Сравнение патогенных свойств изолята «Vors - 07» и референтного вирулентного вируса болезни Марека штамма MD5

Чичерина Е.А., Ирза В.Н. ФГБУ"ВНИИЗЖ", г. Владимир
О.Ю.Черных ГБУ КК "Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория", г. КропоткинБолезнь Марека - высококонтагиозная вирусная болезнь кур и индеек, проявляющаяся в 2-х формах: классической (с поражениями периферической и центральной нервной системы) и острой (с развитием злокачественных лимфом в висцеральных органах).

На протяжении последних лет зарегистрированы вспышки болезни Марека, вызванные высоковирулентными вирусами, в том числе, в стадах вакцинированных птиц. Для профилактики болезни используют вакцины, изготовленные из штаммов трех серотипов вируса в различных комбинациях [2].

Отмечено повышение вирулентности вируса болезни Марека [4, 5, 6]. Основная причина изменения патогенности вируса заключается в мутациях специфических вирусных генов, изменяющих время индукции опухолей, снижающих скорость репликации in vitro. Данная эволюция вируса болезни Марека, возможно, является результатом иммунологического процесса, вызванного систематической поголовной вакцинацией, а также возможной рекомбинацией с другими вирусами [3]. Биологические свойства циркулирующих на территории Российской Федерации вирулентных вирусов птиц остаются недостаточно изученными.

Материалы и методы.

Изолят вируса болезни Марека. В 2007 году сотрудниками лаборатории профилактики болезней птиц из патологического материала от кур 180-ти суточного возраста, доставленных из птицефабрики "Ворсменская" Нижегородской области с признаками болезни Марека, на культуре клеток кожи СПФ-эмбрионов кур был получен изолят "Vors-07", относящийся к 1 серотипу вируса болезни Марека.

Штамм Md5 вируса болезни Марека. Вирулентный штамм Md5 1 серотипа, полученный из коллекции "Collection of animal viruses and antisera, chlamidiae and rickettsiae" (США), адаптирован к культуре клеток кожи СПФ-эмбрионов кур, к 5 пассажу инфекционная активность составила 6,8*105 ФОЕ/см3, что составляет 5,83 lg ТЦД/ см3.

Вакцина "Марек-3". Вирусвакцину против болезни Марека изготавливают на первичной культуре клеток ФЭК, содержащей вирус герпеса индеек (шт. "Владимир").

Вакцина "Бимарек". Вирусвакцину изготавливают на первичной культуре клеток ФЭК, содержащей вирус герпеса индеек (шт. "Владимир") и вирус герпеса кур ("SB-1").

Вакцина "Тримарек". Вирусвакцину изготавливают на первичной культуре клеток ФЭК, содержащей вирус герпеса индеек (шт. "Владимир"), аттенуированный штамм вируса болезни Марека (шт. "3004") и вирус герпеса кур (шт. "SB-1").

Для лабораторных исследования на базе вивария ФГБУ "ВНИИЗЖП" в боксовых помещениях использовали клинически здоровых цыплят различных возрастов, свободных от материнских антител. После внешнего осмотра птицы разрезали кожу и снимали ее с конечностей. Вскрытие брюшной и грудной полости начинают с разреза брюшной стенки от клоаки вентрально и доводят его до конца грудной кости. Килевую кость поднимают вверх, подрезают ножницами, и производят отбор пораженных участков необходимых органов.

При статистической обработке результатов исследований были использованы общепринятые методы, рекомендованные Гланцем С [1], а также компьютерная программа Microsoft Office Excel.

Результаты исследований. Были проведены исследования по сравнению патогенных свойств изолята "Vors-07" и референтного штамма Md5 вируса болезни Марека, в опытах на цыплятах, вакцинированных моно-, би- и тривалентными вакцинами.

Для проведения испытания было сформировано 9 групп по 20 голов:

• 1-я группа служила контролем опыта - цыплята невакциниро-ванные и незараженные;
• 2-я группа являлась контролем изолята "Vors-07" - в 8-ми суточном возрасте цыплят инфицировали в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см3:
• 3-я группа являлась контролем вирулентного штамма Md5 вируса болезни Марека - в возрасте 8-ми суток была инфицирована им в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см3;
• 4-я и 5-я группы были в суточном возрасте иммунизированы вакциной "Бимарек" в дозе 2000 ФОЕ/0,2 см3;
• 6-я и 7-я группы в суточном возрасте были иммунизированы вакциной "Марек-3" в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см3;
• 8-я и 9-я группы были иммунизированы в суточном возрасте вакциной "Тримарек", содержащей в дозе 0,2см3 - 2000 ФОЕ вируса штамма "Владимир" ВГИ, 1000 ФОЕ штамма "3004" ВБМ и 100-300 ФОЕ штамма "SB-1" ВГК.

По истечении 8-ми суток цыплята были подвергнуты контрольному заражению вирулентными штаммами в следующем порядке:

• 4, 6 и 8 группы инфицировали патогенным изолятом "Vors-07" ВБМ в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см3;
• 5, 7 и 9 опытные группы были инфицированы штаммом Md5 ВБМ в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см3.

Каждая опытная группа цыплят в течение всего опыта содержалась в одинаковых условиях в отдельных изолированных боксах, соответствующих зоогигиеническим нормам содержания птиц данной возрастной категории. Срок наблюдения составил 120 сут.

Степень патогенности штаммов оценивали по следующим критериям: процент гибели в группе и макроскопические поражения внутренних органов (печень, селезенка, почки, сердце, седалищный и плечевой нервы).

В продолжение всего периода наблюдения проводился ежедневный осмотр поголовья. Наличие поражений, вызванных штаммом Md5 и изолятом "Vors-07" вируса болезни Марека, учитывали на протяжении всего опыта. Проводили патологоанатомическое вскрытие цыплят, павших в течение эксперимента. Убой птиц с последующим вскрытием и патологоанатомическим исследованием был проведен в 120-ти суточном возрасте.

При вскрытии регистрировали характерные для болезни Марека изменения во внутренних органах. Полученные результаты представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Патогенность изолята "Vors-07" болезни Марека для вакцинированных цыплят

Наимено­вание исследу­емых групп	Всего использовано голов (шт)	Пало в опыте		Убито в конце опыта		Всего случаев болезни Марека, %
		всего	от болезни Марека	всего	с признаками болезни Марека
Контроль вирулентного вируса	20	10	4	10	10	70,0
3 серотип	20	8	4	12		20,0
2+3 серотип	20	2	2	18		10,0
1+2+3 серотип	20	2	2	18		10,0

* - отрицательный результат

Результаты, представленные в таблице 1, демонстрируют, что изолят "Vors-07" болезни Марека имеет высокую степень патогенности. В группе контроля вирулентного вируса, где цыплята были инфицированы изолятом "Vors-07" в дозе 1000 ФОЕ, гибель птицы наблюдали с 30-ти суток после заражения. По окончании опыта была произведена эвтаназия цыплят - у 70% цыплят в группе были обнаружены признаки болезни Марека.

Аналогичные изменения были обнаружены и при патологоанатомическом вскрытии павших цыплят - наблюдали лимфоидные поражения внутренних органов (печени, почек, селезенки, сердца). На сердце под эпикардом обнаруживали беловато-серые лимфоидные поражения различной величины, также были отмечены мелкие беловатые лимфомы на печени. Селезенка была серовато-бордового цвета с мраморным рисунком, узелковыми опухолями и увеличена в размере, почки увеличены в размере в 1,5-2 раза. Во всех пораженных органах наблюдалась анемия и дистрофия. Данная патологоанатомическая картина характерна для острой формы болезни Марека.

Таблица 2. Патогенность штамма Md5 вируса болезни Марека для вакцинированных цыплят

Наименова­ние исследуе­мых групп	Всего использо­вано голов (шт)	Пало в опыте		Убито в конце опыта		Всего случаев БМ, %
		всего	от БМ	всего	с признаками БМ
Контроль вирулент­ного вируса	20	6	6	14	10	80,0
3 серотип	20	6	2	14	6	40,0
2+3 серотип	20	4	2	16	2	20,0
1+2+3 серотипы	20	2	2	18	2	20,0

* - отрицательный результат

Результаты, представленные в таблице 2, демонстрируют, что гибель цыплят, инфицированных высоковирулентным штаммом Md5 вируса болезни Марека в группе контроля вирулентного вируса, наблюдали с 30 суток после заражения, количество случаев заболевания составляет 80% цыплят в группе. При вскрытии цыплят обнаруживали поражения печени, сердца, селезенки, бурсы. Все пораженные органы были увеличены и бледны вследствие их инфильтрации лимфоидной опухолевой тканью.

Однако, у вакцинированной птицы при заражении вирулентными штаммами "Md5" и "Vors-07" вируса болезни Марека через 8 суток после иммунизации не наблюдали явных клинических признаков.

При вскрытии птиц опытных групп были обнаружены патизмене-ния внутренних органов, характерные для болезни Марека, описанные выше. В группах птиц, вакцинированных моновалентной вакциной и зараженных "Vors-07" и "Md5" при вскрытии отмечали признаки болезни Марека у 20% и 40% цыплят, соответственно. В группах, вакцинированных би- и тривалентной вакцинами и зараженных "Vors-07" и "Md5", - по 10% и 20% птиц, соответственно. Также болезнь проявлялась истощением, отставанием в росте, нарушением опорно-двигательной системы. При вскрытии птиц контрольной группы отклонений от физиологической нормы не обнаружено.

Заключение. По полученным результатам можно сделать вывод, что по степени патогенности штамм "Vors-07" близок к референтному высоковирулентному штамму "Md5", а заражение птицы в возрасте 8-ми суток является оптимальным при проведении экспериментов по определению вирулентности полевых изолятов болезни Марека и оценке эффективности вакцин.

Список литературы:

1. Гланц С. Медико-биологическая статистика / Пер. с англ. под ред. Н. Е. Бузикашвили и Д.В. Самойлова - М., "Практика", 1999. - 460 с.
2. Куляшбекова Ш.К., Борисов А.В., Дрыгин В.В. Болезнь Марека. - Владимир: Транзит-ИКС, 2008. - 214 с., ил.
3. A recombinant field strain of Marek’s disease (MD) virus with reticuloendotheliosis virus long terminal repeat insert lacking the meq gene as a vaccine against MD / S.Su, N. Cui,Y.Zhou [et al.] // Vaccine. - 2015. - Vol. 33. - P. 596-603.
4. Hildebrandt E, Dunn J, Cheng HH. Characterizing in vivo stability and potential interactions of a UL5 helicase-primase mutation previously shown to reduce virulence and in vivo replication of Marek’s disease virus // Virus Res. - 2015.
5. Pathogenic characteristics of Marek’s disease virus field strains prevalent in China and the effectiveness of existing vaccines against them / Y.P. Zhang, Z.J. Li, K.Y. Bao [et al.] // Vet Microbiol. - 2015 Jan
6. Woz'niakowski G., Samorek-Salamonowicz A.E. Molecular evolution of Marek’s disease virus (MDV) field strains in a 40-year time period // Avian Dis. -2014. Vol. 58. - P. 550-557.

Резюме. Болезнь Марека - высококонтагиозная вирусная болезнь кур и индеек, проявляющаяся в 2-х формах: классической (с поражениями периферической и центральной нервной системы) и острой (с развитием злокачественных лимфом в висцеральных органах). На протяжении последних лет зарегистрированы вспышки болезни, вызванные высоковирулентными вирусами, в том числе, в стадах вакцинированных птиц. Для профилактики болезни используют вакцины, изготовленные из штаммов трех серотипов вируса в различных комбинациях. Проведены исследования по сравнению патогенных свойств изолята "Vors-07" и референтного штамма "Md5" вируса болезни Марека (оба вируса относятся к 1 серотипу), в опытах на иммунизированной птице. Суточные цыплята каждой опытной группы были привиты: моно-вакциной на основе 3 серо-типа (ВГИ, штамм "Владимир"), бивалентной 3+2 (+штамм SB1) и трехвалентной 3+2+1(+штамм "3004"), и в 8 сут. возрасте зараженывирусами "Vors-07" и "MD5" в дозе 1000 ФОЕ/0,2 см3. В течение 120-сут. периода наблюдения индуцированные вирусом лимфомы обнаруживали у птиц, зараженных изолятом "Vors-07": в группе, привитой вакциной 3 серотипа - у 20% цыплят, вакцинами 2+3 - 10% и 1+2+3 -10%, соответственно. В группах аналогично привитых цыплят, зараженных затем вирусом "Md5", процент птиц с неопластическими поражениями составил 40%, 20% и 20%, соответственно. В контрольных группах невакцинированных цыплят вирус "Md5" вызвал типичные для б. Марека поражения у 80% птиц, а изолят "Vors-07" - у 70%. Таким образом, экспериментально установлено, что изолят "Vors-07" относится к группе высоковирулентных вирусов болезни Марека и имеет степень патогенности для цыплят, схожую с референтным высоковирулентным штаммом "Md5".

Ключевые слова: вирус, вирулентный штамм, серотип, болезнь Марека, вспышка, изолят, патогенность, лимфоидная ткань, лимфома, инфильтрация, вакцина.

Сведения об авторах:

Чичерина Екатерина Александровна, начальник участка отдела биобезопасности и ветеринарно-санитарного режима ФГБУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ"); 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец; тел.: (4922) 260614; e-mail: chicherina@arriah.ru

Ирза Виктор Николаевич, доктор ветеринарных наук, начальник отдела по болезням птиц ФГБУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ"); 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец; тел.: (4922) 261867, e-mail: irza@arriah.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Черных Олег Юрьевич, доктор ветеринарных наук, директор ГБУ КК "Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория"; 352380, Краснодарский край, г. Кропоткин, ул. Красноармейская, д. 303; 8 (86138) 6-23-14; e-mail: gukkvl50@kubanvet.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей