Лабораторная диагностика инфекционных болезней крупного рогатого скота с использованием иммуноферментного анализа (лейкоз, ящур, бруцеллёз)

О. А. Верковский, доктор биологических наук,
заведующий отделом иммунологии НПО НАР ВАК

Теоретические и практические достижения ве­теринарной науки значительно расширили арсенал методов диагностики и средств специфической профилактики инфекционных болезней крупного рогатого скота. При этом развитие новых подходов к предупреждению инфекционных болезней и изу­чение механизмов иммунологической защиты жи­вотных неразрывно связаны с разработкой и внед­рением новых методов и технологий, основанных на современных представлениях об эффекторных механизмах иммунитета, среди которых главное место занимает взаимодействие анти ген-антитело.

Иммуноферментный анализ (ИФА) к настоя­щему времени прошел путь от новейшей научной разработки до рутинного метода в клинической диагностике. С его помощью можно проводить как массовое обследование стад, так и поставить окончательный диагноз у конкретного животного.

По сравнению с другими методами выявления антигенов и антител профессионально разработан­ные иммуноферментные тест-системы обладают следующими преимуществами:

• высокой чувствительностью, позволяющей выявлять концентрации белка в диапазоне нг/мл, и специфичностью;
• воспроизводимостью полученных резуль­татов;
• стабильностью при хранении всех необходи­мых реагентов (до года и более);
• простотой проведения реакции и возможнос­тью использования минимальных объемов иссле­дуемого материала;
• наличием инструментального (в качествен­ном и количественном варианте) учета реакции и возможностью автоматизации всех ее этапов.

При инструментальной оценке результат ИФА может быть качественным (позволяет судить о наличии или отсутствии специфических антител) и полуколичественным (позволяет получить ин­формацию об относительном содержании анти­тел в испытуемых пробах). Оба варианта являются приблизительными, однако они намного точнее методов определения титров антител в реакциях с визуальным учетом.

Вышеперечисленные преимущества определи­ли широкое применение ИФАво всех областях ла­бораторной диагностики, и в настоящее время, со­гласно стандартам МЭБ (Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2004, http:// www.oie.int/eng/normes/mmanual/A_00005.htm), ИФА, наряду с традиционными методами, является узаконенным методом диагностики лейкоза, ящура и бруцеллеза крупного рогатого скота.

Специалисты НПО НАРВАК в сотрудничестве с ведущими отечественными и зарубежными учены­ми внедрили в ветеринарную практику нашей стра­ны ИФА-наборы для диагностики лейкоза и ящура, проводят эксперименты по созданию ИФА-набора для диагностики бруцеллеза. Условия применения данных наборов - любые лаборатории, оснащен­ные стандартным оборудованием для ИФА. ИФА- диагностика лейкоза

"Набор для выявления антител к вирусу лей­коза крупного рогатого скота (ВЛКРС методом им-муноферментного анализа (ИфА)", выпускаемый в двух вариантах:

• И ФА-набор для проведения массовых скри-нинговых исследований - скринирующий тест;
• ИФА-набор (VeriTest) для подтверждения по­ложительных результатов - подтверждающий (кон­фирмационный или верификационный) тест.

Как и большинство зарубежных аналогов оба варианта ИФА предназначены для выявления анти­тел к поверхностному гликопротеину др51 ВЛКРС в сыворотке крови и молоке животных.

Использование подтверждающего ИфА-набо-ра VeriTest является очень важным моментом при диагностических исследованиях на лейкоз, пос­кольку одним из наиболее важных вопросов при проведении ИФА является вопрос о специфичности результатов. Так при применении только скриниру-ющего теста, некоторые пробы, взятые от животных с различной патологией, могут давать ложнополо-жительные результаты вследствие синтеза пере­крестно-реагирующих антител. Поэтому возмож­ное существование ложнопозитивных результатов ставит перед лабораторным работником задачу их разграничения с истинным выявлением антител к ВЛКРС. Для решения этой задачи и служит ИФА-на­бор VeriTest, который применяется для подтверж­дения положительных результатов скринирующего теста.

Таким образом, алгоритм серологического об­следования на лейкоз при совместном применении РИД и ИФА следующий.

1) Животные положительные в РИД считаются инфицированными, в ИФА не проверяются и под­лежат выбраковке.

2) Отрицательные результаты в РИД, должны быть перепроверены в ИФА и только после этого животные могут считаться серонегативными.

3) Первичное тестирование проб в ИФА про­водится в скринирующем тесте и при отсутствии положительной реакции выдается заключение об отсутствии серологических данных инфицирования ВЛКРС. При положительном результате теста проба подлежит исследованию в подтверждающем тесте. При отрицательном результате подтверждающего теста, проба считается серонегативной по ВЛКРС, положительный результат является основанием для окончательного подтверждения серологического диагноза на лейкоз.

Такая схема проведения диагностических ис­следование за два последних года с успехом апро­бирована в ряде ветеринарных лабораторий нашей страны и показан ее практический эффект.

Если имеется возможность, то вместо скрини­рующего ИФА-набора можно сразу же использо­вать ИФА-набор VeriTest и тем самым упростить алгоритм серологического обследования на лейкоз и сократить число необходимых анализов.

ИФА-диагностика ящура

"Набор для выявления антител к вирусу ящура ЗАВС иммуноферментным методом (ИФА)" пред­назначен для выявления постинфекционных анти­тел в сыворотке крови крупного рогатого скота.

Набор позволяет обнаружить антитела к неструктурному белку вируса ящура - ЗАВС (в систе­ме используется рекомбинантный белок MSP ЗАВС в качестве антигена), который отсутствует (или скрыт для распознавания клетками иммунной системы) в инактивированных вакцинных препаратах. Поэ­тому у здоровых или вакцинированных животных антител к ЗАВС белку нет (реакция отрицательная), а у экспериментально зараженных или спонтанно инфицированных животных (даже ранее вакцини­рованных), в организме которых присутствовал жи­вой вирус ящура - антитела данной специфичности есть (реакция положительная).

Данное заключение демонстрируют резуль­таты, полученные нами при испытании данного набора в профильной лаборатории ФГУ ВНИИЗЖ (табл.1). Для проверки были использованы сыво­ротки крови крупного рогатого скота, полученные от. а) животных, переболевших ящуром (в дина­мике с интервалом 3- 5 суток после заражения); б) от животных, вакцинированных против ящура; в) животных сначала вакцинированных против ящура, затем экспериментально зараженных вирулентным вирусом; г) от клинически здоровых неиммунных животных. Исследования проводили в сравнитель­ном аспекте с набором аналогичной направлен­ности и с параллельным определением активности испытуемых сывороток в реакции микронейтрали­зации и в стандартном варианте непрямого ЙфА, где в качестве антигена используются структурные белки вириона.

Таким образом, отличительной особеннос­тью ИФА-набора для выявления антител к анти­гену ЗАВС вируса ящура является его способность дифференцировать здоровых и вакцинированных животных от инфицированных и вирусоносите-лей, поэтому его использование незаменимо при проведении оздоровительных и мониторинговых мероприятий.

ИФА- диагностика бруцеллеза

В течение последних лет ряд зарубежных ком­паний выпускают ИФА-наборы, предназначенные для выявления антител к возбудителям бруцеллеза крупного рогатого скота, овец и коз (Brucella abortus и Brucella melitensis). В настоящее время в НПО про­водятся подобные исследования.

В лабораторных исследованиях обычно исполь­зуют два варианта ИФА: непрямой и конкурентный. Однако на практике наибольшей ценностью обла­дает конкурентный ИФА, отличительной особенностью которого является возможность дифферен­цировать животных инфицированных бруцеллами от животных, вакцинированных вакциной из штам­ма 19 (и возможно из штамма 82). Метод основан на конкурентном взаимодействии моноклональных антител к о-полисахариду S-LPS антигена В. abortus и сывороточных антител к бруцеллам с S-LPS анти­геном В. abortus. При отсутствии в исследуемой сы­воротке крови антител к В. abortus или В. melitensis, МкА связывается с иммобилизованным S-LPS анти­геном, формируя при этом комплекс антиген-анти­тело. Полученный иммунный комплекс выявляется после взаимодействия с антивидовым конъюгатом, фермент которого после добавления субстрата, вызывает разложение субстрат-индикаторного рас­твора и образование окрашенного продукта. Если исследуемая сыворотка содержит антитела к бру­целлам, то они конкурируют с МкА за связывание с сайтами антигена и препятствуют взаимодействию МкА с о-полисахаридом S-LPS антигена, в результа­те чего интенсивность окраски снижается.

Сыворотка крови животных, вакцинированных вакциной из штамма 19, содержит низкоаффинные антитела, которые не конкурируют с МкА за связы­вание с антигеном, что приводит к отрицательной реакции. Однако в ряде случаев через 6 месяцев после вакцинации животные могут реагировать по­ложительно.

Нами были проведены предварительные испы­тания двух тест-систем с использованием охаракте­ризованных в РА сывороток крови крупного рогато­го, полученных из ФГУ ВГНКИ (табл.2).

Проведенные исследования показали, что по чувствительности оба варианта ИФА превосходят РА, однако для подтверждения диагностической ценности конкурентного метода проводятся более расширенные испытания с хорошо охарактеризо­ванной панелью сывороток крови, полученных от больных и вакцинированных животных. Есть пред­положение, что данная тест-система может быть также использована в медицине для выявления антител к бруцеллам у инфицированных людей.

Таблица 1

Группа животных	Результаты в РН и стандартном ИФА *	Результаты в ЗАВС ИФА (НАРВАК)	Результаты в ЗАВС ИФА(Межд.Со)**
Неиммунные		-
Вакцинированные	+	-
Инфицированные	+	+	+
Вакцинированные, затем экс­периментально зараженные	+	+ 9/20 на 7-е сутки п.з.	+ 0/5 на 7-е сутки п.з.

Таблица 2

N° сывороток		Титр антител в РА	Результат в конкурентном ИФА		Титр антител в непрямом ИФА
			% ингибирования	Интерпретация результата
1.		-	17,4		-
2		-	13,8		-
3		-	14,4	-	-
4		-	18,4	-	-
5		-	72,7	+	1:800
6		1:50	75,9	+	1:1600
7		1:50	88,7	+	> 1:3200
8		-	73,1	Л.	Н/и
9		-	77,0	+	1:1600
10.		1:50	78,6	+	1:800
11.		1:50	81,2	+	1:100

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей