Динамика антимикробной резистентности энтерококков на молочно-товарной ферме

УДК 619:636.2:579:615.07
DOI 10.33861/2071-8020-2021-4-9-12

Кривоногова А.С., Исаева А.Г., Соколова О.В., Безбородова Н.А., Моисеева К.В. Федеральное государственное
бюджетное научное учреждение Уральский федеральный аграрный научноисследовательский центр
Уральского отделения Российской академии наук, г. Екатеринбург

Стремительный рост резистентности бактерий к антимикробным препаратам (далее, АМП) обусловлен влиянием различных факторов - генетических, экологических, ятрогенных, гигиенических. В настоящее время известно, что устойчивость к антибиотикам распространяется среди бактерий горизонтально, путем переноса генов антибиотикорезистентности (далее, ARG). Картирование трансфера генов, ассоциированных с устойчивостью к АМП, через геномы микроорганизмов показало, одним из ключевых условий формирования горизонтального переноса являются смежные и пересекающиеся экологические среды обитания микроорганизмов [5, 10]. Формирование обширной, связанной с человеком сети обмена генами резистентности, осуществляется в основном под влиянием экологии микроорганизмов, а не их географии или филогении. Обмен генами ARG происходит в основном между изолятами из экологически сходных сред и общих экологических ниш, при этом наиболее интенсивна передача между бактериями, населяющими одни и те же локусы макроорганизма и имеющими схожий метаболизм [10]. Поскольку микробиомы сельскохозяйственных животных экологически ассоциированы с микробиомами человека, населены бактериями, общими для человека и животных, то развитие резистентности к АМП в животноводстве закономерно вносит существенный вклад в эволюцию резистома - глобального резервуара генов резистентности, которые придают устойчивость к антибиотикам при экспрессии в восприимчивом хозяине [5, 7]. Механизм получения генов устойчивости от неродительских линий (горизонтальный перенос генов) эволюционно обеспечивает способности бактерий к высокой адаптации к меняющимся условиям среды за счет реализации генетической вариабиль-ности. Быстрый доступ к генетическим инновациям позволяет бактериальной клетке изменять метаболизм ксенобиотиков во временных пределах её существования, а также способствует дальнейшему распространению устойчивости в микробиоме [10]. Этот механизм, например, привел к появлению популяций ванкомицин-резистентных энтерококков и энтеробактерий, продуцирующих бета-лактамазы.

Несовершенство протоколов антибиотикотерапии, использование АМП в нетерапевтических и профилактических целях (для стимуляции роста и продуктивности животных) привели к значительной контаминации животноводческих микробиомов генами резистентности. При этом передача мобильных элементов ARG между сельскохозяйственными животными и человеком происходит под действием филогенетических и экологических факторов, что означает интенсивный внутривидовой и межвидовой обмен генами резистентности среди обитающих на фермах бактерий, общих для человека и животных [7, 8]. Широкое использование антибиотиков человеком и в сельском хозяйстве привело к элиминации менее успешных бактерий и к заполнению их ниш обитания новыми, более приспособленными видами. Так, происходит колонизация устойчивыми изолятами E. faecalis и E. faecium, новых, ранее недоступных для них сред макроорганизма животных и человека, при этом возникают штаммы энтерококков, у которых почти одинаково отсутствует защита CRISPR. Как следствие, эти штаммы интенсивно наполняются плазмидами и другими компонентами мобильного резистома, придающими устойчивость к ксенобиотикам и высокую вирулентность [7, 11].

Контаминация животноводческих микробиомов агентами резистентности требует неотложных мер, направленных на её предотвращение. В настоящее время отсутствует системный подход к решению проблемы антимикробной резистентности (далее, АМР) в животноводстве, и по-прежнему остро стоит вопрос с нетерапевтическим использованием антибиотиков в качестве кормовых добавок. Первостепенной задачей для борьбы с антимикробной резистентностью на молочно-товарных фермах является контроль миграции агентов АМР (генов и устойчивых микроорганизмов) внутри животноводческих микробиомов. Поскольку скрининг большого количества геномов бактерий, выделенных из различных точек на ферме, зачастую недоступен для предприятия из-за его высокой цены и нехватки лабораторных средств, целесообразно проводить анализ профилей фенотипической антимикробной устойчивости. Методика скрининга фенотипической АМР энтеробактерий и энтерококков на молочно-товарной ферме включает в себя отбор проб навоза и подстилки на разных хозяйственных и технологических участках с последующим определением чувствительности к антибиотикам диско-диффузионным способом, который является наиболее универсальным, а также технически и экономически доступным [8, 9].

Целью исследования являлось проведение анализа изменения чувствительности к антимикробным препаратам изолятов энтерококков, выделенных на молочно-товарной ферме в течение трёхлетнего периода. В рамках работ было изучено количественное распределение изолятов Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis по чувствительности к 5 препаратам - ванкомицину, меропенему, энрофлок-сацину, ампициллину, защищенному амоксициллину в 2018, 2019, 2020 гг., и проанализирована динамика изменения резистентности энтерококков на молочно-товарной ферме.

Материалы и методы исследований. Исследования выполнены в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования Российской Федерации по теме № 0532-2021-0004 «Разработка методологических подходов к мониторингу, контролю и сдерживанию антибиотикорезистентности оппортунистических микроорганизмов в животноводстве». Проводили исследование фенотипической антимикробной устойчивости Enterococcus spp. микробиома молочно-товарной фермы в трёхлетней динамике. Для бактериологических исследований отбирали пробы в 25-28 точках на разных технологических участках фермы: подстилку, навоз от животных, навоз из буртов. Отбор проводили в течение трёх лет (2018-2020), всего отобрано 80 проб. Микроорганизмы культивировали на питательных средах, идентифицировали, анализировали профили антибиотико-резистентности выделенных изолятов энтерококков диско-диффузионным методом, методом лунок, определяли МПК по стандартным микробиологическим методикам [1, 2, 3, 6]. После культивирования материала из каждой пробы выбирали по 2-3 изолята E. faecium и E. faecalis для дальнейших исследований фенотипической антибиоти-кочувствительности. Всего было проанализировано 296 изолятов, из них 152 E. faecium и 144 E. faecalis. При работе диско-диффузионным и луночным методами изоляты разделяли на группы (чувствительные, промежуточные и резистентные) в соответствии с пограничными значениями (breakpoint), установленными Европейским комитетом по определению чувствительности к антибиотикам (EUCAST) и Национальным стандартом [1, 2]. В основной цикл исследований фенотипической чувствительности изолятов к антимикробным препаратам входили: ампициллин, амоксициллин, амоксициллин + клавулановая кислота (амоксиклав), ванкомицин, меропенем, энрофлоксацин. Выбор препаратов был обусловлен отсутствием у энтерококков механизмов природной резистентности [3], а также историей применения АМП на обследованном предприятии. Полученные результаты анализировали с использованием статистических методов (Statistica 10).

Результаты исследований и их обсуждение. Было установлено, что среди всех выделенных за время исследований изолятов Enterococcus spp. подавляющее большинство составляли E. faecalis и E. faecium. В связи с тем, что изоляты E. durans и E. gallinarum были обнаружены в единичном количестве, и при этом не имели резистентности к анализируемым антимикробным препаратам, их при обработке данных не учитывали.

В 2018 году было исследовано 27 проб: из них ассоциация изоля-тов E.faecium + E. faecalis выделена в 15 пробах, только E. faecium - в 5, только E. faecalis в 7 пробах. Для анализа на фенотипическую антибиотикочувствительность взято 50 изолятов E. faecium и 50 изолятов E. faecalis.

В 2019 году из 25 проб ассоциации изолятов энтерококков выделили в 17, только E. faecium был обнаружен в 5 пробах, только E. faecalis - в 3; на анализ отобрано 46 изолятов E. faecium и 45 -E. faecalis.

В 2020 всего исследовано 28 проб, из них ассоциации изолятов обнаружили в 18 случаях, только E. faecium - в 7, только E. faecalis - в 3 пробах. На определение чувствительности к АМП было отобрано 56 изолятов E. faecium и 49 - E. faecalis.

За все три года наблюдений в соотношении изолятов энтерококков отмечали преобладание микробных ассоциаций E. faecium и E. faecalis, из меньшей части проб (32-45%) выделяли изоляты только одного вида (рисунок 1).

Рис. 1. Соотношение изолятов энтерококков в пробах подстилки и навоза, отобранных на молочно-товарной ферме в 2018-2020 гг.

При исследовании фенотипической чувствительности энтерококков к пяти антимикробным препаратам изоляты распределяли на три группы: чувствительные (susceptible, S) при стандартном режиме дозирования АМП; чувствительные при увеличенной экспозиции АМП (умеренно-чувствительные, Increased exposure, I) и резистентные (resistant, R) [2, 3, 4]. Установили, что и E. faecium и E. faecalis имели значительное количество резистентных и умеренно чувствительных изолятов во все годы наблюдения (табл. 1, 2).

Таблица 1 Динамика чувствительности изолятов Enterococcus faecium к антимикробным препаратам на МТФ в 2018-2020 гг.

Enterococcus faecium*	Чувствительные (S)			Чувствительность к АМП снижена (I)			Резистентные (R)
Год	2018	2019	2020	2018	2019	2020	2018	2019	2020
Ампициллин	29	34	30	8	7	18	13	5	8
Амоксициллин	32	37	38	10	7	12	8	2	6
Амоксициллин+ клавулановая к-та	31	36	37	18	5	14	1	5	5
Ванкомицин	24	35	40	23	9	12	3	2	4
Энрофлоксацин	28	31	36	17	12	17	5	3	3
Меропенем	23	35	41	25	8	12	2	3	3

* Количество выделенных изолятов (n)=152

Таблица 2 Динамика чувствительности изолятов Enterococcus faecalis к антимикробным препаратам на МТФ в 2018-2020 гг.

Enterococcus faecalis*	Чувствительные (S)			Чувствительность к АМП снижена (I)			Резистентные (R)
Год	2018	2019	2020	2018	2019	2020	2018	2019	2020
Ампициллин	26	28	30	14	13	14	10	4	5
Амоксициллин	23	25	33	26	14	10	1	6	6
Амоксициллин+ клавулановая к-та	33	30	24	11	12	18	6	3	7
Ванкомицин	20	20	23	25	22	20	5	3	6
Энрофлоксацин	25	31	42	25	12	5	0	2	2
Меропенем	29	29	39	20	15	7	1	1	3

* Количество выделенных изолятов (n)=144

Установлено, что за три года увеличилась доля изолятов E. faecium со сниженной чувствительностью к ампициллину и амоксициллину, но снизилось количество малочувствительных к защищенному амоксициллину и эрофлоксацину, и - что особенно важно - к ванкомицину (в 2 раза) и меропенему (2,3 раза). При этом, однако, несколько выросла доля энтерококков, резистентных к ванкомицину, что позволяет предположить переход части изолятов, ранее имевших сниженную чувствительность, в группу резистентных. Доля устойчивых к меро-пенему также увеличилась (табл. 3). Приобретенная устойчивость E. faecium в основном ассоциирована с геном VanB, локализующимся на хромосоме либо плазмиде, или геном VanD, локализованным на хромосоме. Фенотипически эти энтерококки характеризуются разными профилями чувствительности к ванкомицину и тейкопланину. При этом изоляты, имеющие VanB на плазмиде, отличаются значительной мобильностью ARG и вносят существенный вклад в распространение антимикробной резистентности в популяциях диких энтерококков в случае их контаминации [1, 4, 8].

Таблица 3 Распределение по фенотипической чувствительности изолятов E. faecium, выделенных на МТФ в 2018-2020 гг. (%)

Изоляты E. faecium	Чувствительные (S)			Чувствительные к повышенной дозе АМП (I)			Резистентные (R)
Год	2018	2019	2020	2018	2019	2020	2018	2019	2020
Ампициллин	58,0	73,8	53,7	16,0	15,2	32,1	26,0	11,0	14,2
Амоксициллин	64,0	80,4	67,8	20,0	15,2	21,5	16,0	4,4	10,7
Амоксициллин+ клавулановая к-та	62,0	78,3	66,0	36,0	10,8	25,1	2,0	10,9	8,9
Ванкомицин	48,0	76,0	71,5	46,0	19,5	21,4	6,0	4,5	7,1
Энрофлоксацин	56,0	67,4	64,3	34,0	26,0	30,4	10,0	6,6	5,3
Меропенем	46,0	76,0	73,3	50,0	17,4	21,4	4,0	6,6	5,3

К положительным тенденциям следует отнести снижение доли изо-лятов E. faecium, резистентных к ампициллину, амоксициллину и эн-рофлоксацину (рисунок 2). Это может быть связано с прекращением использования данных антибиотиков и заменой АМП в терапевтической и профилактической стратегиях ветеринарного сопровождения на МТФ.

Рис. 2. Доля резистентных к антибиотикам изолятов от всех выделенных E. faecium на МТФ в 2018-2020 гг.

Исследование фенотипической антибиотикочувствительности изо-лятов E. faecalis показало, что доля изолятов со сниженной чувствительностью к ампициллину за три года не изменилась и составляла в среднем 28,5%, а количество резистентных изолятов снизилось в 1,9 раза. При этом, однако, в 2020 г. каждый десятый изолят E. faecalis имел резистентность к ампициллину (табл. 4). По представлениям EUCAST ампициллин считается антибиотиком, активным в отношении фекальных энтерококков. В случае резистентности E. faecalis к данному антибиотику, изолят следует считать потенциально устойчивым к пенициллинам и карбапенемам, вследствие ассоциированной пониженной афинности к бета-лактамам [1, 4]. Доля обнаруженных нами в ходе исследований изолятов, резистентных к меропенему, выросла за три года с 2% до 6%. E. faecalis, резистентный к ампициллину, по рекомендациям EUCAST следует рассматривать как необычный фенотип: частота его встречаемости в популяциях энтерококков в настоящее время достаточно низка, однако в ряде географически и экологически обособленных микробиомов может существенно превышать среднюю.

Таблица 4 Распределение по фенотипической чувствительности изолятов E. faecalis, выделенных на МТФ в 2018-2020 гг. (%)

Изоляты E. faecalis	Чувствительные (S)			Чувствительные к повышенной дозе АМП (I)			Резистентные (R)
Год	2018	2019	2020	2018	2019	2020	2018	2019	2020
Ампициллин	52,0	62,2	61,2	28,0	29,0	28,5	20,0	8,8	10,2
Амоксициллин	46,0	55,5	67,3	52,0	31,1	20,4	2,0	13,4	12,2
Амоксициллин+ клавулановая кислота	66,0	66,7	48,9	22,0	27,0	36,7	12,0	6,7	14,2
Ванкомицин	40,0	44,5	47,0	50,0	48,9	40,8	10,0	6,7	12,2
Энрофлоксацин	50,0	68,9	85,7	50,0	26,7	10,2	0,0	4,5	4,0
Меропенем	58,0	64,4	79,6	40,0	33,3	14,2	2,0	2,2	6,1

Также отмечали изменение соотношения чувствительных и слабочувствительных к ванкомицину изолятов E. faecalis: за три года произошло перераспределение из группы (I) в группы (S) и (R). Значительно изменилась восприимчивость E. faecalis к энрофлоксацину: в 2020 году доля чувствительных изолятов увеличилась в 1,7 раза, преимущественно за счет уменьшения группы с промежуточной чувствительностью. При этом наблюдали также появление резистентных изолятов. В 2018 году не было выявлено ни одного изолята E. faecalis, устойчивого к энрофлоксацину, а в 2020 году они составляли уже 4% от всех исследованных (рисунок 3).

Рис. 3. Доля резистентных к антибиотикам изолятов от всех выделенных E. faecalis на МТФ в 2018-2020 гг.

Наиболее неблагоприятную динамику показала восприимчивость E. faecalis к амоксициллину. Соотношение изолятов существенно изменилось: количество слабочувствительных (I) уменьшилось в 2,5 раза, чувствительных (S) увеличилось в 1,5 раза, а количество резистентных (R) за три года выросло в 6 раз.

Заключение. Исследование в трехлетней динамике фенотипической антибиотикочувствительности энтерококков, выделенных из проб на молочно-товарной ферме, показало, что уровень резистентности изолятов колеблется в большинстве случаев в диапазоне 4-15%. К неблагоприятным тенденциям следует отнести рост количества устойчивых к меропенему E. faecium, значительную долю (более 10%) резистентных к пенициллинам изолятов E. faecium и E. faecalis; рост резистентности к меропенему; ванкомицину, а также, появление у изолятов E. faecalis устойчивости к энрофлоксацину. Положительные изменения касались, в основном, снижения доли изолятов E. faecium, резистентных к ампициллину, амоксициллину и энрофлоксацину, а также перераспределения энтерококков из группы с промежуточной чувствительностью в группу восприимчивых к меропенему, ванкомицину и амоксициллину. Анализ динамики профилей резистентности энтерококков показал, что интестинальные микробиомы животных на молочно-товарной ферме в значительной степени контаминированы агентами АМР (мобильными генетическими элементами и бактериями). Циркуляция элементов мобильного резистома в популяциях энтерококков на ферме несет риск распространения резистентности как в микробиомах животных, так и людей, находящихся на предприятии и контактирующих с содержащими кишечную микрофлору объектами.

Список литературы:

1. Европейский комитет по определению чувствительности к антимикробным препаратам. Таблицы пограничных значений для интерпретации значений МПК и диаметров зон подавления роста. Версия 10.0, 2020 (URL: http://www.eucast.org).
2. Национальный стандарт ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010 Клинические лабораторные исследования и диагностические тестсистемы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам. Часть 1. Референтный метод лабораторного исследования активности антимикробных агентов против быстрорастущих аэробных бактерий, вызывающих инфекционные болезни.
3. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Интерпретация и правила проведения клинических лабораторных исследований. Версия 2018-03// Клинические рекомендации, утверждены на Расширенном совещании Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии. 2017.
4. Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Версия 2021-01// Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии. 2021.
5. Ellabaan M.M.H., Munck C., Porse A. et al. Forecasting the dissemination of antibiotic resistance genes across bacterial genomes. Nat Commun, 2021, 12, 24-35.
6. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Amoxicillin: Rationale for the clinical breakpoints, version 1.0. 2010.
7. Hu Y., Yang X., Li J., Lu N., Liu F., Wu J., Lin I.Y., Wu N., Weimer B.C., Gao G.F., Liu Y., Zhu B. The Bacterial Mobile Resistome Transfer Network Connecting the Animal and Human Microbiomes. Appl Environ Microbiol, 2016, 82 (22). pp. 6672-6681.
8. Li X., Aly S.S., Su Z., Pereira R.V., Williams D.R. et al. Phenotypic Antimicrobial Resistance Profiles of E. coli and Enterococcus from Dairy Cattle in Different Management Units on a Central California Dairy. Clin Microbiol. 2018. 7. 311.
9. Matuschek E., Brown D.F.J., Kahlmeter G. Development of the EUCAST disk diffusion antimicrobial susceptibility testing method and its implementation in routine microbiology laboratories. Clin Microbiol Infect. 2014. 20. pp. 255-266.
10. Smillie C.S., Smith M.B., Friedman J., Cordero O.X., David L.A., Alm E.J. Ecology drives a global network of gene exchange connecting the human microbiome. Nature, 2011, 480(7376), pp. 241-244.
11. Wurster J.I., Jose T. S., Gilmore M.S. Impact of Antibiotic Use on the Evolution of Enterococcus faecium. The Journal of Infectious Diseases, 2015. 213 (12), pp. 1862-1865.

Резюме. В рамках работ по анализу контаминации животноводческих микробиомов агентами антимикробной резистентности проводили исследования динамики фенотипической чувствительности к антибиотикам изолятов Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis на молочно-товарной ферме в течение трёх лет. Изучали восприимчивость энтерококков к ванкомицину, меропенему, энрофлоксацину, ампициллину, защищенному амоксициллину в 2018, 2019, 2020 гг., анализировали изменения резистентности изолятов на протяжении трехлетнего периода наблюдений. Установили, что в большинстве проб энтерококки встречались в виде ассоциаций E. faecium и E. faecalis. В 32-45% случаев в пробах находили изоляты только одного вида, при этом частота обнаружения E. faecium и E. faecalis была сравнительно одинакова. Другие виды энтерококков встречались в единичном количестве. Исследования фенотипической антибиотикочувствительности показали, что средний уровень резистентности выделенных изолятов энтерококков колебался, в диапазоне 415%. Наблюдали увеличение количества устойчивых к меропенему изолятов E. faecium; появление у изолятов E. faecalis устойчивости к энрофлоксацину. Также выявили значительную долю (более 10%) резистентных к пенициллинам изолятов E. faecium и E. faecalis; рост резистентности энтерококков к меро-пенему и ванкомицину. Благоприятные тенденции выявили в снижении доли изолятов E. faecium, устойчивых к ампициллину, амоксициллину и энрофлоксацину. На протяжении 2018-2020 гг. отмечали перераспределение изолятов E. faecium и E. faecalis между чувствительной, умеренно чувствительной и резистентной группами, при этом основной тенденцией было уменьшение доли изолятов с промежуточной чувствительностью к повышенным концентрациям антибиотиков.

Ключевые слова: антибиотикочувствительность, антибиотикорезистент-ность, энтерококки, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, молочно-товарная ферма, антимикробные препараты, ванкомицин, меропенем, энро-флоксацин, ампициллин.

Сведения об авторах:

Кривоногова Анна Сергеевна, доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории биологических технологий ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН; 620145, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2572044; e-mail: tel-89826512934@yandex.ru.

Соколова Ольга Васильевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории геномных исследований и селекции животных ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН; 620145, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2572044; e-mail: nauka_sokolova@mail.ru.

Безбородова Наталья Александровна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории геномных исследований и селекции животных ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН; 620145, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2572044; e-mail: n-bezborodova@mail.ru.

Моисеева Ксения Викторовна, младший научный сотрудник лаборатории биологических технологий ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН; 620145, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2572044; e-mail: moiseeva456@yandex.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Исаева Альбина Геннадьевна, доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории биологических технологий ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН; 620145, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2572044; e-mail: isaeva.05@bk.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей