Изучение пероксидации липидов в синовиальной жидкости собак с моделью остеоартроза коленных суставов

УДК: 616.72-008.8-007.248-092.9

Матвеева Е.Л., Спиркина Е.С., Степанов М.А. "ФГБУ РНЦ "ВТО"
имени академика Г.А. Илизарова Минздрава России, г. Курган

Введение. Дегенеративно-дистрофическая патология суставов относится к числу наиболее распространенных заболеваний опорно-двигательного аппарата. По данным ряда авторов, процессы перекисного окисления в патогенезе остеоартроза (ОА) имеют важное значение [8, 10]. В литературе показана ведущая роль свободно радикального окисления в повреждении структуры клеток [7]. Анализу информативности результатов исследования синовиальной жидкости (далее, СЖ) процессов пероксидации до настоящего времени были посвящены единичные работы, в которых авторы уделяют внимание лишь отдельным биохимическим показателям при той или иной форме заболевания [4]. Недостаток такой информации ограничивает возможности применения биохимического исследования СЖ в современной артрологической практике.

Целью данной работы является исследование процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в СЖ при развитии дегенеративнодистрофических изменений в суставах (ДДИС) на экспериментальной модели при разных стадиях развития заболевания.

Материалы и методы. Основным материалом исследования являлась СЖ 30 беспородных собак; интактных (n = 10) и с моделью ДДИС (n=20). Животных выводили из опыта на ранних стадиях (срок эксперимента 28 суток n = 14) и с моделью ДДИС на поздних стадиях заболевания (срок эксперименте 56 суток n=6). Выбор животных основан на том, что собаки наиболее удобны для экспериментального моделирования травм и заболеваний конечностей. Коленные суставы собак по анатомическому строению и типу регенерации хряща относительно близки к суставам человека [1]. Моделирование ОА осуществляли путем иммобилизации и компрессии обоих коленных суставов с пересечением бедренной артерии (Патент №2452999 от 10.06.2012 г. "Способ моделирования остеоартроза коленного сустава"). Содержание животных и оперативные вмешательства осуществляли согласно требованиям приказа МЗ СССР № 755, 1977 г., а также руководствуясь требованиями, изложенными в "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" с соблюдением этических норм и гуманного отношения к объектам изучения" [5].

Оценку процессов ПОЛ осуществляли путем измерения в СЖ содержания первичных - диеновых коньюгатов (ДК) и вторичных - малонового диальдегида (МДА) продуктов ПОЛ. Содержание ДК определяли спектрофотометрически по разности оптической плотности между опытной и контрольной пробами при длине волны 232 нм [9]. Определение МДА проводили по реакции с тиобарбитуровой кислотой [9]. Концентрацию продуктов ПОЛ рассчитывали на мг общих липидов (ОЛ) СЖ, которые в свою очередь определяли с помощью наборов фирмы "Lachema" (Чехия). О состоянии антиоксидантной защиты судили по активности в СЖ фермента - каталазы, определение которой проводили спектрофотометрически при длине волны 410 нм [6].

Статистическую обработку результатов выполняли с помощью программ "Microsoft Excel 2007" и "AtteStat" Версия 1.0 [2]. Цифровые данные представлены в виде медианы значений и интерквар-тильные размахи. Достоверность различий между группами наблюдений оценивали с помощью критерия Вилкоксона [3].

Результаты и их обсуждение. При макроскопическом препарировании суставов, на ранних стадиях развития ДДИС установлено, что, суставная капсула была утолщена в несколько раз, а количество СЖ было увеличено. Суставной хрящ мыщелков бедренной кости был рыхлым, при надавливании инструментом легко прогибался, глянец его отсутствовал. Цвет хряща был неоднородный, с красноватыми и синеватыми пятнами. Наибольшие изменения наблюдались с переднебоковых поверхностей мыщелков и на нагружаемых областях (менисковая часть) (рисунок 1).

Рис. 1. Макроскопическая картина мыщелков бедренной кости: а) интактный сустав, б) сустав после моделирования гонартроза

На поздних стадиях развития ДДИС количество СЖ было увеличено, капсула сустава утолщена в несколько раз, жировое тело Гоффа гипертрофировано. Суставной хрящ неоднородного цвета, истончен, с участками гиперемии, фиолетовыми и синюшными пятнами, глянцевость его отсутствовала, суставная поверхность была рыхлая. Аналогичная картина наблюдалась и на мыщелках большеберцовой кости.

На рисунке 2 представлена картина выраженного развития ДДИС, полученная нами при сроке эксперимента 56 дней.

Рис. 2. Макроскопическая картина суставного хряща: а) интактный сустав; б) мыщелки бедренной кости через 56 дней иммобилизации коленного сустава

В процессе эксперимента наблюдались пассивные движения животного, которые были резко ограничены и болезненны. В состоянии покоя конечность согнута в коленном суставе, наблюдалась хромота. Рентгенологически наблюдалось сужение суставной щели, остеопороз метафизов бедренной и большеберцовой костей прогрессировал, очаговый остеосклероз субхондральной зоны сохранялся, контуры суставных поверхностей были истончены и имели неоднородный рисунок с участками пониженной и повышенной плотности. Оптическая плотность надколенника в сравнении с интактным суста- 21 вом также была снижена.

