rus eng
Архив номеров / Номер 2, 2021 год Распечатать

Новое заболевание кроликов - RHDV2

УДК 619:616.988-002.151
DOI10.33861/2071-8020-2021-2-37-39

Семикрасова А.Н., Петрова И.В., Жилина К.В. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева»,
Московская обл., Раменский район, пос. Родники

Введение. Вирусная геморрагическая болезнь кроликов -высококонтагиозное заболевание диких и домашних кроликов. Вирус относится к семейству Caliciviridae, которое объединяет группу сходных по морфологическим и различным патогенным свойствам РНК-содержащих вирусов животных. Экономический ущерб от RHDV является следствием массовой внезапной гибели почти всего поголовья невакцинированных животных.

Вспышка RHDV впервые была зарегистрирована и описана в 1984 году в Китае. Вирус очень быстро распространился и периодически заболевание регистрировалось на всех континентах [2]. В России, благодаря разработке отечественных вакцинных препаратов и массовым профилактическим мероприятиям к 2000 году заболевание RHDV удалось в значительной степени ликвидировать.

До 2010 года все циркулирующие изоляты вируса относились к одному серотипу, хотя для РНК-содержащих вирусов характерны высокие темпы эволюционных изменений. В последние годы во Франции впервые обнаружили антигенно-генетически отличный вариант вируса, обозначив как его RHDV2. Данный тип вируса быстро распространился в других европейских странах (Италия, Испания, Германия). В 2015 году был выявлен в популяции диких кроликов Австралии. В 2016 году вспышку RHDV2 зарегистрировали в Канаде [4].

До октября 2018 года в России не отмечалось проявления вируса RHDV2. Но, поскольку географические барьеры не являются препятствием для распространения данного вируса, соседство с неблагополучными по данному заболеванию государствами, закупке племенных животных в европейских странах (например Франции), возможно, послужило причиной заноса вируса серотипа RHDV2.

Цель исследований состоит в идентификации вируса, вызывающего RHDV2, в изучении его вирулентности, патогенности, клинических и патологоанатомических проявлений болезни.

Материалы и методы исследований. Работа проведена в ФГБНУ НИИПЗК. За кроликами, находящимися в очаге вирусной геморрагической болезни 2 типа (RHDV2), вели клинико-физиологическое наблюдение путём ежедневного осмотра, обращая внимание на их поведение, поедаемость корма, состояние кожного, волосяного покрова и видимых слизистых оболочек. После падежа больных животных проводили полную некропсию с описанием патологии.

Проводили диагностические исследования изолята вируса геморрагической болезни кроликов. В работе использовали штаммы RHDV2Ch14 (Италия) вируса RHDV.

Выделение РНК из материала проводили с использованием коммерческого реагента «ExtractRNA» (ЗАО «Евроген», Россия), представляющего собой монофазный водный раствор фенола и гуанидинизотиоцианата. Для получения кДНК на матрице выделенной РНК использовали коммерческий набор реагентов «РЕВЕРТА-L» (ООО «Ин-терЛабСервис», Россия). Полученную кДНК использовали для постановки ПЦР, которую проводили в термоциклере «PTC-200 DNA Engine Cycler» (BIO-RAD, США) при режимах, представленных в таблице 1.

Таблица 1 Постановка ПЦР в термоциклере «PTC-200 DNA Engine Cycler»

Стадия ПЦР

Температура, оС

Время, мин.

Количество циклов

Предварительная денатурация

95

2

1

Денатурация

95

1/2

35

Отжиг праймеров

60

1/2

Синтез

72

1/2

Заключительный синтез

72

7

1

Хранение

4

20

1

Сбор реакционной смеси для полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили в объёме 25 мкл с использованием коммерческого набора реактивов «Encyclo Plus PCR kit» (ЗАО «Евроген», Россия). Для идентификации вируса RHDV были использованы следующие последовательности праймеров: F - 5'-ACT-ACT-AGC-GTG-GTC-ACC-ACC-3' и R - 5'-TTG-TTA-TAA-ACG-CTC-AGG-ACC-AAC-3', амплифицирующие фрагмент длиной 482 п.н. региона VP60 генома вируса. Продукт ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5%-агарозном геле в течение 1 часа при напряжении 120 V. В лунку геля наносили по 15 мкл продукта ПЦР. В качестве маркера молекулярных весов использовали 5 мкл M100 (ООО «Синтол», г. Москва). По окончании электрофореза гель просматривали на трансиллюминаторе «Vilber TCP-15.M» (VILBER LOURMAT, Франция) с длиной волны 312 нм.

Полученный по результатам электрофореза фрагмент длиной 482 п.н. для последующего секвенирования вырезали из геля и проводили его очистку на колонках с использованием набора «Cleanup Standard» (ЗАО «Евроген», Россия).

Секвенирование очищенного фрагмента проводили на генетическом анализаторе «3130 DNA Analyzer» (Applied Biosystems, США), с использованием набора реагентов «BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit» (Applied Biosystems, США) [1]. Полученные последовательности с прямого и обратного праймеров анализировали с помощью программы BioEdit версии 7.0.5.3.

Для установления генетической принадлежности штамма RHDV2Ch14 был проведён филогенетический анализ нуклеотидной последовательности, полученной в ходе данной работы, и последовательностей штаммов и изолятов вируса RHDV, взятых из международной базы данных GeneBank NCBI. Филогенетический анализ проводили в программе MEGA 6.0 методом ближайшего соседа с использованием модели максимального композитного правдоподобия. Bootstrap поддержка равнялась 500. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили с помощью алгоритма ClustalW.

Результаты исследований и их обсуждение. По результатам электрофореза получен фрагмент длиной 482 п.н. (рисунок 1).

Рис. 1. Результаты электрофоретического анализа продукта амплификации фрагмента региона VP60 генома вируса RHDV в 1,5%-агарозном геле: 1 - маркер молекулярных весов M100 (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 п.н.), 2 - штамм RHDV2Ch14 вируса RHDV, 3 - отрицательный контроль (стерильная вода, свободная от РНКаз и ДНКаз)

В результате проведённого анализа была установлена следующая нуклеотидная последовательность амплифицируемого фрагмента, представленная на рисунке 2.

Рис. 2. Нуклеотидная последовательность секвенированного фрагмента длиной 482 п.н. региона VP60 генома штамма RHDV2Ch14 вируса RHDV

Исследование сформированной дендрограммы (рисунок 3) показало, что представленный для комиссионных испытаний штамм RHDV2Ch14 вируса RHDV принадлежит к геногруппе RHDV2 (серотип 2).

Рис. 3. Дендрограмма, построенная методом объединения ближайших соседей, отражающая уровень нуклеотидных различий фрагмента длиной 482 п.н. региона VP60 генома разных штаммов и изолятов вируса RHDV (выделен анализируемый штамм RHDV2Ch14)

RHDV2 - высококонтагиозное заболевания, возбудитель которого очень стабилен в окружающей среде. В отличие от вирусной геморрагической болезни кроликов 1 типа, к RHDV2 восприимчивы не только кролики, но и зайцы. Крольчата заболевают уже в 3-недельном возрасте (при классической форме RHDV наиболее восприимчивы кролики старше 2-3 месяцев, массой 3-3,5 кг).

Источником возбудителя инфекции служат больные кролики. Пути заражения вирусом 2 типа такие же, как и при заражении вирусом 1 типа (респираторный и алиментарный). Вирус высококонтагиозен и устойчив в окружающей среде, благодаря этому он может распространяться с любым контаминированным субстратом.

Инкубационный период при RHDV2 3-9 дней. Из-за быстрой гибели (кролики умирают в течение 12-36 часов до 5 суток после начала лихорадки) типичные признаки, как при классической форме (кровотечение из носа, вагинальной области), присутствуют редко. Наблюдается одышка, потеря аппетита и повышение температуры тела, из-за которой кролик, нередко, сидит держа голову над поилкой. RHDV2 серьезно отличается агрессивностью. Смертность от RHDV2 варьирует от 30 до 100%. Порой, до самой гибели невозможно отличить здорового кролика от больного, смерть наступает очень быстро, внешне здоровый кролик может сделать несколько судорожных движений, издать писк и пасть.

Патологоанатомические изменения наиболее выражены в легких (рисунок 4), они отечные, кровенаполнены, неравномерно окрашены, серовато-розового цвета, при надавливании выделяется пенистый экссудат, в трахее также может находиться пенистый экссудат розового или желтоватого цвета. Могут наблюдаться кровянистые истечения из носа. Печень кровенаполнена, дряблой консистенции (рисунок 5). Почки увеличены в размере, с точечными кровоизлияниями, от светло-коричневого до вишневого цвета (рисунок 6). Сердце увеличено, стенки правого желудочка растянуты, истончены, дряблой консистенции (рисунок 7). Селезёнка увеличена в размере, кровенаполнена, темно-вишневого цвета (рисунок 8).

Рис. 4. Макроскопические изменения в легких при RHDV2

Рис. 5. Макроскопические изменения в печени при RHDV2

Рис. 6. Макроскопические изменения в почках при RHDV2

Рис. 7. Макроскопические изменения в сердце при <br>RHDV2
Рис. 7. Макроскопические изменения в сердце при
RHDV2
Рис. 8. Макроскопические изменения в селезёнке при <br>RHDV2
Рис. 8. Макроскопические изменения в селезёнке при
RHDV2

Диагноз на RHDV2 ставится только лабораторными методами.

RHDV2 необходимо дифференцировать от RHDV1, пастереллеза, эшерихиоза, эймериоза и отравлений.

Лечение не разработано.

Профилактика и меры борьбы. С января 2019 г. все лекарственные средства для ветеринарного применения, производства ФГБНУ ФИЦВиМ, используемые для профилактики RHDV (вакцины), содержат в своем составе инактивированные вирусы ГБК обоих типов, что обеспечивает защиту животных от всех известных типов вируса.

Вакцина от RHDV1 не защищает от 2 типа, но лабораторные исследования, на которые ссылается Комиссия по вакцинации в ветеринарной медицине при Институте им. Фридриха Лёффлера показали, что минимум двойная иммунизация обычной инактивированной моновакциной может предотвратить тяжелое течение болезни у большинства кроликов [3].

Заключение. Впервые на территории Российской Федерации идентифицирован новый вирус геморрагической болезни кроликов 2 типа, обладающий высокой контагиозностью, патогенностью и летальностью. Авторами изучены клинические признаки и патологоанатомические изменения у кроликов при RHDV2.

Список литературы:

  1. Методические указания по определению последовательности ДНК с помощью реакции секвенирования на генетических анализаторах Applied Biosystems 3130 и 3130xl при автоматизации пробоподготовки продуктов реакции секвенирования с использованием станции Freedom EVO-2 100Base// ФГБУ «ВНИИЗЖ». 2012.
  2. Шевченко А.А., Шевченко Л.В., Зеркалев Д.Ю., Шевкопляс В.Н., Черных О.Ю. Вирусная геморрагическая болезнь кроликов// Ветеринария Кубани. 2011. № 2. - С. 3-6.
  3. https://krolikdoma.com/2017/02/22/rhdv-2/.
  4. Jackie E. Mahar, Robyn N. Hall et al. Rabbit Hemorrhagic Disease Virus 2 (RHDV 2; Gl.2) is Replacing Endemic Strains of RHDV in the Australian Lands cape within 18 Months of its Arrival// J. Of Virology. V. 92. 2008.

Резюме. Вирусная геморрагическая болезнь кроликов - высококонтагиозное заболевание диких и домашних кроликов. В октябре 2018 года впервые на территории Российской Федерации зарегистрировано новое заболевание кроликов - вирусная геморрагическая болезнь кроликов 2 типа (RHDV2). В статье приведены данные о результатах лабораторного исследования нового вируса, изучения клинических и патологоанатомических проявлений данного заболевания. При проведении лабораторного исследования проб печени от павших кроликов, доставленных из очага заболевания, выявлен и идентифицирован антиген и геном RHDV2. Вирус выделен на восприимчивых животных и проведен его молекулярно-генетический анализ. Анализ нуклеотидных последовательностей гена VP 60 показал, что исследуемый изолят относится к подтипу RHDV2 (RHDV-b или согласно новой номенклатуре вариант Gl.2). Установлено, что к RHDV2 восприимчивы не только домашние и дикие кролики, но и зайцы. Крольчата заболевают начиная с 3-недельного возраста. Вирус крайне устойчив в окружающей среде, благодаря чему легко распространяется с любым контаминированным субстратом. Вирус обладает высокой контагиозностью и патогенностью, летальность достигает 100%. Из-за быстрой гибели кроликов клинические признаки развиваются редко, обычно с виду здоровые кролики делают несколько судорожных движений и, издав писк, погибают. При патологоанатомическом исследовании наблюдается отёк легких, скопление пенистого экссудата в трахеи, дряблость сердечной мышцы, увеличение размеров и кровенаполнение печени, почек и селезёнки. Вакцина от RHDV не защищает от RHDV2, но двойная иммунизация обычной инактивированной моновакциной может предотвратить тяжелое течение болезни у большинства кроликов.

Ключевые слова: кролик, вирусная геморрагическая болезнь кроликов, RHDV2, ПЦР, вирус, РНК, диагностика, клинические признаки, патологоанатомические изменения, контагиозность.

Сведения об авторах:

Петрова Ирина Владимировна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник ФГБНУ «Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева»; 140143, Московская обл., Раменский район, пос. Родники, ул. Трудовая, 6; тел.: 8-495-7442642; e-mail: niipzk@mail.ru.

Жилина Ксения Владимировна, младший научный сотрудник ФГБНУ «Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева»; 140143, Московская обл., Раменский район, пос. Родники, ул. Трудовая, 6; тел.: 8-495-7442642; e-mail: niipzk@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Семикрасова Алла Николаевна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник ФГБНУ «Научно-исследовательский институт пушного звероводства и кролиководства имени В.А. Афанасьева»; 140143, Московская обл., Раменский район, пос. Родники, ул. Трудовая, 6; тел.: 8-495-7442642; e-mail: niipzk@mail.ru.

 

 
   
2011 © Ветеринария Кубани Разработка сайта - Интернет-Имидж