rus eng
Архив номеров / Номер 3, 2014 год Распечатать

Диагностические оценки ПЦР и РПИФ при использовании выборки от полевых вспышек африканской чумы свиней

Куриннов В.В., Васильев А.П., Белянин С.А., Стрижакова О.М., ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров
Ногина И.В., Сидлик М.В., Газаев И.Х., Цыбанов С.Ж., Миронова Л.П. Ростовская областная ветлаборатория, г. Ростов-на-Дону
Аликова Г.А. Комитет ветеринарии Волгоградской области, г. Волгоград
Джаилиди Г.А. госветуправление Краснодарского края, г. Краснодар
Черных О.Ю. ГБУКК"Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория", г. Кропоткин

Введение. Основной особенностью семилетнего развития эпизоотического процесса АЧС в сильно структурированном свиноводстве Российской Федерации является наблюдаемая периодичность его активных фаз (эпизоотий) с короткими межэпизо­отическими периодами с низкой или очень низкой месячной инци­дентностью вспышек (спорадические случаи) как в стадах домашних свиней, так и популяциях диких кабанов. Инфекция АЧС всегда сопро­вождалась геморрагическим воспалением, коротким инфекционным периодом (5-7 дней) с последующим фатальным 100% исходом [1], что свидетельствует о высокой вирулентности вируса [1, 8, 9].

Сразу же, после интродукции вируса АЧС на территорию РФ, для подтверждения инфекции использовали лабораторные методы по ГОСТ 2857-90 "Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканс­кой чумы свиней" [3, 10]. Рекомендованные методы предназначались для диагностических исследований АЧС при острой (изоляция вируса с использованием культуры макрофагов in vitro и феномена гемадсорбции, реакция прямой иммунофлуоресценции, сэндвич ИФА), хронической и латентной формах течения (реакция непрямой иммунофлуоресцен-ции, непрямой иммуноферментный анализ). Ранее, хорошая диагнос­тическая эффективность этих реакций была признана экспертами МЭБ при ликвидации АЧС в Европе и Латинской Америке в 20 веке [13, 15]. Исторически, в РФ для указанных методов реагенты и набо­ры препаратов были разработаны ещё в 70-80 годы прошлого столе­тия [2, 7], но имели статус валидированных только на основании ис­пользования выборки от экспериментальной инфекции АЧС. Первая публикация относительно ПЦР, как диагностического метода, была в 1992 году [14], а в РФ - в 1995 году [11]. Позднее, после усовершенс­твований, в практику диагностики АЧС была введена ПЦР в реальном времени [12], но вопросы валидации ПЦР (варианты электрофорезного и в реальном времени) практически были освещены очень ограничен­но [4, 5, 6].

В связи с перманентным развитием эпизоотической ситуа­ции, основной интерес властей к лабораторным исследованиям был основан, прежде всего, на необходимости быстрого подтверждения подозрения на АЧС. Благодаря активному влиянию госветслужбы, были организованы централизованные государственные закупки диагностических средств и оборудования, тренинг практических ве­теринарных специалистов в научно-исследовательских учреждениях страны, поэтому ПЦР, РПИФ и ИФА были очень быстро внедрены в обычную практику ветеринарных лабораторий [9, 10]. С точки зрения объектов обнаружения, рассматриваемые реакции можно считать условно зависимыми (обе реакции обнаруживают вирус) и независи­мыми, так как на молекулярном уровне ПЦР обнаруживает фрагмен­ты вирусспецифической ДНК, а РПИФ (или ИФА) - вирусспецифичес-кие полипептиды. Однако, хорошие научные знания принципа работы реакций и их блестящее техническое выполнение, могут объяснить только механизмы обнаружения компонентов вируса и представлять только свидетельства их обнаружения (то есть продукты амплифика­ции или люминесцентная визуализация вирусных белков). Однако, для достижения основной цели лабораторных исследований - не­предубеждённо оценивать полученные результаты реакций и затем делать заключение "болезнь есть" или "болезни нет", требуются очень хорошо выверенные знания диагностических характеристик исполь­зуемых методов. Поэтому, из-за отсутствия таких данных ветеринарным руководством было принято решение об обязательной перепроверке положительных результатов ПЦР и РПИФ (но не отрицательных), получен­ных практическими ветеринарными лабораториями на АЧС, в научных учреждениях (ВНИИВВиМ или ВНИИЗЖ).

Таким образом, имея в своём распоряжении данные масш­табных лабораторных скринингов большого количества инфицирован­ных АЧС и интактных домашних свиней и кабанов, выполненные ВНИ-ИВВиМ и практическими ветеринарными лабораториями в течение 2008-2013 годов, а также все выборки при вспышках, основной це­лью исследований было валидация ПЦР и РПИФ и оптимизация схемы выполнения для усиления законности лабораторных исследований на

АЧС.

Материалы и методы. Для выполнения РПИФ и ПЦР ис­пользовали коммерческие серии наборов и реагентов собственного производства:

  • "Специфические ФИТЦ-иммуноглобулины АЧС для им-мунофлуоресцентной диагностики африканской чумы свиней" - ком­мерческие серии ВНИИВВиМ; выполнение РПИФ в соответствии "Инструкции по применению";
  • "Тест-система для выявления ДНК вируса АЧС методом ПЦР в реальном времени" - коммерческие серии ВНИИВВиМ.

В практических ветеринарных лабораториях была исполь­зована также коммерческая тест-система "АЧС" для выявления ге­нетического материала вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (производство ФБУН ЦНИИ Эпидемио­логии).

Учёт результатов реакций был дихотомический (то есть "по­ложительный" или "отрицательный"), несмотря на субъективные оцен­ки по 4-х бальной шкале для РПИФ или инструментальные по Ct- оцен­кам для ПЦР.

Для индивидуальной оценки диагностических характерис­тик ПЦР и РПИФ использовали сложную выборку, которая включала полевые экспертизы, сгруппированные в страты, включавших пробы от всех павших домашних свиней или диких кабанов, классифициро­ванные как "референс-положительные АЧС" (на основании опроса и идентифицированные как ПЦР-положительные и/или РПИФ-положительные практическими ветеринарными лабораториями). Так как типы проб были разными (для ПЦР использовали пробы крови/сыво­ротки, костного мозга, а для РПИФ - в основном, только селезёнки), количества выборок для оценки каждой реакции также были разными.

Выборки "неинфицированных" домашних свиней и диких кабанов были из исторически свободных по АЧС территорий РФ.

Такой тип выборки для парных лабораторных исследований был использован для оценки различий диагностической чувствитель­ности и согласованности реакций. Для этого выборки (п. 1.2.1.) были "нормализованы" по размеру и типу пробы, то есть для оценок реак­ций от каждого животного выборки отбирали парную пробу селезён­ки.

Кроме выборки павших животных, в исследованиях срав­нений реакций также использовали парные пробы селезёнок случай­ной выборки отстрелянных диких кабанов в неблагополучных по АЧС субъектах РФ.

Так как данный проект выборки предназначен для сравне­ния, размер и структура выборки были для каждой реакции одинако­выми.

При непарных лабораторных исследованиях было последо­вательное выполнение каждой реакции индивидуально, когда не все пробы могли быть проверены каждой реакцией. Данный проект был предназначен для определения индивидуальных диагностических характеристик ПЦР и РПИФ.

При парных лабораторных исследованиях – параллельное выполнение реакций, то есть тестирование одних и тех же проб ПЦР и РПИФ было предназначено для оценок различий чувствительности и согласованности реакций.

Использовали статистические методы определения вели­чины диагностической чувствительности, диагностической специфич­ности с использованием таблицы 2*2 [11], различий (МсМетаг'в-статистика) и согласованности (каппа) реакций с использованием пакета программ WinEpiscope 2.0 и Medcalc 10. Для определения прогностических положительных и отрицательных результатов реак­ций (прогностических характеристик) и эффективности параллельно­го выполнения использовали данные превалентности АЧС в разных фермах домашних свиней [1] и программу "MultipleDiagnosticTest" пакета WinEpiscope 2.0.

Проект и процесс выборки, осуществляемые на основе использования полевых проб для валидации методов, очень трудны, поэтому требуют описания деталей и пояснения, чтобы дальнейшие интерпретации данных и выводы авторов были понятными. От кор­ректности выборки зависит точность диагностических показателей и рекомендаций относительно стратегии применения лабораторных методов. В наших исследованиях выборки были выполнены прак­тическими ветеринарными врачами при вспышках АЧС в период с 2008 по 2013 годы включительно в 30 субъектах Российской Феде­рации. Процедуры выборки чаще были от первично инфицированных АЧС павших свиней (целенаправленная выборка), но всегда имели элемент случайности, а также неконтролируемые вмешивающиеся факторы. Поэтому границы терминологии выборки междуэмпиричес­кой и случайной установить трудно и потребовалось немало усилий для селекции и приведения проб их в приемлемый статистический порядок. В таблице 1 приведены наиболее общие данные количеств обследованных животных (домашних свиней и диких кабанов) с ха­рактеристикой как "инфицированные АЧС", то есть в основной массе они имели клинические признаки болезни, подтверждённые лабора­торными исследованиями.

Таблица 1 Размеры положительных АЧС выборок (количества страт и животных по видам), использованные в расчётах для определения диагностической чувствительности ПЦР и РПИФ

Метод

Количество АЧС экспертиз (страт)

Количество клинически инфицированных животных* в стратах

домашние

дикие

домашние

дикие

ПЦР

405

221

1220

519

РПИФ

364

178

987

416

Примечание: * - имели клинический статус больных и как поло-жительные-ПЦР и положительные-РПИФ, тестированные в практических ветери­нарных лабораториях.

Выборки были классифицированы как истинные (референс) инфицированные, и каждую отдельно использовали для исследований.

В связи со сложным проектом выборки, были применены два варианта оценки переменных методов. Первый основывался на определении индивидуальных значений диагностической чувствитель­ности и специфичности ПЦР и РПИФ, так как в знаменателе для каж­дой реакции выборка количеств истинно инфицированных АЧС живот­ных была разной, а исследование - непарным. При таком варианте исследования выборки в различных специфических стратах (домаш­них свиней и диких кабанов) в расчётах таблицы 2 показаны разли­чия диагностической чувствительности индивидуальных показателей ПЦР и РПИФ. РПИФ имела очень хорошую относительную вероятность получения положительных результатов - 98,2% (97,4-99,0%), по срав­нению с ПЦР 93,4% (92,1-94,8%). Однако, при тестировании диких кабанов вероятность положительных результатов РПИФ была ниже - 86,1% (82,7-89,4%), по сравнению с ПЦР - 90,8% (88,3-93,2%).

Таблица 2. Индивидуальные оценки диагностической чувствительности и специфичности РПИФ и ПЦР для подтверждения АЧС (WinEpiscope 2.0, Р=0,05)

 

Вид

домашние

кабаны

АЧС

свободные

АЧС

свободные

РПИФ

+

969

11

358

6

-

18

9273

58

1302

987

9284

416

1308

Диагностическая чувствительность: 98,2 (97,4-99,0)% Диагностическая специфичность:

99,88 (99,8-99,5)%

индекс Youden's0,98

Диагностическая чувствительность:

86,1 (82,7-89,4)%

Диагностическая специфичность:

99,5 (99,2-99,9)%

индекс Youden's0,86

ПЦР

+

1140

27*

471

7

-

80

9257

48

1308

1220

9284

519

1308

Диагностическая чувствительность:

93,4 (92,1-94,8)%

Диагностическая специфичность:

99,7 (99,6-99,8)%

индекс Youden's0,93

Диагностическая чувствительность:

90,8 (88,3-93,2)%

Диагностическая специфичность:

99,5 (99,0-99,9)%

индекс Youden's0,90

Примечание: * - результаты были получены при исследованиях проб с использованием коммерческой тест-системы "АЧС" для выявления виру­са африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (произ­водство ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии).

Узкие диапазоны отклонений доверительных интервалов, высокий индекс Youden's (0,9) при всех ситуациях оценки подтверж­дали точность расчётов (хорошие размеры выборки). Однако, "испор­ченные" показатели диагностической чувствительности обеих реак­ций, и ПЦР и РПИФ при использовании выборок от кабанов, вероятно, связаны с ошибками выборки, так как в страте выборки априори мог­ли оказаться павшие, но неинфицированные вирусом АЧС кабаны. Относительно природы ложноотрицательных результатов можно, хотя и с осторожностью, утверждать о большей роли и биологических фак­торов (клинический статус) и связанных с ними репрезентативности выборки (специфическая проба - селезёнка от павших). В наших ис­следованиях размеры выборки превосходные как от домашних сви­ней, так и диких кабанов, которые значительно превышали расчётные при Р=0,05 в несколько раз. Однако, уверенно можно предположить, что в некоторых стратах могли быть заражённые индивидуумы, но недавно инфицированные, то есть в инкубационном периоде (мало циклов репродукции вируса и его концентрация невелика для анали­тической чувствительности ПЦР и РПИФ). Таким образом, для сниже­ния количеств "ложно-отрицательных" результатов методов репрезен­тативность выборки существеннее, чем её размер.

ПЦР - "ложноположительные" результаты были получены только субъектовыми ветеринарными лабораториями, и только в тех случаях, когда использовали коммерческую тест-систему производс­тва ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии. Основная версия ПЦР-"ложноположительных" - техническая (аутоамплификация), так как отсутствие вируса было подтверждено перепроверкой проб референс-методом биопробы. Не умаляя неоспоримых преимуществ и аналитических характеристик, ПЦР, также, имеет слабые места, а главное -это слу­чайные и спонтанные контаминации, которые могут выявиться на любой стадии выборки или транспортировки или подготовки проб для анализа и которые могут навредить её авторитету.

К рискам получения ошибок РПИФ имели отношение на­ведённая неспецифическая флуоресценция нейтрофилов, а также влияние технических факторов (ошибки специалистов при интерпре­тации люминесцентной микроскопии).

Хотя факты получения случайных "ложноотрицательных" и "ложноположительных" результатов свидетельствуют о необходимости тщательного отношения квалидации выборки, диагностическим средс­твам итренингу персонала, перепроверкой положительных выборок (указание ветеринарных властей) при использовании однотипных диагностикумов (тест-системы), способов выполнения реакций было получено почти полное совпадение положительных и отрицательных результатов между практическими ветеринарными лабораториями и ВНИИВВиМ как на уровне страт, так и на уровне животных.

Так как на индивидуальные оценки ПЦР и РПИФ основное влияние оказало значение ошибок, связанных с выборкой, а именно "вмешательство" эмпирического фактора, ассиметричность размера и репрезентативности иструктуры выборки, для оценок различий и со­гласованности реакций был использован второй вариант статистичес­ких исследований, основанный на оценке данных чувствительности ПЦР и РПИФ с использованием "нормализованных" (парных) выбо­рок от тех же самых инфицированных домашних свиней и кабанов. В качестве статистического был использован МсNemar’s-тест из пакета программ MedCalc. Дополнительно в расчёты были включены резуль­таты параллельных тестирований ПЦР и РПИФ случайных выборок отстрелянных кабанов (табл. 3).

Таблица 3. Результаты сравнения различий чувствительности РПИФ и ПЦР при проверке парных выборок от домашних свиней и диких кабанов, инфицированных АЧС

Вид

Клинический статус:

Кол-во (гол.)

Парные частоты результатов

МсNemar’s тест:

ПЦР

РПИФ

"ПЦР+ РПИФ"

ПЦР/ РПИФ

различия

Домашние

павшие (вспышки АЧС)

а) 987

+

+

965

98,7%

98,3%/ 98,2%

0,1 (-0,5-0,7)% Р=1,0 нет

+

 

5

 

+

4

 

 

13

Кабаны

павшие (случаи АЧС)

б) 416

+

+

352

90,1%

88,7%/ 86,1%

2,64 (0,2-4,4)% Р=0,04 есть

+

 

17

 

+

6

 

 

41

не известен (отстрел в инфицированной АЧС зоне)

в) 201

+

+

136

79,1%

76,6%/ 70,1%

6,99 (1,6-10,5)% Р=0,01 есть

+

 

18

 

+

5

 

 

42

а)

 

ПЦР

 

 

+

-

РПИФ

+

965

4

969

 

-

5

13

18

 

 

970

17

987

Чувствительность:

ПЦР - 98, 3%

РПИФ - 98,2%

Каппа:0,7(0,6-0,9)

 

б)

 

ПЦР

 

 

+

-

РПИФ

+

352

6

358

 

-

17

41

58

 

 

369

47

416

Чувствительность:

ПЦР – 88,7%

РПИФ – 86,1%

Каппа:0,7(0,6-0,8)

 

в)

 

ПЦР

 

 

+

-

РПИФ

+

136

5

141

 

-

18

42

60

 

 

154

47

9201

Чувствительность:

ПЦР – 76,6%

РПИФ – 70,2%

Каппа:0,7(0,6-0,8)

Примечание:*данные таблиц 2×2 (а, б, в) использовали для введения в программу MedCalc для определения различий методов МсNemar’s-тестом.

При тестировании парных проб от павших от АЧС домашних свиней, отсутствие статистических различий между чувствительностью ПЦР и РПИФ [0,1 (-0,5-0,7)%] при Р=1,0 свидетельствует о реакциях, как равноценных (при этом, расчётный показатель чувствительности ПЦР, 98,3%, можно считать как более соответствующий показателю диагностической чувствительности реакции, так как при использова­нии парных проб нейтрализовался "конфаундинговый" эффект влия­ния эмпирического фактора непарного проекта выборки (см. выше). Отсутствие существенной прибавки в чувствительности при парал­лельном проекте выполнения "ПЦР+РПИФ" (98,7%) по сравнению с последовательным (то есть раздельным) тестированием единствен­ной ПЦР (98,3%) или РПИФ (98,2%) также подтверждает отсутствие различий в чувствительности реакций.

Но, используя данные, полученные при тестировании пар­ных выборок от павших кабанов, и особенно от отстрелянных, статис­тическая картина меняется. Так, МсNemar’s тестом были обнаружены значимые различия чувствительности между ПЦР и РПИФ[2,64 (0,2-4,4)% Р=0,04], которые были выражены существеннее при тестирова­нии парных проб от от стрелянных кабанов [6,99 (1,6-10,5)% Р=0,01]. Эти различия в чувствительности ПЦР и РПИФ могут, в этом случае, указывать на независимость реакций. Видимое снижение показате­лей чувствительности двух реакций, и ПЦР (76,6%) и РПИФ (70,2%), будет правильным интерпретировать как проценты обнаруженных ин­фицированных в популяции отстрелянных кабанов и использовать в качестве величины превалентности, но не расценивать как снижение диагностической чувствительности (биноминальный параметр). Для расчётов диагностической чувствительности в знаменателе исполь­зуют количество референс-положительных проб, как представлено в таблице 2.

Во всех случаях, сходная величина каппы (0,7) может свиде­тельствовать как о согласованности реакций, так и об их воспроизводи­мости.

При раннем подозрении на АЧС (например, при недавнем заносе вируса в стадо свиней) уровень распространения и заболевае­мость, как правило, очень низкие (предэпизоотическая стадия), поэтому в такой критический момент парадокс ситуации заключается в том, что, несмотря на признанную чрезвычайную важность раннего установле­ния диагноза АЧС, возникает проблема доверия ветеринарных властей (и, особенно, владельцев) к положительным результатам лабораторных исследований. Для определения вероятности положительных результатов ПЦР и РПИФ и наличия инфекции АЧС, для системы "ПЦР-РПИФ" опреде­ляли прогностические положительные и прогностические отрицательные показатели при параллельном выполнении, используя в расчётах данные истинной превалентности [1]. Результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4. Расчёты надёжности параллельной схемы выполнения системы "ПЦР-РПИФ" с учётом превалентности случаев АЧС в фермах раз­ного размера (расчёты пакета WinEpiscope 2.0, "MultipleTest")

Размер фермы(гол.)

Превалентность (%)

ППР(%)

ПОР (%)

11-100

53(41-65)

99,6(99,3-99,7)

99,9

101-1000

37(25-49)

99,2(98,5-99,5)

99,9

>1000

10(3-24)

95,7(86,0-98,4)

100

Примечание: * средние расчётные величины диагностической чувс­твительности и специфичности ПЦР (98,3°% и 99,7°%) и РПИФ (98,2°% и 99,8°%).

Из данных таблицы 4 видно, что при использовании парал­лельного проекта проведения лабораторных исследований системы "ПЦР-РПИФ" обнаружены высокие достоверности положительных и отрицательных результатов, подтверждающих инфекцию АЧС у поло­жительно реагирующих индивидуумов. К существенному отклоне­нию доверительного интервала ППР системы до 86,0% в случае под­тверждения вспышки АЧС в фермах более 1000 голов скорее имеет отношение ошибка определения величины превалентности случаев инфицирования свиней в станках ферм (очень широкий диапазон доверительного интервала). Поэтому, при первичных случаях инфи­цирования АЧС в крупных фермах и промышленных свинокомплек­сах, требования ветеринарных властей подтверждать положительный результат лабораторных исследований референс-методом, а именно биопробой, имеют основание, особенно, если в выборке для иссле­дований будет только одно животное. Двукратный пробег перепро­верки полевых положительных выборок в практических ветеринар­ных лабораториях [1] и ВНИИВВиМ [2] показал практически полное совпадение результатов ПЦР и РПИФ и отсутствие существенных проблем работы "системы", за исключением ошибок I-типа ("ложно-положительные" из-за технической части валидации). Безусловно, при тестировании проб от павших диких кабанов расчётные показатели диагностической чувствительности и ПЦР и РПИФ (табл. 2) хотя и не внушают оптимизма, но здесь ошибка знаменателя при расчётах, то есть "ошибка выборки" истинно инфицированных животных (ошибка II-типа) имеет больший эффект, чем аналитические характеристики реакций.

Заключение. Имея в виду высокую вирулентность вируса АЧС, вызывающего острое течение с летальным исходом даже при сложных проектах выборки, показана высокая точность и достовер­ность диагностической системы ПЦР- РПИФ при параллельном вы­полнением и весьма эффективной для подтверждения АЧС. При такой схеме выполнения лабораторных исследований фактор риска "про­пуска" инфекции, даже при разных уровнях превалентности, будет минимальным.

При использовании случайной выборки, для повышения вероятности обнаружения инфицированных АЧС кабанов, а в целом и эффективности контроля распространения болезни в неблагополуч­ных популяциях, признавая факт несовершенства диагностических тестов, будет необходимо, наряду с совершенствованием выборки, повышать чувствительность лабораторных исследований введением дополнительного теста(ов), что, конечно, приведёт к их усложнению и стоимости.

Список литературы:

  1. Белянин С.А. Динамика распространения и мониторинг эпизооти­ческого процесса африканской чумы свиней в РФ, автореф., канд.дис., Покров, 2013, с.27.
  2. Вишняков И.Ф., Митин Н.И., Карпов Г.М., Куриннов В.В., Яшин А.Т. Диагностика и дифференциальная диагностика африканской и классичес­кой чумы свиней // Ж.Ветеринария-1991-N° 4 - С.28-30.
  3. ГОСТ 28573-90 (СТ СЭВ 6539-88) Бакулов И.А., Вишняков И.Ф., Балабанов В.А., Куриннов В.В. и др.// Свиньи. Методы лабораторной диагности­ки африканской чумы свиней- Москва - 1990.
  4. Газаев И.Х., Елсукова А.А., Синдрякова И.П., Цыбанов С.Ж., Кол-басов Д.В. // Применение метода ПЦР в режиме реального времени для выяв­ления вируса африканской чумы свиней //- 7-я Международная научно-практи­ческая конф., "Молекулярная диагностика -2010", М.,с.83-85.
  5. Газаев И.Х. Совершенствование методов индикации генома ви­руса африканской чумы свиней в объектах ветеринарного надзора //автореф. канд.биол.наук, г.Покров, 2011 г.,с. 26.
  6. Копытов В.О., Цыбанова Л.Я., Селянинов Ю.О., Цыбанов С.Ж. // Идентификация вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции//- Генодиагностика инфекционных заболеваний: Сб. тезисов Всероссийской науч. конф.-М. 2002,-с.341-343.
  7. Куриннов В.В. Разработка и усовершенствование средств и мето­дов лабораторной диагностики африканской и классической чумы свиней//док. дис, г. Покров, 2000 г., с.360.
  8. Куриннов В.В., Черных О.; Миколайчук С. Вспышка африканской чумы в хозяйстве закрытого типа [Краснодарский край, ноябрь 2008 г.] //Жи­вотноводство России.- 2009.- N° 4. - С. 29-31.
  9. Куриннов В.В., Колбасов Д.В., Цыбанов С.Ж., Васильев А.П. и др. Африканская чума свиней - главная проблема для свиноводства России // Жизнь без опасностей, 2010,т IV,N°3, стр.82-87.
  10. Куриннов В.В., Колбасов Д.В., Цыбанов С.Ж. и др. //Диагностика и мониторинг при вспышках африканской чумы свиней в республиках Кавказа в 2007-2008 гг.//Ветеринария, - 2008, N°10.- стр.20-25.
  11. Цыбанов С.Ж., Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я. //Выявление вируса африканской чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)//Тезисы докл. Всерос. Науч—практ. Конф., Вирусные болезни животных,-Владимир,с.26.
  12. King D.P., Reid S.M., Hutchings G.H. идр.Development of TaqMan PCR assay with internal amplification control for the detection of africam swine fever virus//J. Virol. Methods.-2003,vol.107,N°1, р.53-61.
  13. S.Botija, and A.Ordas. Rapid diagnosis by identification of antibodies extracted from tissues using indirect immunofluorescence // Hog Cholera/Classical swine fever and African swine fever ,Luxembourg, 1977, c.658-659.
  14. Steiger Y.,Ackermann M., Mettraux C., Kihm U. Rapid and biologically safe diagnosis of African swine fever virus infection by using polymerase chain reaction. J.Clin.Microbiol. 1992, (30), р.1-8.
  15. Jose Manuel Sanchez-Vizcaino. African Swine Fever. В 9th Edition Diseases of Swine, Blackwell,2006,р.291-298.

Резюме. В статье представлены статистические параметры диа­гностической работы ПЦР и РПИФ, основанные на использовании сложного про­екта стратифицированной выборки тест-популяции первично инфицированных домашних свиней и диких кабанов от полевых случаев или вспышек африканс­кой чумы свиней (далее, АЧС). В результате непарных ПЦР-тестирований 1 220 домашних свиней (405 страт) положительными были 1 140 голов (93,4%), а из 519 голов диких кабанов (222 страт) - 471 (90,8%); из проверенных РПИФ 987 голов домашних свиней (364 страт) положительными были 969 голов (98,2%), а из 416 диких кабанов (178 страт) - 358 голов (86,1%). Обследование тех же самых страт при параллельных проверках парных выборок оценки МсNemar's теста не представили значимых различий между ПЦР - 98,3% и РПИФ - 98,2 % (р=1,0). Это свидетельствует о случайности ложно-отрицательных результатов ПЦР при непарном тестировании, то есть неуверенности, вызванной эффектом эмпирического фактора в проекте выборки. При исследовании парных проб от павших от АЧС кабанов были хотя и незначительные, но различия чувстви­тельности ПЦР и РПИФ - 2,64(0,18-4,4)%, (Р=0,01), которые статистически ещё более выражены при тестировании случайной выборки отстрелянных кабанов - 6,99 (1,6-10,5)% Р=0,01. ППР величины при параллельном выполнении систе­мы "ПЦР-РПИФ" были достоверно высокими для подтверждения инфекции АЧС, от 95,7 (86,0-98,4)% при превалентности 10 (3-24%) в крупных стадах до 99,2 (98,5-99,5) % и 99,6 (99,3-99,7)% - в средних и мелких (превалентность 37,0% и 53%, соответственно).

Практически, параллельная система "ПЦР-РПИФ" имеет хорошую достоверность и воспроизводимость для подтверждения клинических случаев АЧС в любых стадах (фермах) домашних свиней и кабанов, не требующая под­тверждения положительных результатов референс-методом.

Ключевые слова: африканская чума свиней, вспышка, лабора­торная диагностика, выборка, тесты, полимеразная цепная реакция, реакция прямой иммунофлуоресценции, параллельное тестирование, прогностические положительные результаты, прогностические отрицательные результаты.

Сведения об авторах:

Куриннов Виктор Васильевич, доктор ветеринарных наук, профес­сор, заведующий лабораторией диагностики ГНУ ВНИИВВиМ; 601120, Вла­димирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Васильев Александр Павлович, кандидат биологических наук, стар­ший научный сотрудник лаборатории диагностики ГНУ ВНИИВВиМ;601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Белянин С.А., кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник ла­боратории диагностики ГНУ ВНИИВВиМ; 601120, Владимирская область, Пету-шинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Стрижакова Ольга Михайловна, кандидат ветеринарных наук, ве­дущий научный сотрудник лаборатории диагностики ГНУ ВНИИВВиМ; 601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Ногина Ирина Викторовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории диагностики ГНУ ВНИИВВиМ; 601120, Вла­димирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Сидлик Марина Валерьевна, кандидат биологических наук, стар­ший научный сотрудник лаборатории диагностики ГНУ ВНИИВВиМ; 601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Газаев Исмаил Хизирович, кандидат биологических наук, заведую­щий лабораторией генодиагностики ГНУ ВНИИВВиМ; 601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv. petush.elcom.ru.

Цыбанов Содном Жамьянович, доктор биологических наук, заве­дующий лабораторией биофизики ГНУ ВНИИВВиМ; 601120, Владимирская область, Петушинский район, г. Покров; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv. petush.elcom.ru.

Миронова Людмила Павловна, доктор ветеринарных наук, про­фессор, директор Ростовской областной ветеринарной лаборатории; 344010, Ростовская область, г. Ростов-на-Дону, пер. Ахтарский, 4; 8(928)1171431; e-mail: brucella@aaanet.ru.

Аликова Галина Анатольевна, кандидат ветеринарных наук, руково­дитель Комитета ветеринарии Волгоградской области; 400005, г.Волгоград, ул. 13-й Гвардейской, д.13; 8(442) 30-98-04, 89178493433; vet@volganet.ru.

Джаилиди Георгий Анастасович, кандидат биологических наук, руко­водитель государственного управления ветеринарии Краснодарского края; г. Краснодар, ул. Рашпилевская, 36; 8(861)262-19-23; e-mail: dga@uv.krasnodar.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Черных Олег Юрье­вич, доктор ветеринарных наук, директор ГБУ КК "Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория"; 352380, Краснодарский край, г. Кропоткин, ул. Красноармейская, д. 303; 8 (86138) 6-23-14; e-mail: gukkvl50@kubanvet.ru.

UDC619:616.98:076

DIAGNOSTIC EVALUATION OF PCR AND RDIF USING SAMPLES FROM FIELD OUTBREAKS OF AFRICAN SWINE FEVER

Kurinnov V.V., Vasilev A.P., Belyanin S.A., Strizhakova O.M., Nogina I.V., Sidlik M.V., Gazaev I.Kh., Mironova L.P., Alikova G.A., Tsybanov S.Zh., Dzhailidi G.A., Chernykh O.Yu.

Summary. Statistical parameters of diagnostic polymerase chain reaction and direct immunofluorescence reaction based on the use of complex project stratified sample test population of primarily infected domestic pigs and wild boars from field cases or outbreaks of African swine fever are presented in the article. The results of PCR testing of unpaired and paired samples tests of parallel evaluation of MsNemar 's test did not provide significant differences between PCR and RDF. This indicates chance of false-negative results of PCR with unpaired testing, i.e. the uncertainty caused by the effect of an empirical factor in project selection. In the study of paired samples from dead pigs were from ASF albeit minor, but the differences of sensitivity of PCR and RDIF were 2.64 ( 0,18-4,4 )% (P = 0.01), which is statistically even more pronounced when testing of random samplies of hunted boars - 6.99 ( 1,6-10,5 )% (P = 0.01). PPR values in the parallel system "PCR RDIF" were significantly higher for the confirmation of the ASF, from 95,7 (86,0-98,4) 10 % in prevalence ( 3-24 % ) in large herds to 99.2 (98.5-99.5) and 99.6 % (99,3-99,7)% - in the medium and small (and 53 %, respectively). Almost parallel system PCR-RDIF has good reliability and reproducibility to confirm clinical cases of ASF in any herds in domestic pigs and wild boars without confirmation of positive results of the reference method.

Keywords: African swine fever outbreak, laboratory diagnostics, sample, tests, polymerase chain reaction, direct immunofluorescence reaction, parallel testing, predictive positive results, prognostic negative results.

References:

  1. Belyanin S.A. Dinamika rasprostraneniya i monitoring epizooticheskogo protsessa afrikanskoy chumy sviney v Rossiyskoy Federatsii [Dynamics of distribution and monitoring of the epizootic process of African swine fever in the Russian Federation]. - Pokrov, 2013. - p.27.
  2. Vishnyakov I.F., Mitin N.I., Karpov G.M., Kurinnov V.V., Yashin A.T. Diagnostika i differentsialnaya diagnostika afrikanskoy i klassicheskoy chumy sviney [Diagnosis and differential diagnosis of African and classical swine fever]. - Veterinariya. - Moscow, 1991 (4). -pp.28-30.
  3. Bakulov I.A., Vishnyakov I.F., Balabanov V.A., Kurinnov V.V. Svinyi. Metody laboratornoy diagnostiki afrikanskoy chumy sviney [Pigs. Methods of laboratory diagnosis of African swine pigs]. - Moscow, 1990.
  4. Gazaev I.Kh., Elsukova A.A., Sindryakova I.P., Tsybanov S.Zh., Kolbasov D.V. Primenenie metoda PTsR v rezhime realnogo vremeni dlya vyyavleniya virusa afrikanskoy chumy sviney [Application of PCR in real time to detect African swine fever virus]. - Molekulyarnaya diagnostika. - Moscow, 2010. - pp. 83-85.
  5. Gazayev I.Kh. Sovershenstvovanie metodov indikatsii genoma virusa afrikanskoy chumy sviney v obyektakh veterinarnogo nadzora [Improving methods of indication of genome of African swine fever virus in objects of veterinary surveillance]. - Pokrov, 2011. - p. 26.
  6. Kopytov V.O., Tsybanova L.Ya., Selyaninov Yu.O., Tsybanov S.Zh. Identifikatsiya virusa afrikanskoy chumy sviney s pomoshchyu polimeraznoy tsepnoy reaktsii [Identification of African swine fever virus by polymerase chain reaction]. - Genodiagnostika infektsionnykh zabolevaniy. - Moscow, 2002. - pp. 341-343.
  7. Kurinnov V.V. Razrabotka i usovershenstvovanie sredstv i metodov laboratornoy diagnostiki afrikanskoy i klassicheskoy chumy sviney [Development and improvement of means and methods of laboratory diagnosis of African and classical swine fever]. - Pokrov, 2000. - p.360.
  8. Kurinnov V., Chernykh O., Mikolaychuk S. Vspyshka afrikanskoy chumy v khozyaystve zakryto gotipa (Krasnodarsky kray, noyabr 2008) [African swine fever outbreak in closed type farm (Krasnodar region, November 2008)]. - Zhivotnovodstvo Rossii. -Moscow, 2009 (4). - pp. 29-31.
  9. Kurinnov V.V., Kolbasov D.V., Tsybanov S.Zh., Vasilev A.P. Afri-kanskaya chuma sviney - glavnaya problema dlya svinovodstva Rossii [African swine fever - major problem for pig breeding of Russia]. - 2010: 82-87.
  10. Kurinnov V.V., Kolbasov D.V., Tsybanov S.Zh. Diagnostika i monitoring pri vspyshkakh afrikanskoy chumy sviney v respublikakh Kavkaza v 2007-2008 [Diagnosis and monitoring of outbreaks of African swine fever in the Caucasian republics in 2007-2008]. - Veterinariya. - Moscow, 2008 (10). - pp. 20-25.
  11. Tsybanov S.Zh., Vishnyakov I.F., Tsybanova L.Ya. Vyyavlenie virusa afrikanskoy chumy sviney s pomoshchyu polimeraznoy tsepnoy reaktsii (PTSR) [Identification of African swine fever virus by polymerase chain reaction (PCR)]. -Virusnye bolezni zhivotnykh. - Vladimir. - p. 26.
  12. -15. Vide supra.

Author affiliation

Kurinnov Viktor V., D.Sc. in Veterinary Medicine, professor, Diagnostics laboratory manager of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Vasilyev Aleksander P., Ph.D. in Biology, senior scientific researcher of the Diagnostics laboratory of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21­25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Belyanin S.A., Ph.D. in Veterinary Medicine, scientific researcher of the Diagnostics laboratory of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Strizhakova Olga M., Ph.D. in Veterinary Medicine, leading scientific researcher of the Diagnostics laboratory of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Nogina Irina V.,Ph.D. in Biology, chief scientific researcher of the Diagnostics laboratory of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Sidlik Marina V., Ph.D. in Biology, chief scientific researcher of the Diagnostics laboratory of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Gazaev Ismail Kh., Ph.D. in Biology, Genodiagnostics laboratory manager of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Tsybanov Sodnom Zh.,D.Sc. in Biology, Biophysics laboratory manager of the National Research Institute for Veterinary Virology and Microbiology; Pokrov, Petushki area, Vladimir region, 601120; (49243) 6-21-25; e-mail: vniivvim@niiv.petush.elcom.ru.

Mironova Lyudmila P., D.Sc. in Veterinary Medicine, professor, Director of the Rostov regional veterinary laboratory; 4, Akhtarsky lane, Rostov-on-Don, Rostov region, 344010; 8 (928) 1171431; e-mail: brucella@aaanet.ru.

Alikova Galina A., Ph.D. in Veterinary Medicine, Head of the Veterinary Committee of Volgograd region; 13, Gvardeysky st., Volgograd, Volgograd region, 400005; 8 (442) 30-98-04, 8(917)8493433; e-mail: vet@volganet.ru.

Dzhailidi Georgy A., Ph. D. in Biology, Head of the State Veterinary Department of Krasnodar region; 36, Rashpilevskaya st., Krasnodar, 350000; phone: 8 (861) 262-19-23; e-mail: dga@uv.krasnodar.ru.

Responsible for correspondence with the editorial board: Chernykh Oleg Yu., D.Sc. in Veterinary Medicine, director of the Kropotkin territorial veterinary laboratory; 303, Krasnoarmeyskaya st., Kropotkin, 352380; phone: 8(86138) 6-23-14; e-mail: gukkvl50@kubanvet.ru.

 

 
 
2011 © Ветеринария Кубани Разработка сайта - Интернет-Имидж