В СЖ животных с ранними стадиями ДДИС мы получили биохимические показатели, которые приводим в таблице 1.

Таблица 1. Показатели липидного спектра и системы ПОЛ-АОС в синовиальной жидкости коленных суставов собак в контрольной и опытной группе при моделировании ОА на ранних стадиях развития ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)

Показатели	Контрольная группа (n=10)	Ранние стадии (n=14)
Общие липиды (ОЛ) г/л	4,20 (1,80;5,41)	4,63 (3,44;6,00)
Диеновые конъюгаты (ДК) нмоль/ гол	6,40 (5,15;6,73)	13,63 005(13,28;19,23)
Малоновый диальдегид (МДА) нмоль/ гол	1,78 (1,51;4,94)	0,56 0,001 (0,40;0,91)
Каталаза мкатал/ л	3,50 (3,03;3,95)	3,30 (2,84;3,62)
ДК+МДА	18,53 (7,20;38,20)	14,1 0,05 (13,16;19,68)
ДК/МДА	2,87 (0,30;4,56)	24,30 0,01 (23,04;29,08)

Примечание: верхний индекс – уровень значимости (р) по сравнению с нормой

По результатам исследования отмечено, что концентрация ОЛ СЖ при моделировании ОА на ранних стадиях ДДИС оставалась на дооперационном уровне. Концентрация ДК - промежуточного продукта пероксидации - возрастала относительно нормальных значений в 2 раза. Кроме того, обнаружили изменения в показателях конечного продукта ПОЛ - МДА, снижение которой наблюдалось в 3 раза относительно нормы. Расчетный коэффициент суммы продуктов ПОЛ [ДК+МДА] статистически значимо понижался, соотношение продуктов первичных и вторичных продуктов липопироксидации [ДК/МДА], показало их увеличение, что говорит об их перераспределении с уменьшением доли вторичных продуктов ПОЛ - МДА и повышением доли первичных продуктов - ДК. Активность каталазы, определенная в СЖ собак с моделью ДДИС на ранних стадиях, не имела достоверных отличий от нормальных значений.

По полученным нами данным, концентрация ОЛ СЖ при моделировании поздних стадий ОА было статистически значимо повышена, чего не происходило на ранних стадиях (таблица 2).

Таблица 2. Показатели липидного спектра и системы ПОЛ-АОС в синовиальной жидкости коленных суставов собак в контрольной и опытной группе при моделировании ОА на поздних стадиях развития ДДИС (медианы значений и интерквартильные размахи)

Показатель, ед.изм.	Контрольная группа (n=10)	Поздние стадии (n=6)
Общие липиды (ОЛ) г/л	4,20 (1,80;5,41)	6,32 0.001 (2,43;10,39)
Диеновые конъюгаты (ДК) нмоль/ г ол	6,40 (5,15;6,73)	17,90 0,01 (16,26;19,05)
Малоновый диальдегид (МДА) нмоль/ г ол	1,78 (1,51;4,94)	2,33 0,05 (2,12;2,56)
Каталаза мкатал/ г ОБ	3,50 (3,03;3,95)	3,85 (3,29;4,29)
ДК+МДА	11,39 (7,77;33,24)	41,65 0,05 (37,83;45,22)
ДК/МДА	4,54 (3,68;4,78)	7,68 0,01(7,66;7,94)

Примечание: верхний индекс - уровень значимости (р) по сравнению с нормой

Первичные продукты ПОЛ - ДК повышались относительно нормальных значений в 3 раза. На ранних стадиях развития заболевания происходило снижение концентрации МДА, однако, на поздних стадиях вторичные продукты ПОЛ были выше нормы. ДК и МДА обладают выраженной цитотоксичностью, снижают активность гликолиза и окислительного фосфорилирования, ингибируют синтез белков и нуклеиновых кислот, подавляют активность ферментов. Расчетный коэффициент суммы продуктов ПОЛ [ДК+МДА] соответственно также возрастал. Соотношение первичных и вторичных продуктов ПОЛ [ДК/МДА], показало статистически значимое увеличение, что говорит о преобладании первичных продуктов ПОЛ. Активность основного антиоксидантного фермента - каталазы оставалась практически без изменений.

В результате проведенного исследования было показано, что при ОА ранних стадий наблюдали изменения в показателях ПОЛ - снижение в 2 раза концентрации МДА и возрастание в 3 раза концентрации ДК. А при развитии поздних стадий ДДИС в СЖ у животных с ДДИС обнаруживается повышение в 1,5 раза концентрации ОЛ, накопление продуктов ПОЛ, сумма которых превышает нормальные значения в 2,5 раза. Дисбалланс в системе перокси-дации однако, не сопровождался изменениям активности основного антиоксидантного фермента - каталазы, как на ранних, так и на поздних стадиях ДДИС. Таким образом, проведенное исследование свидетельствует о существенном дисбалансе прооксидантных и антиоксидантных процессов в СЖ при ДДИС, сопровождающееся накоплением продуктов пероксидации.

Список литературы:

1. Анатомия домашних животных / А.И. Акаевский, Ю.Ф. Юдичев, Н.В. Михайлов, И.В. Хрусталева. - М.: Колос, 1984. - 543 с.
2. Гайдышев И.П. Решение научных и инженерных задач средствами Excel, VBA и C/C++. - СПб.: БХВ - Петербург. - 2004.- 512с.
3. Гланц С. Медицинская статистика / С. Гланц. М. : Практика, 2008. № 1. С. 75-79.
4. Дуляпин В.А. Синовиальная жидкость и значение ее исследования в диагностике заболеваний суставов / В.А. Дуляпин // Вопр. ревматизма. 1974. - № 4. - С. 72-76.
5. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей // Вопросы реконструктивной и пластической хирургии. - 2003. - №4. - С.34-36.
6. Королюк М.А., Иванова Л.И., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. - 1988. - №1. - с. 16-19.
7. Латюшин Я.В. Особенности влияния хронического стресса на пе-рекисное окисление липидов в скелетной и сердечной мышцах // Вестник Южно-Уральского государственного университета. Серия: Образование, здравоохранение, физическая культура. 2005. № 4 (44). С. 244-247.
8. Мещерякова М.Г Использование биохимических показателей для оценки качества и эффективности лечебных мероприятий у больных остеоартрозом коленного сустава / Мещерякова М.Г, Трилис Я.Г, Кириллова Н.В., Алпатова Т.Ф., Мухин И.А., Кожевин А.А. // Биомедицинская химия. -2012. Том 58, вып. 2. С. 230-236.
9. Орехович В.Н. Современные методы в биохимии // Медицина 1977 г. С. 392.
10. Титов, В.Н. Методические вопросы и диагностическое значение определения перекисного окисления липидов в липопротеинах низкой плотности. Олеиновая жирная кислота как биологический антиоксидант: (обзор литературы) / В.Н. Титов, Д.М. Лисицын, С.Д. Разумовский // Клиническая лаб. диагностика. - 2005. - № 4. - С. 5.

Резюме. Согласно современному взгляду на природу остеоартроза, эта патология является хроническим прогрессирующим заболеванием суставов, связанным с дегенеративными процессами в хряще, развитием вторичного синовита, усиливающего прогрессирование болезни. В патогенезе развития остеоартроза имеют значение множество факторов. Одним из наиболее значимых факторов является повреждение клеточных мембран свободными радикалами. В синовиальной жидкости экспериментальных животных с моделированием разных стадий остеоартрозого процесса проведен анализ процессов пероксидации липидов. Моделирование ОА осуществляли путем иммобилизации и компрессии обоих коленных суставов. Применение экспериментальной модели путем компрессии, с использованием аппарата Илизарова показало, что данные повреждения вызывают деструктивно-дистрофические изменения в суставе, что было подтверждено клинически и рентгенологически. Метаболические нарушения в синовиальной среде пораженного сустава приводят к изменениям в ее биохимическом составе. На основе изучения 30-ти образцов синовиальной жидкости собак было установлено, что на ранних стадиях наблюдаются изменения в показателях ПОЛ - снижение концентрации МДА и возрастание в концентрации ДК, а при развитии поздних стадий у собак в синовии обнаруживается накопление продуктов пероксидации липидов. Однако, как на ранних, так и на поздних стадиях патологического процесса. дисбал-ланс в системе пероксидации не сопровождался изменениям активности основного антиоксидантного фермента - каталазы. Полученные биохимические, рентгенологические и макроскопические наблюдения показывают, что разработанная в эксперименте модель дегенеративно-дистрофических изменений в суставах может быть использована для изучения и является патогенетически адекватной клинической картиной болезни.

Ключевые слова: остеоартроз, перекисное окисление липидов, синовиальная жидкость, дегенеративно-дистрофические изменения в суставах, антиоксидантная система, диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, каталаза, общие липиды, моделирование остеоартроза.

Сведения об авторах:

Матвеева Елена Леонидовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии ФГБУ "РНЦ "ВТО" им. акад. Г. А. Илизарова Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8(3522)450538; е-mail: matveevan@mail.ru.

Степанов Михаил Александрович, ведущий научный сотрудник, кандидат ветеринарных наук, ветеринарный врач лаборатории гнойной остеологии и замещения дефектов конечностей ФГБУ "РНЦ "ВТО" им. акад. Г. А. Илизарова Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8(3522)454636; е-mail: m-stepanov@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Спиркина Елена Сергеевна, лаборант-исследователь лаборатории биохимии ФГБУ "РНЦ "ВТО" им. акад. Г.А. Илизарова Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8 (3522) 450538; е-mail: spirkina.82@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей