leukaemia virus infection/ H. Lewin, D. Bernoco //Animal Genetics. 1986. V. 17. P 197-207.
21. Mammericx M. Rapid Detection of Bovine Leukemia Virus Infection in a large Cattle population with an ELISA performed on Pooled Sera GroupedBy Herd. J./ M. Mammericx, D. Portetelle,I. Nys, A.Bumi //Vet.Med.-1985.-V.32.P.601-608.

Резюме. Регулярными полными сборами клещей с животных в течение года определена сезонная динамика численности клещей на определенной территории. Установлен видовой состав и сезонная динамика численности иксодовых клещей на крупном рогатом скоте. Проведен молекулярно-генетический анализ клещей на обнаружение провирусной ДНК вируса лейкоза крупного рогатого скота. Использована автоматизированная система диагностики выявления провирусной ДНК лейкоза крупного рогатого скота в клещах и крови животных с применением прибора "Rotor-Gene" 6000 Real-time. Для выявления ДНК провирусалейкоза применен метод полимеразной цепной реакции с гибридиза-ционно-флюоресцентнойдетекцией. Выделена провирусная ДНК Bovine leukosis virus (BLV) в иксодовых клещах на территории Республики Калмыкия методом ПЦР реального времени. Также проведен анализ крови исследованных животных методом ПЦР реального времени с целью выявления носителей возбудителя ВЛ КРС. В иксодовых клещах Hyalomma marginatum и Hyalomma scupense обнаружен специфический участок ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота. Серологическим и молекулярным методом подтверждена инфицированность коров лейкозом крупного рогатого скота. Выявлено, что провирусные ДНК встречаются у клещей вида Hyalomma marginatum, Hyalomma scupense в хозяйствах, где имеются коровы, реагирующие на вирус лейкоза при ПЦР-анализе. Определена частота встречаемости провируса в клещах и количество коров, реагирующих в ПЦР ПЦР-анализ крови коров на наличие вируса лейкоза крупного рогатого скота показал, что имеется связь между частотой встречаемости провируса и количеством коров,положительно реагирующих на вирус.

Ключевые слова: клещи, Hyalomma marginatum, Hyalomma scupense, молекулярный анализ, ПЦР, детекция, провирусная ДНК, трансмиссивный путь, вирус лейкоза крупного рогатого скота, заражение, эпизоотология.

Сведения об авторах:

Руденко Анатолий Васильевич, доцент кафедры зоотехнии и ветеринарии ФГБОУ ВПО "Калмыцкий государственный университет"; 358000, Республика Калмыкия, г. Элиста, ул. Пушкина, 11; тел.: 8(84722)41005; e-mail:uni@kalmsu.ru.

Басангова Рада Владимировна, аспирант кафедры зоотехнии и ветеринарии ФГБОУ ВПО "Калмыцкий государственный университет"; 358000, Республика Калмыкия, г. Элиста, ул. Пушкина, 11; тел.: 8(962)773-98-28; e-mail: basangova.r@yandex.ru.

Убушиева Алтана Вадимовна, аспирант кафедры зоотехнии и ветеринарии ФГБОУ ВПО "Калмыцкий государственный университет"; 358000, Республика Калмыкия, г. Элиста, ул. Пушкина, 11; тел.: 8(927)598-05-67; e-mail: ameli-altanas@mail.ru.

Генджиев Александр Ялмтаевич, аспирант кафедры зоотехнии и ветеринарии ФГБОУ ВПО "Калмыцкий государственный университет"; 358000, Республика Калмыкия, г. Элиста, ул. Пушкина, 11; тел.: 8(84722)41005; e-mail: uni@kalmsu.ru.

Моисейкина Людмила Гучаевна, профессор кафедры зоотехнии и ветеринарии ФГБОУ ВПО "Калмыцкий государственный университет"; 358000, Республика Калмыкия, г. Элиста, ул. Пушкина, 11; тел.: 8(84722)41005; e-mail: uni@kalmsu.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Генджиева Ольга Бекяев-на, доцент кафедры зоотехнии и ветеринарии ФГБОУ ВПО "Калмыцкий государственный университет"; 358000, Республика Калмыкия, г. Элиста, ул. Пушкина, 11; 8(927)645-87-74;e-mail: geng_olga@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей