Частота выявления бактерий семейства Pasteurellaceae и влияние сроков хранения их генетического материала на результаты ПЦР

УДК 619:579.843.95-078

Терентьева Т.Е., Глотова Т.И., Глотов А.Г. ФГБУН Сибирский федеральный научный центр
агробиотехнологий Российской академии наук, пос. Краснообск
Родин И.А, Кощаев А.Г. ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет
имени И. Т. Трубилина», г. Краснодар

Введение. В настоящее время в России возрастает удельный вес хозяйств, занимающихся производством молока. В некоторых из них в результате завоза высокопродуктивного скота молочных пород из других стран происходит сосредоточение большого числа животных на ограниченных территориях. В таких условиях часто регистрируют массовые респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота, протекающие по типу энзоотической бронхопневмонии, характеризующейся развитием респираторной патологии у телят молочных пород до 6-ти месяцев, выращенных в закрытых помещениях при интенсивном способе ведения животноводства [2, 3].

Пастереллы - грамотрицательные, факультативно анаэробные палочкообразные бактерии семейства Pasteurellaceae, являющиеся комменсальными обитателями поверхности слизистых оболочек верхнего респираторного тракта животных, способные вызывать вто-рич-ные инфекционные болезни [7, 8, 12, 13]. Семейство включает 6 родов, но наибольшую роль в патологии животных играют представители родов Mannheimia и Pasteurella, а именно виды: M. haemolytica А1 и P. multocida A и D серотипы [1, 7, 10, 11].

Актуальность проблемы пастереллезов в нашей стране в последние годы обусловлена интенсификацией животноводства, направленной на повышение молочной и мясной продуктивности коров, часто на фоне стрессов, вирусных инфекций и неудовлетворительных условий кормления и содержания [2, 3, 9].

Вопрос типизации выделенных культур бактерий семейства Pasteurellaceae все ещё остается открытым. Наиболее перспективными в данном направлении являются молекулярные методы, в том числе полимеразная цепная реакция (далее, ПЦР), с помощью которой можно выявлять определенные гены в пределах генома бактерий, обнаруживать и идентифицировать микроорганизмы непосредственно в пробах биологического материала, смешанных или чистых культурах [13].

В связи с этим, актуальностью обладают данные по определению влияния сроков хра-нения проб биоматериала от животных при различных температурах на пригодность к исследованию в ПЦР.

Ранее нами была разработана мультиплексная ПЦР для выявления и дифференциации Pasteurella multocida пяти капсульных групп и Mannheimia haemolytica А1 с праймерами на ген белка клеточной стенки kmt1, отвечающий за вирулентность бактерии для животных [3].

Учитывая то, что в процессе пассирования бактериальных культур на питательных средах и хранения при низких температурах теряется их вирулентность, целью работы явля-лось определения длительности функционирования этого гена в процессе пассирования и хранения выделенных нами культур при помощи разработанной ПЦР

Материалы и методы исследования. Работа проводилась с 2010 по 2016 годы в ла-боратории биотехнологии диагностического центра ФГБНУ СФНЦА РАН. Использовали референтные штаммы P. multocida №№: 1231, 681 и Т80, полученные из коллекции культур микроорганизмов ВИЭВ им. Я.Р. Коваленко (г. Москва), пробы биоматериала, отобранные не позднее 4-х часов после гибели или вынужденного убоя животных, не подвергавшихся лечению антибиотиками, а также - 67 культур бактерий, полученных нами в ходе диагностических исследований.

Выделение, видовую идентификацию, определение патогенности бактерий проводили согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике пастереллезов животных и птиц.

Пробы органов и тканей размером 1^1x1 см перед исследованием тщательно растирали в отдельных фарфоровых ступках со стерильным песком пестиком, добавляли 5-10 см3 стерильного физиологического раствора и тщательно перемешивали. Смесь переносили в пластиковые пробирки емкостью 1,5 см3, центрифугировали на низкоскоростной центрифуге при 10 тыс. об/мин в течение 5-ти минут. Для выделения ДНК использовали 0,1см3 осветленной надоса-дочной жидкости, полученной после центрифугирования. Полученные суспензии внутренних органов, а также выделенной ДНК, фасовали в пластиковые пробирки по 1 000 мкл, помещали на хранение при температуре минус 18°С.

Выделение ДНК проводили при помощи набора «Рибо-преп» (ООО «Интерлабсервис», г. Москва). Исследовали суспензии внутренних органов животных, выделенных культур бактерий, внутренних органов мышей после постановки биопробы и реизолированных культур. Выделенные ДНК хранили при температуре -18°С в пластиковых пробирках в течение 6-ти месяцев. Культуры бактерий выращивали на агаре Хоттингера с добавлением 10%-ной сыворотки крови лошади и хранили в пробирках при температуре +4°С. Пробы извлекали через каждые 30 дней и исследовали в ПЦР.

Результаты исследований. Нами была изучена частота выявления ДНК бактерий Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica различных генотипов в пробах биоматериала от больных животных разных половозрастных групп, с помощью мультиплексной ПЦР. Исследовали 72 пробы от телят до 1-го месяца, 128 - от телят в возрасте от 1-го до 6-ти месяцев и 60 - от нетелей, первотелок и коров с клиническими признаками бронхопневмонии из хозяйств трёх регионов Сибири.

Результаты исследований показали, что у больных животных на молочных комплексах в основном присутствуют два генотипа P multocida - A и D, а также M. haemolytica - А1. Геном P. multocida A чаще выявляли у телят до месяца (34,7%) и телят от 1-го до 6-ти месяцев (65,6%), а P. multocida D в 4,2 и 7% случаев, соответственно. У взрослых животных этот показатель составил 6,6 и 5%, соответственно. M. haemolytica выявляли в пробах биоматериала от 25% взрослых животных, 6,9% - от телят до месяца и 7% - от телят от 1-го до 6-ти месяцев, что свидетельствует об участии данных генотипов бактерий в этиологии респираторных болезней. В пробах от больных животных нам не удалось выявить ДНК бактерий P. multocida серотипов В, Е и F (табл. 1).

Таблица 1. Частота выявления ДНК различных генотипов бактерий семейства Pasteurellaceae от больных животных с помощью мультиплексной ПЦР, n=260

Поло­возрастная группа животных	Исследовано проб биоматериала	Выявлено положительных проб	Результаты генотипирования проб/% выявления
			P. multocida		M.haemolytica A1
			A	D
Телята до 1 месяца	72	33	25/34,7	3/4,2	5/6,9
Телята от 1 до 6 месяцев	128	102	84/65,6	9/7	9/7
Нетели, первотелки, коровы	60	22	4/6,6	3/5	15/25
Всего проб:	260	157	113/43,5	15/5,7	29/11,2

Наши результаты согласуются с данными зарубежных авторов, о том что P. multocida А наиболее часто выделяют при респираторных болезнях телят [10, 11].

Изучение частоты выявления геномов бактерий в различных органах больных животных показало, что P. multocida серотипа A присутствовала в 55,2 % проб легких, 37% бронхиальных лимфоузлов и иногда в селезенке (8,8%), что может быть связано с септической формой болезни. Геном P. multocida серотипа D выявляли в легких (7,5%) и лимфоузлах (5,5%). Геном M. haemolytica выявляли в легких - 14,3%, в 11,1% проб бронхиальных лимфатических узлов, с признаками острых респираторных болезней (табл. 2).

Таблица 2. Частота выявления различных генотипов бактерий сем. Pasteurellaceae во внутренних органах больных животных в ПЦР

Внутренние органы животных	Исследовано проб	Выявлено положительных проб/ % выявления
		P. multocida		M.haemolytica А1
		A	D
Легкие	161	89/55,2	12/7,5	23/14,3
Бронхиальные л/узлы	54	20/37	3/5,5	6/11,1
Селезенка	45	4/8,8
Всего проб:	260	113/43,5	15/5,7	29/11,2

Результаты исследований свидетельствуют о том, что мультиплексная ПЦР, позволяет эффективно выявлять геном бактерий P multocida и M. haemolytica в пробах биоматериала различного происхождения от больных и инфицированных животных.

Для определения длительности функционирования гена kmt1 в процессе пассирования и хранения выделенных нами культур исследовали методом ПЦР суспензии из органов и бактериальных культур, полученных от животных и мышей, и ДНК, выделенные из проб биоматериала от животных и мышей, хранящиеся при температуре -18°С в течение 6-ти месяцев (срок наблюдения).

Полученные результаты исследований свидетельствовали о том, что хранение суспензий из внутренних органов животных и выращенных колоний бактерий при указанном температурном режиме обеспечивает сохранность генетического материала в течение срока наблюдения.

Капсульный антиген присутствует только у высокопатогенных штаммов бактерий. Максимальное количество жизнеспособных бактерий, сохраняющих культурально-морфологические, биохимические свойства, капсулу, и обладающих наибольшей патогенно-стью, обнаруживают у 10-12-ти часовых агаровых культурах, что соответствует фазе логарифмического роста. Более длительное культивирование сопровождается снижением количества капсул и гибелью бактерий [10]. Типирование с помощью мультиплексной ПЦР 67-ми культур бактерии P. multocida, с изученными культурально-морфологическими, биохимическими и биологическими свойствами, прошедших не менее 3-4х пассажей на искусственных питательных средах и хранящихся при температуре +4°С, подтвердило их видовую принадлежность и наличие у них капсульного антигена.

Выводы:

1. По данным мультиплексной ПЦР преобладающим генотипом P. multocida, циркулирующим среди крупного рогатого скота на молочных комплексах Сибири, являлся генотип А, выявление которого в среднем составило 43,5%. Геном этого возбудителя присутствовал в пробах от больных телят до 1-го месяца (34,7%), телят в возрасте 1-6-ти месяцев (65,6%) и взрослых животных (6,6%). Генотип D выявляли в среднем в 5,7% исследованных проб. Два генотипа бактерии содержали 5,9% проб. M. haemolytica выявляли в среднем в 11,2% случаев. Наиболее восприимчивой категорией животных к этому возбудителю являются нетели и первотелки (25%), а также телята 1-6-ти месячного возраста (6,9-7%% положительных проб).

2. Установлено, что хранение суспензий из внутренних органов животных и выращенных колоний бактерий, а также выделенной из них ДНК при температуре -18°С обеспе-чивает сохранность генетического материала в течение 6-ти месяцев (срок наблюдения).

3. Хранение при температуре +4°С до 6-ти месяцев культур бактерии P. multocida, прошедших не менее 3-4-х пассажей на искусственных питательных средах, обеспечивает сохранность ее капсульного антигена.

Список литературы

1. Джупина С.И., Колосов А.А. Особенности течения пастереллеза у животных в Западной Сибири // Ветеринария. 1992. № 5. С. 37-40.
2. Глотова Т.И., Глотов А.Г., Терентьева Т.Е., Нефедченко А.В. Типирование культур бактерий Pasteurella multocida, выделенных от крупного рогатого скота, при помощи ПЦР. Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2013. №2. С. 88-92.
3. Глотов А.Г, Терентьева ТЕ., Нефедченко А.В., Глотова ТИ. и соавт. Гетерогенность пастерелл, выделенных от крупного рогатого скота на молочных комплексах. Ветеринария. 2014. № 12. С. 23-26.
4. Зуев Н.П., Хмыров А.В., Добрунов Р.А., Зуева Е.Н., Родин И.А. и соавт. Этиология, профилактика и лечение сельскохозяйственных животных и птицы при массовых болезнях молодняка с гастроэнтеральными и респираторными синдромами. Монография / ФГОУ ВПО Белгородский государственный аграрный университет имени В.Я.Горина. - Белгород. 2015. с.168
5. Кощаев А.Г, Усенко В.В., Лихоман А.В. Здоровье животных - основной фактор эффективности животноводства / Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2014. № 99. С. 201.
6. Масимов Н.А. Этиологическое и эпизоотологическое значение пастерелл при смешанных респираторных инфекциях крупного рогатого скота: авто-реф. дис д-ра. ветеринар. наук / Н.А. Масимов. М. 1998. 43 с.
7. Сидоров М.А., Геведзе В.И. Пастереллез животных // Ветеринария. - 1983. №. 10. С. 3-5.
8. Сидоров М.А. и соавт. Определитель зоопатогенных микроорганизмов/ Справочник. М.: Колос. 1995. С. 227-233.
9. Терентьева Т.Е., Глотова Т.И., Глотов А.Г, Донченко Н.А. Сравнительная эффективность различных методов диагностики болезней крупного рогатого скота, вызываемых бактерией Pasteurella multocida // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 2014. №2. С. 90-95.
10. Шегидевич Э.А. Роль пастерелл в респираторной патологии овец и крупного рогатого скота // Автореферат дисс...докт. ветеринар. наук - Москва. 1993. 42 с.
11. Dabo S.M., Taylor J.D., Confer A.W. Pasteurella multocida and bovine respiratory disease // Animal Health Research Reviews. 2008. V. 8(2). P. 129150.
12. Kuhnert Р., Christensen P., Kuhnert H. Pasteurellaceae: Biology, Genomics and Molecular Aspects // Horizon Scientific Press. 2008. 267 p.
13. Shivachandra S.B., Viswas K.N., Kumar A.A. A review of hemorrhagic septicemia in cattle and buffalo // Anim. Health Res. 2011. V. 12(1). P. 67-82.

Резюме. Представлены результаты изучения частоты выявления и дифференциации пяти генотипов (A, B, D, E и F) бактерии Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica A1 в различных органах у крупного рогатого скота при вспышках респираторных болезней на молочных комплексах Сибири при помощи мультиплексной ПЦР. Преобладающим генотипом Pasteurella multocida являлся генотип А, выявление которого в среднем составляло 43,5%. Генотип D выявляли в среднем в 5,7% исследованных проб, 5,9% проб содержали два генотипа бактерии. Не установлено циркуляции бактерий Pasteurella multocida генотипов В, Е и F среди обследованного поголовья. Mannheimia haemolytica выявляли в среднем в 11,2% случаев. Наиболее восприимчивой категорией животных к этим возбудителям являлись телята 1-6-ти месячного возраста, нетели при завозе и первотелки. Частота проявления болезней, вызванных этими бактериями, зависела от концентрации животных на единицу площади, уровня молочной продуктивности, наличия стрессов и вирусных инфекций. Результаты исследований свидетельствуют о том, что мультиплексная ПЦР, позволяет эффективно выявлять геном бактерий Pasteurella multocida и Mannheimia haemolytica в пробах биоматериала различного происхождения от больных и инфицированных животных. Установлено, что оптимальным режимом хранения суспензий из внутренних органов животных, выращенных колоний бактерий и выделенной из них ДНК бактерий семейства Pasteurellaceae является минус 18°С в течение 6-ти месяцев независимо от вида исследуемого материала. Типирование в ПЦР по гену kmt1 67-ми культур бактерии P. multocida, прошедших не менее 3-4-х пассажей на искусственных питательных средах и хранящихся при температуре +4оС, подтвердило сохранность ее капсульного антигена.

Ключевые слова: крупный рогатый скот, респираторные болезни, полимеразная цепная реакция, ДНК, Pasteurellaceae, Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, генотип, антиген, суспензия, культура.

Сведения об авторах:

Терентьева Татьяна Евгеньевна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии диагностического центра ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН); 630501, Новосибирская область, пос. Краснообск, а/я 463; тел.: 8-383-308-77-45; e-mail: tatjana177@mail.ru.

Глотова Татьяна Ивановна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией вирусологии ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН); 630501, Новосибирская область, пос. Краснообск, а/я 463; тел.: 8-383-308-77-45; e-mail: t-glotova@mail.ru

Родин Игорь Алексеевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры анатомии, ветеринарного акушерства и хирургии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-861-221-59-42; e-mail: d22003807@mail.ru.

Кощаев Андрей Георгиевич, доктор биологических наук, профессор, проректор по научной работе ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-861-221-56-37; e-mail: koshhaev.a@kubsau.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Глотов Александр Гаврилович, доктор ветеринарных наук, профессор, заведующий лабораторией биотехнологии диагностического центра ФГБУН Сибирский федеральный научный центр агробиотехнологий Российской академии наук (СФНЦА РАН); 630501, Новосибирская область, пос. Краснообск, а/я 463; тел.: 8-383-308-77-45; e-mail: glotov_vet@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей