ПЦР-детекция генетических маркеров антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделенных из молока больных маститом коров

УДК 619:577.18:579.252.55:591.146:636.055

Соколова О.В., Исакова М.Н., Безбородова Н.А., Ряпосова М.В. ФГБНУ «Уральский федеральный
аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук», г. Екатеринбург

Введение. Проблема резистентности возбудителей болезней животных и человека к антибактериальным препаратам г на сегодняшний день является общемировой [10]. В нашей стране она приобрела особую актуальность в связи с утверждением Стратегии предупреждения распространения антимикробной резистентности в Российской Федерации на период до 2030 года (Распоряжение Правительства РФ от 25 сентября 2017 г. № 2045-р).

В животноводстве антибиотики широко применяются для профилактики и лечения различных воспалительных заболеваний. Частое, необоснованное применение антибиотиков, приводит к формированию приобретенной резистентности, обусловленной мутациями в хромосомной ДНК, либо получением микробной клеткой мобильных генетических элементов (плазмид, интегронов) от других бактерий (горизонтальный перенос генов).

Несмотря на многочисленные имеющиеся данные по антибиотикорезистентности микроорганизмов, данная проблема остается актуальной.

Основу этиотропной терапии при многих воспалительных заболеваниях, составляют антимикробные препараты (АМП). В состав наиболее распространенных АМП, зарегистрированных в Российской Федерации в качестве средств профилактики и лечения воспалительных заболеваний животных, входят антибактериальные фармацевтические субстанции различных групп: р-лактамы - природные и полусинтетические пенициллины (ампициллин, амоксициллин, клок-сациллина бензатиновая соль, бензилпенициллин, кафциллин), це-фалоспорины (цефалексин, цефалониум), макролиды (эритромицин); аминогликозиды (гентамицин, неомицин, стрептомицин, фрамицетин, канамицин), тетрациклины (доксициклин).

Основным фактором, ограничивающим доступ бета-лактамных антибактериальных препаратов к мишени действия, являются бета-лактамазы, гидролизующие антибиотики.

Большинство исследований указывает на наличие резистентности к АМП у 25% S. aureus и более чем у 50% коагулазонегатив-ных стафилококков [1, 8, 12]. Резистентность стафилококка связана с наличием гена MecA, кодирующего белок ПСБ2а, который обладает низкой афинностью к р-лактамам [3]. Высокой способностью к приобретению генетического материала, кодирующего резистентность, обладают энтеробактерии, в том числе E.coli [4]. Резистентность бактерий семейства Enterobacteriaceae к защищенным пенициллинам и цефалоспоринам связана с наличием генов blaDHA и STX-M. Резистентность Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. к макролидам 1 поколения обусловлена наличием гена ErmB.

В настоящее время для идентификации микроорганизмов и определения чувствительности к АМП используют традиционные микробиологические методы и молекулярно-биологические методы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). В отличие от первых, метод ПЦР позволяет проводить идентификацию генетических детерминант резистентности микроорганизмов, в течение 4 часов. Он отличается высокой специфичностью и точностью, что исключает возможность получения ложных результатов. Метод ПЦР особенно эффективен при выявлении трудно культивируемых, некультивируемых, требующих сложной питательной среды и персистирующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях. Применение ПЦР-диагностики также эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, что особенно актуально при диагностике генетических мутаций у бактерий к АМП [2].

Цель работы - на основе детекции генетических маркеров изучить антибиотикорезистентность бактериальных патогенов, выделенных из секрета молочной железы коров при мастите.

Материалы и методы исследований. Работа выполнена в рамках Государственного задания ФАНО России по теме 0773-20180003 «Разработать научно-обоснованную программу защиты репродуктивного здоровья сельскохозяйственных животных» направления 160 Программы ФНИ государственных академий наук на 2013-2020 гг. «Молекулярно-биологические и нанобиотехнологические методы создания биопрепаратов нового поколения, технологии и способы их применения с целью борьбы с особо опасными инфекционными, паразитарными и незаразными болезнями животных». Исследования проведены в лаборатории патологии органов размножения и болезней молодняка и в лаборатории микробиологических и молекулярногенетических методов исследований ФГБНУ «УрФАНИЦ УрО РАН». Объект исследований - 75 проб секрета молочной железы коров, больных маститом, из 6 сельскохозяйственных организаций Свердловской области. Проведены молекулярно-генетические исследования биологического материала методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени на приборе Rotor Gene-3000 (Corbett Research, Австралия). Для определения в пробах ДНК бактериальных патогенов (Staphylococcus aureus, Streptacoccus agalactiae, E. coli, Staphylococcus spp.) применяли комплект реагентов тест-систем «ВЕТ-СКРИН. Стрептопол-В», «ВЕТСКРИН. Стафипол», «ВЕТСКРИН. Колипол», «ВЕТСКРИН. Стрептопол» ООО «ИДС» (Москва).

Для определения резистентности к АМП использовали наборы реагентов компании ООО «ИДС» (Москва): резистентность Staphylococcus aureus к цефалоспоринам 2 поколения (выявление гена MecA) - «Ветскрин. Резистентность к цефалоспоринам - 2»; резистентность бактерий семейства Enterobacteriaceae к защищенным пенициллинам и цефалоспоринам 3 и 4 поколения (выявление гена blaDHA) - «Ветскрин. Резистентность к защищенным пеницил-линам и цефалоспоринам»; резистентность Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. к макролидам 1 поколения (выявление гена ErmB) - «Резистентность к макролидам - 1»; резистентность бактерий семейства Enterobacteriaceae к цефалоспоринам 1 поколения и фтор-хинолонам (выявление гена STX-M) - «Ветскрин. Резистентность к цефалоспоринам-1».

Результаты исследований определяли на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии. Значение порогового цикла выставляли в соответствии с инструкциями по применению используемых в работе тест-систем.

Результаты исследований. Ранее проведенными микробиологическими исследованиями установлено, что при заболевании коров маститом микрофлора встречается как в монокультуре (27,3%), так и в ассоциации культур бактерий (55,6%), грибов и дрожжей (17,1%) [4]. Наиболее часто высеваются стрептококки, стафилококки, энтерококки [4, 6].

Проведенными нами молекулярно-генетическими исследованиями установлено, что доминирующими видами микроорганизмов являются Staphylococcus spp. (S. epidermidis, S. saprophyticum, S. haemolyticus) - 73,3%, S. aureus - 36,0%, E. coli - 32,0%. S. agalactiae был выделен только в составе микробных ассоциаций в 6,7% проб.

Частота встречаемости Staphylococcus spp. составила 25,3%, S. aureus - и E. coli в виде монокультур - 12,0% и 4,0% соответственно. Двухкомпонентные ассоциации были представлены следующими сочетаниями микроорганизмов: S. aureus, Staphylococcus spp. - 14,7%; Staphylococcus spp., E. ^li - 21,3%; S. аgalactiae, E.coli - 2,7%. В составе трехкомпонентных ассоциаций выделены S. aureus, Staphylococcus spp. *, E. coli - 8,0%; Staphylococcus spp.*, S. 15 аgalactiae, E. ^li - 2,7%. В 1,3 % образцов были выделены ассоциации из четырех компонентов - S. aureus, Staphylococcus spp.*, S. agalactiae, E. ^li (табл. 1).

Таблица 1 . Результаты выделения ДНК возбудителей в секрете молочной железы коров, больных маститом (n = 75)

Монокультуры и ассоциации микроорганизмов	%
Staphylococcus spp. *	25,3
E. coli	4,0
S. aureus	12,0
S. aureus, Staphylococcus spp.*	14,7
Staphylococcus spp. *,E. coli	21,3
S. agalactiae, E. coli	2,7
S. aureus, Staphylococcus spp. *, E. coli	8,0
Staphylococcus spp. *, S. agalactiae, E. coli,	2,7
S. aureus, Staphylococcus spp.*, S. agalactiae, E. coli	1,3

Идентификация генетических детерминант резистентности микроорганизмов к АМП показала, что ген CTX-M р - лактамаз, определяющий резистентность E. coli к цефалоспоринам 1-го поколения, присутствовал у 3,6 % образцов ДНК (табл. 2). Распространение генов СТХ-М S-лактамаз связывают в основном с активностью мобильных генетических элементов (ISEcpl), которые обеспечивают их перенос на различные плазмиды энтеробактерий. В связи с этим, эпидемиология СТХ-М S-лактамаз включает различные этапы от мобилизации и переноса отдельных генов до клонального распространения штаммов [6].

Присутствие ДНК blaDHA, определяющей резистентность E. coli к пенициллинам и цефалоспоринам 3 и 4 поколения, обнаружено в 34,6% образцов. В 3,6% образцов ДНК E. ooli присутствовало одновременно два гена мутации CTX-M и blaDHA.

Таблица 2. Выделение генов-маркеров антибиотикорезистентности в ДНК микроорга­низмов секрета молочной железы коров, больных маститом

Микроорганизмы	Антибактериальные препараты	Выявляемые гены	%
E. coli	Цефалоспорины	CTX-M	3,6
	Пенициллины Цефалоспорины	DHA	34,6
S. aureus	Пенициллины Цефалоспорины	MecA	10,6
Staphylococcus spp. Streptococcus spp.	Макролиды	ErmB	45,3

Ген MecA в наших исследованиях обнаружен в 10,6% ДНК S. aureus. Наличие на генной кассете гена MecA, который кодирует ПСБ2a’, обеспечивает устойчивость к высоким концентрациям р-лак-тамов [8], в частности к пенициллинам (метициллину и оксациллину) и цефалоспоринам.

Ген резистентности ErmB, определяющий резистентность Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. к макролидам 1-го поколения, обнаружен в 45,3% образцов ДНК.

Выводы. Проведенными молекулярно-генетическими исследованиями установлено, что основными возбудителями маститов в сельскохозяйственных организациях Свердловской области являются Staphylococcus spp. (S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus) - 73,3%, S. aureus - 36,0%, E. coli - 32,0%, как в виде монокультур, так и в ассоциации друг с другом. Установлена высокая степень распространения генов, определяющих антибиотикорезистентность бактериальных патогенов (Staphylococcus spp. и Streptococcus spp., S. aureus, E. тоП, S. agalactiae), выделенных из молока коров, больных маститом, к различным антибактериальным химиотерапевтическим средствам. В большей степени получили распространение: ген ErmB - в 43,5% исследованных образцов ДНК Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. и ген blaDHA - в в 34,6% образцов ДНК E. ^li. Данные гены-маркеры кодируют устойчивость микроорганизмов к макролидам 1-го поколения и бета-лактамным антибиотикам (пени-циллинам и цефалоспоринам 3 и 4 поколения). В меньшей степени распространены гены CTX-M (3,6% образцов ДНК E. ^li) и MecA (10,6% образцов ДНК S. aureus). Учитывая, что ген CTX-M кодирует устойчивость E. ^li к цефалоспоринам 1-го поколения, данные препараты можно отнести к препаратам первого выбора при проведении антибактериальной этиотропной терапии при маститах у коров.

Дальнейший мониторинг антимикробной резистентности с помощью ПЦР в режиме реального времени позволит спрогнозировать появление устойчивости к различным группам антимикробных препаратов, а также оценить распространение резистентных штаммов на локальном и региональном уровнях. Полученные данные должны учитываться при проведении антимикробной терапии и профилактики маститов у коров как в отдельных сельскохозяйственных организациях, так и в регионе в целом.

Список литературы:

1. Артемьева О.А. Антибиотикорезистентность штаммов Staphylococcus aureus, выделенных из молока высокопродуктивных коров / О.А. Артемьева, Д.А. Никонова, Е.Н. Котковская и др.// Сельскохозяйственная биология. - 2016. - №.6. - Том 51. - С. 867-874.
2. Афонюшкин, В.Н. Перспективы использования методов генодиагностики в ветеринарной практике / В.Н. Афонюшкин, Ю.Г. Юшков, B.C. Городов // БИО журнал для специалистов птицеводческих и животноводческих хозяйств.-2003.-№12.-С. 31-32.
3. Зайцев А.А. Стафилококки и ванкомицин: тенденции и противостояния /А.А. Зайцева, О.И. Карпов, С.В. Сидоренко // Антибиот. и химиотер. - 2003. - №6. - С.20-26.
4. Исакова М.Н. Микробиологический фон при воспалении молочной железы у высокопродуктивных коров / М.Н. Исакова, М.В. Ряпосова, Н.А. Безбородова // Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. - 2017. - №2. - С.63-67.
5. Кафтырева Л.А. Резистентность энтеробактерий к антимикробным препаратам выбора при лечении острых кишечных инфекций / Л.А. Кафтырева, С.А. Егорова, Е.А. Кожухова и др. // Казанский медицинский журнал. - 2009. - том 90. - №5. - С.699-704.
6. Конопельцев И.Г. Воспаление вымени у коров / И.Г Конопельцев, В.Н. Шультяев. - Киров, 2010. - 355 с.
7. Степанова М.Н. Мутационная изменчивость CTX-M р-лактамаз и формирование устойчивости к цефтазидиму у клинических и лабораторных штаммов Escherichia coli /Степанова М.Н.// Авторефферат диссертации канд. биол. наук. - Смоленск, 2011.
8. Шаркова В.А. Генетические маркеры патогенности и антибиотикорезистентности штаммов S. epidermidis и S.aureus, изолированных из различных биотопов / В.А. Шаркова, Е.Ф. Лайман // Инфекционные болезни, иммунология, иммунотерапия. - 2013. - №3. - С.28-31.
9. Burmanczuk A. Activity of beta-lactam antibiotics against certain microorganisms which cause mastitis in cows / Burmanczuk, Artur; Kowalski, Cezary; Rolinski, Zbigniew; и др.// JOURNAL OF VETERINARY RESEARCH. - 2016.
10. Chambers H. F. Penicillin-binding protein-mediated resistance in pneumococci and staphylococci // J Infect Dis. — 1999. — V. 179 Suppl 2. — P. S353-359.
11. Tacconelli Е. Surveillance for control of antimicrobial resistance /Evelina; Sifakis, Frangiscos; Harbarth, Stephan; и др.// LANCET INFECTIOUS DISEASES - 2018. - Том 18 - Выпуск 3 - С. E99-E106.
12. Xavier A. Phenotypic and genotypic characterization of Staphylococcus aureus isolates in milk from flocks diagnosed with subclinical mastitis / Xavier, A. R. E. O.; Almeida, A. C.; Souza, C. N. // GENETICS AND MOLECULAR RESEARCH. - 2017. - Том 16. - Выпуск 2. - Номер статьи: 16029709.

Резюме. В настоящей работе представлены результаты молекулярно-генетического мониторинга резистентности основных бактериальных патогенов, выделенных из секрета молочной железы коров при воспалении. Проведены исследования методом ПЦР в режиме реального времени. Выделенные микроорганизмы включали: Staphylococcus spp. (S. epidermidis, S. saprophyticus, S. haemolyticus) - 73,3%, S. aureus - 36,0%, E. coli - 32,0%, S. agalactiae - 6,7% от числа исследованных проб. Частота встречаемости Staphylococcus spp. составила 25,3%, S. aureus и E. coli в виде монокультур - 12,0% и 4,0%, соответственно. Ассоциации микроорганизмов включали: S. aureus, Staphylococcus spp. - 14,7%; E. coli, Staphylococcus spp.- 21,3%; E.coli, S. agalactiae- 2,7%; S. aureus, Staphylococcus spp. *, E. coli - 8,0%; Staphylococcus spp. *, E. coli, S. agalactiae - 2,7%; S. aureus, Staphylococcus spp.*, S. agalactiae, E. coli - 1,3 %. Ген CTX-M, определяющий резистентность Enterobacteriaceae к цефалоспоринам 1-го поколения, присутствовал в 3,6 % образцов с E.coli. Ген blaDHA, определяющий резистентность Enterobacteriace к пенициллинам и цефалоспоринам 3 и 4 поколения, присутствовал в 34,6% образцов с E.coli. В 3,6% проб с E. coli присутствовало одновременно два гена мутации CTX-M и blaDHA. Ген MecA, определяющий резистентность S. aureus к цефалоспоринам 2-го поколения, присутствовал в 10,6% образцов. Резистентность Staphylococcus spp. и Streptococcus spp. к макролидам 1-го поколения (ген ErmB) определена в 45,3% образцов. Проведенные исследования свидетельствуют о широком распространении некоторых генов антимикробной резистентности среди патогенов при субклиническом мастите у молочных коров, что следует учитывать при выборе средств антибактериальной терапии.

Ключевые слова: антибиотикорезистентность, микроорганизмы, генетические детерминанты, молоко, мастит, коровы, бактериальные патогены, молекулярно-генетические исследования.

Сведения об авторах:

Исакова Мария Николаевна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории патологии органов размножения и болезней молодняка ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»; 620142, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2572044; e-mail: tmarya105@yandex.ru.

Безбородова Наталья Александровна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории микробиологических и молекулярногенетических исследований ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научноисследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»; 620142, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2572044; e-mail: n-bezborodova@mail.ru.

Ряпосова Марина Витальевна, доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник лаборатории патологии органов размножения и болезней молодняка ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»; 620142, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2577871; e-mail: riaposova76@ mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Соколова Ольга Васильевна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, лаборатории патологии органов размножения и болезней молодняка ФГБНУ «Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр Уральского отделения Российской академии наук»; 620142, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-343-2511750; e-mail: nauka_sokolova@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей