 |
  |
|||
 |
 |
|||
|---|---|---|---|---|
|
Сравнительный анализ кодирующих последовательностей пятого и седьмого сегмента генома вируса гриппа а подтипов H5N1, H7N9, H9N2УДК 578.832.1 Тарлавин Н. В., Веретенников В. В., Джавадов Э. Д., Красков Д. А. Федеральное государственное Вирус гриппа А относится к семейству Orthomyxoviridae [6]. Это оболочечный вирус с геномом, состоящим из одноцепочечной сегментированной РНК. Вирусы гриппа А имеют восемь сегментов, которые кодируют 8 структурных вирусных белков и 9 неструктурных (табл. 1): гемагглютинин (HA), нейраминидаза (NA), матрикс 1 (M1), матрикс 2 (M2), нуклеопротеин (NP), неструктурный белок 1 (NSP1), неструктурный белок 2 (NS2; также известен как белок ядерного экспорта, NEP), кислый белок полимеразы (PA), основной белок полимеразы 1 (PB1), основной белок полимеразы 2 (PB2) и основной белок полимеразы 1 - F2 (PB1-F2) [1, 2, 3]. Таблица 1 Сегменты РНК вируса гриппа А и кодируемые белки
Не каждый штамм экспрессирует все выявленные в последние гоы неструктурные вирусные белки. Отсутствие этих белков не влияет на жизнеспособность вируса, но может пагубно сказываться на его репликации [5]. Функции недавно обнаруженных неструктур ных белков пока недостаточно исследованы. У вируса гриппа типа A также известно шестнадцать вариантов структуры гемагглютинина (HA1-16) идевять нейраминидазы (NA1-9). Именно комбинации этихвух гликопротеинов и определяют подтип вируса [1]. На территории Российской Федерации наиболее распространёнными штаммами вируса гриппа А являются H5N2, H5N1, H5N8, H7N9 и низкопатогенный H9N2. В первом квартале 2023 года зарегистрировано 7 очагов высокопатогенного гриппа птиц (далее, ВГП) типа А, подтип H5N1, из них 3 очага средидомашней птицы (ЛПХ) - в Белгородской, Калининградской областях и Камчатском крае, 1 очаг средиде-коративной птицы на территории Ставропольского края, среди иких птиц - 3 очагов Астраханской области, Республике Дагестан и Херсонской области. Также в последние годы на территории Российской Фе-ерации стали чаще выявлять H9N2. В 2019 году вирус был выявлен в одном из птицеводческих комплексов Челябинской области и личном подсобном хозяйстве Забайкальского края. В 2020 году H9N2 выявлен у кур на птицефабриках в Челябинской, Волгоградской, Пензенской областях. Во всех указанных случаях вирус выявлен у кур. Из представленныхданных следует, что H9N2 за 2019-2020 года выявляли в четырёх федеральных округах Российской Федерации: Сибирском, Уральском, Приволжском и Южном [1]. Сообщения многих авторов [4, 7, 8] указывают на антигенную неоднородность штаммов вируса гриппа А подтипов H5N1, H7N9, H9N2 по геммаглютинину, выделенных в России идругих странах, с чем связывают неудачи применения существующих вакцин при профилактике заболевания. Целью исследования стало выяснение, насколько различаются межу собой в генетическом отношении 5-й и 7-й сегменты генома вируса гриппа А подтипов H5N1, H7N9 и H9N2. Материалы и методы исследования. Сравнивали различные послеовательности изолятов вируса генома вируса гриппа А подтипов H5N1, H7N9 и H9N2. Для большего охвата сравнения подбирались изоляты вируса, выделенные из различных источников, различных стран и в разное время. Для исследования были использованы последовательности из базы GenBank: OQ632899.1, OQ632901.1, OP476930.1, OP476932.1, OL370156.1, OQ982390.1, OQ982391.1, OQ794036.1, OQ794039.1, 0R136610.1, MN865901.1, OQ632899.1, 0Q632901.1, MW265386.1, 0Q683501.1, MW100665.1, OL638146.1, MG366847.1, OP115747.1, OR136565.1, 0Q794036.1, 0Q794039.1, 0Q982390.1, 0Q982391.1, MW493192.1, MW493194.1, OR125169.1, OR125142.1, MW102945.1, OR125220.1, MW108569.1, MW108571.1, OP597618.1, OP597621.1, KP455979.1 и прочие. Выравнивание последовательностей было выполнено с помощью программы ClustalW, программы множественного выравнивания последовательностей. BLAST-анализ был выполнен с использованием программы MEGA 11. Результаты исследований и их обсуждение. Если рассматривать между собой сходства и различия в генетической структуре белков M1 и M2 вируса гриппа А, то можно сделать вывод, что данные белки относительно схожи друг с другом. Так, нуклеотидная последовательность, кодирующая синтез данных белков у вируса гриппа подтипа H5N1, зарегистрированного в 2021 году во Франции (A/chicken/France/21328/2021(H5N1)) и у вируса гриппа подтипа H9N2, зарегистрированного в 2020 году в Индии (A/chicken/India/20690/2020(H9N2)), сходится на 89,61%. Оба вируса были получены от домашней курицы, длина обеих нуклеотидных последовательностей составила 982 нуклеотида, а при сравнении состава последовательностей было обнаружено 102 нуклеотидные замены. Также было обнаружено, что данная последовательность у вышеупомянутого вируса подтипа H5N1 отличается от аналогичного сегмента вируса гриппа подтипа H9N2, обнаруженного в Австралии, штат Квинсленд, у диких уток (A/wild duck/Queensland/P16-10057-1/2016(H9N2)), всего на 4,38%. При сравнении между собой последовательностей, кодирующих те же белки, у вируса гриппа подтипа H5N1 (A/mallard duck/ Minnesota/UGAI22-3846/2022(H5N1)), зарегистрированного в 2022 году в США, и у вируса гриппа подтипа H9N2 (A/mallard duck/ Egypt/MB-D-2217C/2019(H9N2)), зарегистрированного в 2019 году в Египте (оба вируса обнаружены у диких уток, а последовательности белков составили 1027 нуклеотидов), было обнаружено сходство в 88,70%. Количество нуклеотидных замен составило уже 116 замен. Для сравнения также были взяты последовательности, кодирующие данный белок у вирусов, выделенных от гусей в США в 2022 году (A/goose/OH/OH22-21298/2022(H5N1)) и в Китае (A/goose/China/146G30/2013(H9N2)). Сходство составило 89,09% при длине последовательности также в 1027 нуклеотидов. В целом, вне зависимости от вида вируссодержащего материала, различия в генетической структуре вирусов не превышают 15%, о чем говорят результаты поиска областей сходства. Для данного поиска было взято 15 различных вирусов гриппа подтипа H9N2 из самых разных биологических источников. Полная схема проведенных анализов представлена на рисунке 1. Таким образом можно сделать вывод, что 7 сегмент генома вируса гриппа А, кодирующий синтез белков M1 и M2, в генетическом отношении различается у вирусов подтипа H5N1 и H9N2 в среднем на 9,7% (рисунок 1).
Рис. 1. Сравнение последовательности 7 сегмента генома вирусов гриппа А подтипа H9N2, с аналогичным сегментом вируса гриппа А подтипа H5N1
При сравнении данного сегмента у вирусов гриппа подтипов H5N1 и H7N9 можно отметить такое существенное сходство этой генетической последовательности. Так, мы сравнили уже ранее использованный вирус (A/chicken/France/21328/2021(H5N1)), выделенный в 2021 году во Франции и вирус гриппа подтипа H7N9, выделенный от домашней курицы в Китае в 2015 году (A/chicken/Shandong/SDLC120/2015(H7N9)). Несмотря на временные и географические различия, сходство 7-го сегмента генома вируса гриппа у этих двух вирусов составило 88,90%, что очень близко к такому же результату при сравнении вирусов гриппа подтипов H5N7 и H7N9. Секвенированные последовательности также составили 982 нуклеотида. Сравнив между собой вирусы гриппа подтипа H5N1 и H7N9, полученные от диких уток, можно подтвердить данную тенденцию. Сходство 7-го сегмента генома вируса гриппа подтипа H5N1, полученного от дикой утки в Колумбии (A/wild duck/Colombia/ Choco/3501/2022(H5N1)) и вируса гриппа подтипа H7N9, полученного в Китае, провинция Хунань (A/duck/Hunan/5.24_YYGK82P2-OC/2017(H7N9)), составила 89,96%. Сравнив между собой 7-е сегменты генома вируса (A/goose/Czech Republic/18520-2/2021(H5N1)), выделенного в Чешской республике в 2021 году от дикого гуся и вируса (A/goose/Guangdong/ Q38/2017(H7N9)), выделенного в Китае, провинция Гуандун, от птицы того же вида, подтвердили сходство сегментов на 88,07% и длине отсеквенированных сегментов в 982 нуклеотида. Таким образом, стабильно сохраняющееся различие в 5-15%, выявленное при сравнении нуклеотидных последовательностей 7-го сегмента генома вируса гриппа А подтипов H5N1 и H9N2, сохраняется при введении в опыт вирус гриппа подтипа H7N9. В данном случае, можно говорить о сокращении встречающихся различий, поскольку при проведении поиска областей сходства, процент отличия нуклеотидных последовательностей составляет 11,3% (рисунок 2).
Рис. 2. Сравнение последовательности 7 сегмента генома вирусов гриппа А подтипа H7N9, с аналогичным сегментом вируса гриппа А подтипа H5N1 При анализе генетических различий в последовательности, кодирующей 5 сегмент генома вируса у различных подтипов вируса гриппа А (белок NP-нуклеопротеид), в данном случае подтипов H5N1 и H9N2, становится очевидно, что различия носят сходный характер с различиями в генетическом строении белков М1 и М2. Так, при сравнении двух последовательностей, кодирующих белок NP, у вируса (A/chicken/Egypt/ Menoufia/2021(H9N2)), выделенного в 2021 году у домашней курицы в Египте и у вируса (A/chicken/OH/OH22-20542-2/2022(H5N1)), выделенного в США также от домашней курицы в 2022 году в штате Огайо, выявлено совпадение в 86,98%. Длина анализируемых последовательностей в обоих случаях составила 1 565 нуклеотидов, а число замен - 204 нуклеотида. При анализе материала от дикой утки были проведены сравнения 5-х сегментов генома вируса (A/mallard duck/Egypt/MB-D-2217C/2019(H9N2)), выделенного в Египте в 2019 году и вируса (A/mallard duck/Minnesota/UGAI22-3846/2022(H5N1)), выделенного в США в 2022 году в штате Миннесота. Совпадение составило 86,33% при длине анализируемых последовательностей 1 565 нуклеотидов. Интересно, что при сравнении двух чрезвычайно удаленных друг от друга (как в генетическом, так и географическом смысле) вирусов, выявляется даже большее сходство, чем при двух вышеописанных сравнениях. Сравнили сегменты генома вируса (A/chicken/China/chicken/2014(H9N2)), выделенный в Китае в 2014 году у домашней птицы и вируса (A/Humboldt penguin/ Coquimbo/239590/2023(H5N1)), выделенного в 2023 году у пингвина Гумбольдта в городе Кокимбо, Чили. Сходство анализированных сегментов составило 87,07%. Таким образом, резюмируя проведенные исследования, можно заключить, что 5 сегменты генома подтипов H5N1 и H9N2 вируса гриппа А различаются в среднем на 12,4% (рисунок 3).
Рис. 3. Сравнение последовательности 5 сегмента генома вирусов гриппа А подтипа H9N2, с аналогичным сегментом вируса гриппа А подтипа H5N1 Также было проведено исследование различий 5 сегмента генома у вирусов гриппа А подтипа H5N1 и H7N9. Для исследования методом сравнения различий в генетических последовательностях были взяты 5-е сегменты вирусов (A/chicken/ Nuble/240684/2023(H5N1)), выделенного в области Ньюбле, Чили и (A/chicken/Fujian/3.16_FZHX0301-O/2017(H7N9)), обнаруженного в 2017 году в Китае, провинция Фуцзянь. Оба вируса были изолированы от кур, при сравненной длине сегментов в 1 552 нуклеотида, сходство между этими двумя сегментами составило 87,63%, а количество различий - 192 нуклеотида. При сравнении 5-х сегментов генома вируса (A/Domestic duck/Araucania/241914-2/2023(H5N1)), выделенного от домашней утки в Араукании, Чили и вируса (A/duck/Jiangxi/1.11_NCDZT41F2-OC/2017(H7N9)), полученного также от утки в 2017 году в провинции Цзянси, Китайская Народная Республика, выявилось сходство в 87,69%. Длина исследованных сегментов составила 1 552 нуклеотида, количество различий - 191 нуклеотид. Для исследования вирусов, выделенных от гусей, взяли сегменты, кодирующие NP-белок вируса (A/goose/Chelyabinsk/1341-3/2021(H5N1)), выделенного в 2021 году в Челябинске, Российская Федерация и вируса (A/goose/ Jiangsu/1027/2013(H7N9)), изолированного в 2013 году в провинции Цзянсу, Китайская Народная Республика. Сходство данных сегментов составило 90,38%. Длина исследованных последовательностей составила 1 508 последовательностей, а количество различий в последовательностях - 165 нуклеотидов. В среднем, можно сделать вывод, что 5 сегмент генома вируса гриппа А, отвечающий за синтез белка нуклеопротеина (NP-белка), у вируса гриппа А подтипа H5N1 отличается от данного сегмента вируса гриппа А подтипа H7N9 на 9,2% (рисунок 4).
Рис. 4. Сравнение последовательности 5 сегмента генома вирусов гриппа А подтипа H7N9, с аналогичным сегментом вируса гриппа А подтипа H5N1 Заключение. Из сравнения 7-го сегмента генома (кодирующего M-белок) и 5-го сегмента генома (кодирующего NP-белок) различных вирусов гриппа А (подтипов H9N2 и H7N9) с гомологичными сегментами генома вируса гриппа подтипа H5N1, были сделаны следующие выводы. 7-й сегмент генома вируса H5N1 отличается от своих гомологов у вирусов H9N2 и H7N9 на 9,7% и 11,3% соответственно. 5-й сегмент генома вируса H5N1 отличается от гомологичных сегментов вышеупомянутых вирусов на 12,4% и 9,2%, соответственно. Таким образом, обнаруженные различия внутри подтипов вируса у данных сегментов генома существенно ниже по сравнению с подтиповыми различиями гемагглютинина и нейраминидазы, что и обуславливает возможность использования антител к белкам, кодируемым данными сегментами генома, в качестве консервативных антител к вирусу гриппа птиц в целом. С другой стороны, использование тест-систем, в которых происходит детекция антител к М-белку и NP-белку, не подходит в качестве установления диагноза на высокопатогенный грипп птиц. Список литературы: 1. Актуальные вирусные инфекции в птицеводстве: анализ результатов молекулярной диагностики / Д. Б. Андрейчук, Л. О. Щербакова, Н. А. Гусева [и др.] // Труды Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я. Р. Коваленко. 2021. Т. 82. С. 51-57. 2. Джавадов, Э. Д. Грипп птиц / Э. Д. Джавадов, М. Е. Дмитриева // ГНУ Внивип Россельхозакадемии. 2011. 188 с. 3. Ларионова, Н. В. Возбудитель гриппа: изменчивость в природе и эксперименте : автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук / Ларионова Наталья Валентиновна // Санкт-Петербург, 2017. 22 с. 4. Genetic and biological properties of H7N9 avian influenza viruses detected after application of the H7N9 poultry vaccine in China / Yin X., Deng G., Zeng X. Et al. // PLoS Pathog. 2021. No. 17 (4): e1009561. 5. Identification of a Novel Viral Protein Expressed from the PB2 Segment of Influenza A Virus / Yamayoshi S., Watanabe M., Goto H., Kawaoka Y. // J. Virol. 2015. 90 (1): 444-456. 6. Jiang L., Chen H., Li C. Advances in deciphering the interactions between viral proteins of influenza A virus and host cellular proteins. Cell Insight. 2023. 31. No. 2 (2): 100079. 7. Strategies for enhancing immunity against avian influenza virus in chickens: a review / Alqazlan N., Astill J., Raj S., Sharif S. // Avian Pathol. 2022. No. 51 (3): 211-235. 8. Success factors for avian influenza vaccine use in poultry and potential impact at the wild bird-agricultural interface / Swayne D.E., Spackman E., Pantin-Jackwood M. // Ecohealth. 2014. No. 11 (1): 94-108. Резюме. Вирус гриппа А, вызывающий высоко- и низкопатогенный грипп у большинства видов сельскохозяйственных птиц, нас сегодняшний день является самой большой проблемой для отечественного птицеводства. Одна из причин опасности данной болезни кроется в способности возбудителя к различным формам реассортации и рекомбинации, которая в свою очередь возможно благодаря сегментированному геному, представляющему собой 8 отдельных сегментов. В данном исследовании мы поставили цель выяснить, насколько различны между собой в генетическом отношении 5-й и 7-й сегменты генома вируса гриппа А (традиционно считающиеся идентичными) подтипов H5N1, H7N9 и H9N2, для чего сравнили различные последовательности изолятов вируса вышеуказанных подтипов. Результаты исследования показали, что 7-й сегмент генома вируса H5N1 отличается от своих гомологов у вирусов H9N2 и H7N9 на 9,7% и 11,3%, соответственно. 5-й сегмент генома вируса H5N1 отличается от гомологичных сегментов вышеупомянутых вирусов на 12,4% и 9,2%, соответственно. Таким образом между данными сегментами у различных подтипов вируса присутствует явное генетическое различие. Ключевые слова: птицеводство, высокопатогенный грипп птиц, вирус гриппа А, геном, штамм, H5N1, H7N9, H9N2, очаг, вспышка. Сведения об авторах: Веретенников Владислав Валерьевич, кандидат ветеринарных наук, ассистент кафедры эпизоотологии им. В.П. Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины»; 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5; тел.: 8-981-8778769; e-mail: vlad.veretennikov.96@mail.ru. Джавадов Эдуард Джавадович, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры эпизоотологии им. В.П. Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины»; 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5; тел.: 8-921-9666774; e-mail: vnivip1@mail.ru. Красков Дмитрий Андреевич, аспирант кафедры эпизоотологии им. В. П. Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины»; 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5; тел.: 8-921-4152266; e-mail: kraskov-00@bk.ru. Березкин Владислав Александрович, кандидат ветеринарных наук, ветеринарный врач-эпизоотолог ГБУ «Санкт-Петербургская городская станция по борьбе с болезнями животных» г. Санкт-Петербург, Жерновская 2-я ул, 46, Санкт-Петербург, 195043. тел.: 8-911-2942098, e-mail: berezki.v@yandex.ru. Ответственный за переписку с редакцией: Тарлавин Николай Владимирович, кандидат ветеринарных наук, ассистент кафедры эпизоотологии им. В.П. Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины»; 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5; тел.: 8-981-8430353; e-mail: tarlav1995@bk.ru.
|
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2011 © Ветеринария Кубани | Разработка сайта - Интернет-Имидж | |
|---|---|---|