К вопросу диагностики лейкоза крупного рогатого скота

УДК 619:616-006:98:578.828.11
DOI 10.33861/2071-8020-2023-2-9-11

Шевченко А.А., Кривонос Р.А., Яковенко П.П., Дмитрив Н.И. Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования «Кубанский государственный
аграрный университет имени И.Т. Трубилина», г. Краснодар
Черных О.Ю., ШевченкоЛ.В. Северо-Кавказский зональный научноисследовательский ветеринарный институт - филиал
Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный Ростовский
аграрный научный центр», г. Новочеркасск

Лейкоз крупного рогатого скота - вирусное инфекционное заболевание, проявляющееся скрытым хроническим течением, с формированием разрастаний и опухолей в лимфоидных и кроветворных органах, появлением необратимых патологических изменений.

Лейкоз крупного рогатого скота регистрируют в Российской Федерации и различных зарубежных странах. Так, зараженность вирусом лейкоза на фермах крупного рогатого скота в Соединенных Штатах Америки, Канаде и Японии составляет до 80%. Вместе с тем в тех странах, где полностью проводят работу по выполнению ветеринарных и санитарных правил при проведении профилактики и ликвидации лейкоза на фермах крупного рогатого скота, заболевание ликвидировали. По данным отечественных исследователей, в отдельных регионах Российской Федерации, Белоруссии и других странах ближнего зарубежья довольно часто выявляют вирус лейкоза на фермах крупного рогатого скота. В некоторых зарубежных странах из-за отсутствия достоверных сведений по лейкозу эпизоотическая ситуация по данной инфекции на животноводческих фермах остается неизвестной, так как некоторые из них не предоставляют достоверную информацию в Международное эпизоотическое бюро [1, 2, 5].

В ХХ веке лейкоз крупного рогатого скота регистрировали в 98% случаев в хозяйствах Республики Беларусь, до 80% - в России. Диагностика на это заболевание была основана на результатах гематологического исследования.

После инфицирования вирусом лейкоза у этих животных вырабатывается определенная защита и образуются специфические антитела к структурным белкам возбудителя, которые в течение всей жизни сохраняются в организме инфицированных. Поэтому для лабораторной диагностики лейкоза крупного рогатого скота чаще применяют методы серологических исследований, а именно реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД), и им-муноферментный анализ (ИФА).

При лабораторной диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота в ветеринарных лабораториях чаще используют при серологическом исследовании реакцию иммунодиффузии, что позволяет выявлять зараженных животных уже на первой стадии образования антител, а внедрение этого метода при оздоровлении животноводческих ферм крупного рогатого скота в различных хозяйствах разных групп возрастов животных (6, 12, 18 и 24 мес.) и последующего выделения РИД+ животных из этих групп, позволило в целом улучшить динамику по лейкозу.

На первоначальном этапе осуществления оздоровительных ветеринарно-санитарных мероприятий в стране каждый год выявляли и выводили из оборота путем убоя РИД+ животных на бойне более 45 000 зараженных вирусом лейкоза [3, 4, 6].

В Российской Федерации неблагополучными по лейкозу крупного рогатого скота хозяйствами считаются животноводческие фермы с зараженностью от 0,2% до 25%. С учетом этого возможна тенденция к широкому распространению заболевания лейкозной инфекции у крупного рогатого скота, которая может причинить скотоводству страны значительные убытки.

При ранней диагностике лейкоза крупного рогатого скота использование серологического метода (РИД) не всегда позволяет выявлять зараженных животных на ранних стадиях болезни (инкубационный период) при инфекционном процессе и в период образования антител.

Поэтому необходимо проводить исследования по совершенствованию лабораторной диагностики, ветеринарно-санитарных, профилактических мероприятий и оздоровлению животноводческих хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота. Имеются неопровержимые научные данные исследователей по опасности для человека вируса лейкоза - возможность инфицирования людей через животноводческие продукты, полученные от зараженного вирусом лейкозной инфекции крупного рогатого скота. На организм человека негативно могут влиять вредные метаболиты (триптофан и другие вредные вещества), которые могут накапливаться у инфицированных животных в молоке и мясе.

В лабораторных условиях вирус лейкоза выращивают в различных перевиваемых клеточных культуральных системах животных многих видов (свиней, овец, крыс, крупного рогатого скота, собак, обезьян, летучих мышей). В организме животных вирус лейкоза связывается с лимфоцитами и пожизненно находится в клетках инфицированного хозяина, связанный с геномом клетки в виде провируса, не проявляет вредного воздействия и не вызывает образования антител к вирусу. Такое состояние инфициро-ванности животных выявляют только с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) [7, 8, 9].

В инкубационном периоде у животных в течение от месяца до 6 лет вирус лейкозной инфекции выявляют в организме инфицированного крупного рогатого скота, в молозиве и молоке коров, в других различных истечениях, которые могут содержат лимфоциты. Чаще всего восприимчивые животные инфицируются вирусом лейкоза от больных животных. В связи с этим для инфицирования крупного рогатого скота достаточно незначительное остаточное количество крови (0,0005 см3) от заболевшего животного. В таком малом количестве может находиться 2 500 лимфоцитов, зараженных вирусом. Поэтому нахождение малого количества зараженных лимфоцитов, которое может остаться на различных используемых для манипуляций инструментах, является достаточным для инфицирования. Нарушение санитарных правил при выполнении различных манипуляций на животных (отбор крови, профилактические прививки, проведение татуировок, мечение, обрезка копыт, искусственное осеменение), инфицированных вирусом лейкоза, и здоровых животных служит риском для заражения для последних и распространения инфекции. При лейкозе крупного рогатого скота вирус может распространяться через доильные аппараты, используемые одновременно для инфицированных и здоровых коров, при попадании крови на кормушки, пол, при нарушении правил отбора крови, при ректальном обследовании. Заражение вирусом лейкоза здоровых животных может происходить при укусе членистоногих и кровососущих насекомых.

Поэтому в случае нахождения в стаде крупного рогатого скота хотя бы одного больного животного существует опасность инфицирования здорового поголовья вирусом лейкоза.

Одним из главных источников распространения возбудителя лейкоза на ферме и в хозяйстве являются инфицированные вирусом быки-производители, которых используют на ферме для покрытия самок, в связи с тем, что в сперме вирус сохраняется долго, и она является фактором передачи возбудителя заболевания. Вспышки лейкоза крупного рогатого скота наносят ущерб племенному скотоводству, служат угрозой для сохранения таких животных, ведения селекционной и племенной деятельности, обмена и продажи животных [10, 11, 12].

Поэтому необходимо проводить работу по совершенствованию лабораторных методов диагностики, разрабатывать новые способы профилактики и меры по ликвидации лейкозной инфекции в животноводческих хозяйствах, что позволит обеспечить эпизоотологическое благополучие и здоровье человека.

Материалы и методы исследований. Сравнительную эффективность лабораторных тестов при диагностике лейкоза крупного рогатого скота осуществляли в ГБУ КК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория». При серологическом исследовании предварительно отбирали стабилизированную кровь и сыворотки крови 100 проб от телят старше 12 месяцев, а также 128 проб крови от телят старше 20-дневного возраста из неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота ферм.

Для лабораторных исследований использовали методы диагностики: полимеразную цепную реакцию (ПЦР), реакция иммунодиффузии (РИД), конкурентный метод иммуноферментного анализа (ИФА).

Результаты исследований и их обсуждение. Опытные образцы проб сыворотки крови использовали при постановке реакции иммунодиффузии, из других сборных проб сыворотки крови брали общий пул 1:10 и в каждом конкретном случае применяли при тестировании в ПЦР и методом иммуноферментного анализа.

В результате установлено, что из 100 тестированных сывороточных проб крови в реакции ИФА выявляли 15 положительных, в ПЦР - 17, а в РИД - 12. Используемые методы лабораторной диагностики ПЦР и ИФА показали большую чувствительность. С помощью этих реакций можно обнаруживать инфицированных животных и выявлять показавших отрицательные результаты в реакции иммунодиффузии.

Затем проводили тестирование в РИД сборных проб крови, взятых от 10 животных с включением по одной пробе заведомо положительной пробы и 9 проб с отрицательным результатом.

В последующем вносили в каждые 10 лунок панели по одной пробе в заведомо известную положительную пробу крови, но взятой с различной оптической плотностью от зараженных животных в разный стадийный период заболевания лейкозом крупного рогатого скота. Также вносили сыворотки крови в качестве положительной пробы с первой по седьмую лунки панели, взятых от заведомо реагировавших положительно животных в исследованных реакции иммунодиффузии, в реакции ПЦР и ИФА.

Затем вносили пробы крови от животного в восьмую лунку, которая в конкурентном методе ИФА и РИД дали отрицательный результат с оптической плотностью 50, которая работала положительно в ПЦР.

В дальнейшем в девятую и десятую лунки вносили кровь от животного, давшего положительный результат реакции в конку рентном методе ИФА и в РИД, имевшем положительный результат при постановке полимеразной цепной реакции с оптической плотностью ниже 50 и выше 50.

Таким образом при исследовании сыворотки крови в реакции ИФА с заведомо внесенной положительной пробой эффективность составила 2,58-31,57%.

В результате уставлено, что при исследовании 128 проб сыворотки крови от телят в возрасте 20 дней, полученных из неблагополучных хозяйств, реагирующих положительно в РИД, в реакции ПЦР выявлено 14,8%.

Зараженный крупный рогатый скот остается в стаде до проведения следующего этапа исследования. Согласно действующим ветеринарно-санитарным правилам в благополучных по лейкозу фермах исследования проводят через 2 года, а в неблагополучных хозяйствах проводят исследования через 4 месяца. В результате может происходить заражение здоровых животных вирусом лейкоза и в дальнейшем привести к значительному распространению вируса среди восприимчивых животных. Согласно действующей «Инструкции по использованию набора для диагностических исследований методом ИФА» при исследовании составили объединенные средние пробы от 10 голов в одной лунке. В последние годы применяется иммуноферментный диагностический набор, в котором при тестировании объединенной одной пробы от 50 животных исследуют кровь или молоко. В результате это еще больше повышает возможность нахождения в благополучном стаде не обнаруженных зараженных животных.

Таким образом, для снижения степени распространения вируса лейкозной инфекции у крупного рогатого скота надо внедрять в диагностическую схему лабораторных исследований диагностику с помощью ПЦР. В результате это позволит обнаруживать животных-носителей провируса лейкоза крупного рогатого скота, а также молодняк в 5-месячном возрасте. Особенно важным будет применение диагностики с помощью ПЦР при массовом тестировании самцов-производителей, которые часто являются носителями провируса.

Заключение. При сравнительном исследовании ПЦР, РИД и ИФА при диагностике лейкоза крупного рогатого скота установлено, что ПЦР-диагностика является наиболее чувствительной и эффективной. Установлено, что низкая чувствительность ИФА не позволяет выявлять всех зараженных животных вирусом лейкоза крупного рогатого на ферме, в то время как ПЦР-диагности-ка выявляет животных-носителей провируса лейкоза в раннем возрасте.

Список литературы:

1. Белов, А. Д. О патогенезе лейкозов крупного рогатого скота / А. Д. Белов, Л. В. Рогожина, Г. В. Сноз // Ветеринария. - 1997. - Т. 2. - С. 16-20.

2. Возможности и ограничения использования ПЦР в диагностике и генотипировании вируса лейкоза крупного рогатого скота / В. А. Белявская [и др.] // Актуальные вопросы зоотехнической науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных: сборник трудов. - Ставрополь, 2003. - С. 275-278.

3. Галеев, Р. Ф. Диагностика и профилактика лейкоза КРС / Р. Ф. Галеев, А. А. Руденко, Ф. Р. Валиев // Практик. - 2003. - № 5/6. - С. 44-48.

4. Глазко, В. И. Современные направления использования ДНК-технологий / В. И. Глазко, Н. Н. Доманский, А. А. Созинов // Цитология и генетика. - 1998. - Т. 32, № 5. - С. 80-93.

5. Новые и возвращающиеся болезни животных // А. И. Ятусевич [и др.] // Витебск: ВГАВМ, 2016. - 400 с.

6. Опыт ускоренного оздоровления племенного хозяйства от лейкоза / А. Г. Берзяк [и др.] // Ветеринария. - № 12. - 1990. - С. 13-15.

7. Применение серологических методов и ПЦР для обнаружения вируса лейкоза крупного рогатого скота в образцах крови, молока и носовых истечений / Н.Т. Джапаралиев [и др.] // Достижения молодых ученых — в ветеринарную практику: материалы конференции молодых ученых / Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных. - Владимир : ОКНИИиМС, 2000. - С.127-131.

8. Русинович, А. А. Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота, меры борьбы и профилактики в Республике Беларусь: монография / А. А. Русинович. - Витебск: ВГАВМ, 2016. - 264 с.

9. Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота: социально-экономическая значимость, диагностика, профилактика и ликвидация болезни / В. Максимович, И. Субботина, Н. Бабахина, Л. Кашпар // Ветеринарное дело. - 2019. -№ 2. - С. 5-11.

10. Энзоотический лейкоз крупного рогатого скота: социально-экономическая значимость, диагностика, профилактика и ликвидация болезни / В. Максимович, И. Субботина, Н. Бабахина, Л. Кашпар // Ветеринарное дело. - 2019. - № 3. - С. 4-9. - Окончание.

11. Эпизоотологическая оценка методов прижизненной диагностики лейкоза КРС / М. И. Гулюкин [и др.] // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2000. - № 3. - С. 60-62.

12. Эпизоотология и инфекционные болезни: учебник для студентов и магистрантов учреждений высшего образования по специальности «Ветеринарная медицина» / В.В. Максимович [и др.], - 2 изд. переработанное и дополненное. - Минск: ИВЦ Минфина, 2017. - 824 с.

Резюме. Заболевание крупного рогатого скота лейкозом регистрируется в Российской Федерации и различных зарубежных странах. Для лабораторной диагностики данной вирусной инфекции крупного рогатого скота чаще применяют методы серологических исследований, а именно реакцию диффузионной преципитации, иначе называемую реакцией иммунодиффузии в геле агара, полимеразную цепную реакцию и конкурентный метод иммуноферментного анализа. В статье представлены результаты по применению полимеразной цепной реакции при лабораторной диагностике лейкоза крупного рогатого скота в сравнении с реакцией диффузионной преципитации и методом иммуноферментного анализа. Сравнительную эффективность лабораторных тестов при диагностике лейкоза крупного рогатого скота осуществляли на базе Кропоткинской краевой ветеринарной лаборатории. При серологическом исследовании предварительно отбирали стабилизированную кровь и сыворотки крови 100 проб от телят старше 12 месяцев, а также 128 проб крови от телят старше 20-дневного возраста из неблагополучных по лейкозу крупного рогатого скота ферм. При сравнении эффективности применения методов лабораторной диагностики установлено, что более чувствительным по обнаружению вируса лейкоза крупного рогатого скота методом в сравнении с РИД и ИФА является полимеразная цепная реакция. С помощью ПЦР можно выявлять с раннего возраста наличие провируса лейкоза крупного рогатого скота. Установлено, что низкая чувствительность ИФА не позволяет выявлять всех зараженных животных вирусом лейкозной инфекции крупного рогатого на ферме. Особенно важным будет применение диагностики с помощью ПЦР при массовом тестировании самцов-производителей, которые часто являются носителями провируса.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, лейкоз крупного рогатого скота, вирус лейкоза, провирус, вспышки, инфицирование, лабораторная диагностика, чувствительность метода, полимеразно-цепная реакция, реакция диффузионной преципитации, иммуноферментный анализ.

Сведения об авторах:

Шевченко Александр Алексеевич, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии, эпизоотологии и вирусологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

Кривонос Роман Анатольевич, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры паразитологии, ветсанэкспертизы и зоогигиены ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; e-mail: uv@krasnodar.ru.

Дмитрив Николай Иванович, аспирант ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13.

Черных Олег Юрьевич, доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346735, Ростовская область, п. Рассвет, ул. Институтская, 1.

Шевченко Людмила Васильевна, доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный Ростовский аграрный научный центр»; 346735, Ростовская область, п. Рассвет, ул. Институтская, 1.

Ответственный за переписку с редакцией: Яковенко Павел Павлович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры микробиологии, эпизоотологии и вирусологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-900-2360273; e-mail: pavel2912@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей