rus eng
Архив номеров / Номер 4, 2015 год Распечатать

Синцитиальный метод при ранней идентификации вируса лейкоза крупного рогатого скота

УДК 619:616-07:578. 828.2/001.8:636.2

Донник И.М. ФГБОУ ВПО "Уральский государственный аграрный университет", г. Екатеринбург
Петропавловский М.В. ФГБНУ Уральский НИВИ РАСХН, г. Екатеринбург

Введение. Лейкоз крупного рогатого скота - злокачественное вирусное лимфопролиферативное заболевание. Ретровирус, относящийся к семейству Retroviridae, роду Deltaretrovirus, интегрируется в ДНК лейкоцитов хозяина и пребывает в латентном состоянии в большом количестве клеток в течение длительного периода времени, что затрудняет его определение и выявление заболевших животных [1].

Известны различные диагностические подходы при тестирования образцов крови крупного рогатого скота на наличие вируса лейкоза крупного рогатого скота, в частности серологические методы (РИД, ИФА), молекулярно-генетические (ПЦР). Однако, с помощью серологических "непрямых" методов, невозможно выявить вирус лейкоза крупного рогатого скота на ранних стадиях инфекции, что особенно важно для своевременной изоляции здоровых телят от вируса лейкоза крупного рогатого скота инфицированных животных. ПЦР является более чувствительным "прямым" методом идентификации возбудителя, но при низкой провирусной нагрузке вируса лейкоза крупного рогатого скота на начальных стадиях заболевания не всегда эффективен [2, 3, 4].

В рамках изучения идентификации вируса на клеточных культурах известен синцитиальный тест. Сущность метода заключается в заражении чувствительных к вирусу лейкоза культур клеток СС81 (FLK - фибробласты легких кошки) или CF2Th (тимоциты собаки) лейкоцитами животных, тестируемых на наличие инфекции. Предложенный способ основан на известных наблюдениях аргентинского ученого Ferrer J.F., который описал способность культуры клеток к образованию синцития под воздействием вируса [5]. При позитивном результате, при микроскопировании на 7 день теста наблюдается интенсивное разрастание синцитий (шарообразное скопление многоядерных клеток в монослое). В этой связи, нашей задачей являлось изучение диагностической ценности синцитиального теста путем сравнительных диагностических исследований, биопробы, с целью рассмотрения возможности применения его при идентификации возбудителя лейкоза, особенно на ранних этапах инфицирования.

Цель исследования: изучить диагностическую ценность синцитиального метода при идентификации возбудителя лейкоза на ранних этапах его внедрения в сравнительном аспекте.

Материалы и методы исследований. Диагностические исследования (ПЦР, ИФА, РИД) выполнены по соответствующим "Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота", утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 23.08.20007.

Работа проведена на базе ветеринарного лабораторно-диагностического центра и лаборатории хронических инфекций Уральского НИВИ, областных и зональных ветеринарных лабораторий Среднего Урала.

Изучение и оценка эпизоотической обстановки по лейкозу в регионе проведены с использованием документов ветеринарной отчетности практической ветеринарии районов, областей УрФО.

Для проведения синцитиалного теста использовали клеточную линию СС81 (фибробласты легких кошки). В качестве питательной среды - Игла МЕМ с L-глутамином и двойным набором аминокислот (Биолот, Россия) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (PAA Laboratories, США), в 10% концентрации. Для стерилизации сыворотки использовали прогревание при температуре 56°С в течение 30 минут. Клеточную культуру культивировали в пластиковых флаконах (TPP, Швейцария) при температуре 37°С с полной сменой среды 3 раза в неделю. Окрашивание клеточной культуры производили по методу Грунвальда-Гимза. В качестве контроля цитопатогенного действия (ЦПД) применяли метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Отбор проб крови для исследований производили в вакуумные пробирки с ЭДТА объемом 10 мл. Для инфицирования клеток использовали лейкоцитарную взвесь, содержащую не мнее 5*106/мл клеток ресуспенди-рованную в 10% среде, с добавлением антибиотиков: амфотерицина (5 ЕД/мл), пенициллина, стрептомицина (по 100 ЕД (мкг/см3)).

Результаты исследований. Для воспроизведения опыта нами производилось внутрибрюшинное инфицирование лабораторных животных (мелкий рогатый скот) лейкоцитарной взвесью, содержащей вирусный материал. Все манипуляции производились согласно общепринятым методикам. В качестве положительного контроля использовали материал, отобранный от заранее инфицированного лабораторного животного, с подтвержденным на лейкоз диагнозом (РИД, ИФА, ПЦР). В качестве отрицательного контроля использовались отдельно содержащиеся животные предварительно полученными отрицательными результатами на лейкоз.

Лейкоцитарный материал, содержащий вирус лейкоза был отобран от неоднократно положительно реагирующих на вирус лейкоза крупного рогатого скота (РИД, ИФА, ПЦР) животных неблагополучных хозяйств Челябинской области. Для проведения сравнительных диагностических исследований, была сформирована группа изолированно содержащихся животных, еженедельно исследуемая серологическими (РИД, ИФА), молекулярно-генетическими (ПЦР), культуральными (СТ) диагностическими исследованиями начиная с шестого дня после инфицирования.

Исходя из полученных результатов, при первом исследовании были получены отрицательные результаты по каждому диагностическому методу. Это говорит об отсутствии в этот период специфического иммунологического ответа организма, достаточного для определения серологическими методами исследований, а также недостаточном количестве в клетках РНК провируса для предела чувствительности ПЦР и СТ, что объясняется в эти сроки первым этапом внедрения в организм лабораторного животного возбудителя вирус лейкоза крупного рогатого скота.

При втором исследовании, через 7 дней мы получили отрицательные результаты серологических (РИД, ИФА) и молекулярно-генетических (ПЦР) методов, однако при осуществлении лабораторных культуральных исследований наблюдали образование синцитиев в культуре клеток СС81, в материале от опытной группы.

Клеточная популяция СС81 содержит преимущественно фиброб-ластоподобные клетки, однако характеризуется некоторой неоднородностью клеточного состава. При добавлении в монослой свежей питательной среды, содержащей лейкоциты в количестве 5*106/мл от положительного по вирус лейкоза крупного рогатого скота животного, с последующей сменой среды с 6% и 2% эмбриональной сывороткой крупного рогатого скота через 2 и 4 дня, соответственно, в 7-ой день после окрашивания клеточной культуры по методу Грунвальда-Гимза наблюдали специфическое ЦПД, вызванное вирусом, в виде многоядерных клеточных образований - синцитиев, что говорило о наличии в образцах крови вируса ВЛ КРС. При этом контролем служили интактные клетки - монослой СС81 без внесения лейкоцитов, а также клетки с иннокулированными лейкоцитами от положительно и отрицательного реагирующего лабораторного животного. Это указывает на то, что исследуемый нами культуральный метод позволил идентифицировать возбудителя лейкоза крупного рогатого скота у лабораторных животных в наиболее ранние сроки после искусственного инфицирования (14 день). При последующих еженедельных исследованиях положительная реакция сохранялась. ПЦР же проявилась лишь на 3 неделе исследования (21 день), а серологические тесты, отражающие иммунологический ответ, обусловленный выработкой специфических иммуноглобулинов на белки гликопротеидной оболочки вируса (gp 51, p24), проявились лишь на 37 день исследования (5 неделя). Важно отметить, что в ходе опытов была соблюдена 100% согласованность проявления реакции по каждому методу исследования во всех повторностях, что подтверждает достоверность полученных данных.

Заключение. Проведенные лабораторные исследования подтвердили диагностическую ценность прямых методов идентификации возбудителя лейкоза крупного рогатого скота. При этом в наиболее ранние сроки (13 дней) после искусственного инфицирования лабораторных животных выявлена положительная реакция при синцитиальном методе исследования, что подтверждено контролями. Положительная ПЦР проявилась в 21 день, при третьем исследовании, а РИД, ИФА, лишь на 37 день (5 неделя).

Практически синцитиальный метод на данный момент можно использовать и как способ подготовки биоматериала для ПЦР диагностики по предложенной схеме, с выращиванием культуры клеток СС81 на среде Игла МЕМ. При заданных параметрах увеличивается уровень вирусной нагрузки, что повышает эффективность ПЦР диагностики и позволяет выявлять вирусоносителей среди телят эмбрионального заражения в возрасте 15-30 дней, снижая затраты на оздоровление стада.

Разработанная ранняя диагностика лейкоза позволит повысить эффективность оздоровления сельскохозяйственных предприятий от инфекции, так как изолирование инфицированных животных в наиболее ранние сроки является одной из приоритетных задач при осуществлении оздоровительных программ.

Список литературы:

  1. Гулюкин М.И., Замораева Н.В., Абрамов В.А. и др. Состояние и перспективы борьбы с лейкозом крупного рогатого скота // Ветеринария. 1999. N° 12. С. 3 - 8.
  2. Донник И.М., Трофимов О.В., Пак И.В. и др. Цитогенетические и проте-омные подходы к поиску маркеров лейкоза крупного рогатого скота // Ветеринария. 2012. N° 2. С. 26 - 29.
  3. Донник И.М., Шкуратова И.А., Татарчук А.Т. и др. Экспериментальные данные по эффективности диагностических исследований на ранних стадиях ви-русоносительства ВЛКРС. Рекомендации. - Екатеринбург, 2011.
  4. Козырева Н.Г Изучение чувствительности и специфичности методики ПЦР для выявления ДНК провируса лейкоза КРС в биологическом материале // Ветеринарная патология. - 2012. - N° 2. - С.123-126.
  5. Ferrer J.F., Piper C.E., Abt D.A., Marshak R.R. Diagnosis of bovine leukemia virus infection: evaluation of serologic and hematologic tests by a direct infectivity detection assay. American Journal of Veterinary Research, 1977; Dec. 38(12): 1977-81).

Резюме. Впервые в Уральском регионе получены положительные результаты по изучению диагностической ценности синцитиального теста при раннем выявлении носителей вируса лейкоза крупного рогатого скота. Нами производилось внутрибрюшинное инфицирование лабораторных животных (мелкий рогатый скот) лейкоцитарной взвесью, содержащей вирусный материал. Для проведения сравнительных диагностических исследований, была сформирована группа изолированно содержащихся животных, еженедельно исследуемая серологическими (РИД, ИФА), молекулярно-генетическими (ПЦР), культуральными (СТ) диагностическими исследованиями начиная с шестого дня после инфицирования. Проведенные лабораторные исследования подтвердили диагностическую ценность прямых методов идентификации возбудителя лейкоза крупного рогатого скота. При этом в наиболее ранние сроки (13 дней) после искусственного инфицирования лабораторных животных выявлена положительная реакция при синцитиальном методе исследования, что подтверждено контролями. Положительная ПЦР проявилась в 21 день, при третьем исследовании, а РИД, ИФА, лишь на 37 день (5 неделя). Разработанная ранняя диагностика лейкоза позволит повысить эффективность оздоровления сельскохозяйственных предприятий от инфекции, так как изолирование инфицированных животных в наиболее ранние сроки является одной из приоритетных задач при осуществлении оздоровительных программ.

Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, ретровирус, диагностика, синцитиальный тест, РИД, ИФА, ПЦР, культура клеток, ранняя идентификация вируса.

Сведения об авторах:

Донник Ирина Михайловна, доктор биологических наук, академик РАСХН, профессор, ректор ФГБОУ ВПО "Уральский государственный аграрный университет"; 620075, Свердловская область, г. Екатеринбург, ул. Карла Либкнехта, 42; тел.: 8 (343)371-33-63; e-mail: rector@urgau.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Петропавловский Максим Валерьевич, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник ФГБНУ Уральский НИВИ; 620219. Свердловская область, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112а; тел.: 8(343)2572044; e-mail: info@urnivi.ru.

 

 
2011 © Ветеринария Кубани Разработка сайта - Интернет-Имидж