rus eng
Архив номеров / Номер 1, 2021 год Распечатать

Регенеративная медицина - будущее ветеринарии

УДК 619:615.038:324:611.018.26.013:616.36-002.1-2:616-001.5-6
DOI 10.33861/2071-8020-2021-1-33-36

Лаврик А.А., Али С.Г., Бубличенко И.С., Анненкова Г.В., Дресвянникова С.Г. ООО «НовиСтем», г. Москва

Введение. Регенеративная медицина представляет собой относительно молодую, но стремительно развивающуюся и многообещающую междисциплинарную отрасль медицины человека и ветеринарии. Методы регенеративной терапии направлены на процессы репаративной регенерации, обеспечивая при этом не только гистологическое, но и функциональное восстановление органов и тканей, что является существенным преимуществом по сравнению с традиционными схемами лечения [3, 21]. Главный принцип регенеративной медицины состоит в том, что во всех тканях и органах взрослого организма содержаться региональные стволовые клетки. Именно они ответственны за обновление клеточной популяции того органа или ткани, в котором находятся, а также первыми активируются и обеспечивают восстановление при повреждении. То есть при поступлении определенных стимулов, эти клетки активируются, выходят из своего депо, начинают делиться, дифференцироваться в клетки определенной ткани и впоследствии замещают их собой. Это уникальный механизм регенерации и обновления, который заложен в каждом организме.

Долгое время регенеративная медицина основывалась на применении различных типов стволовых клеток - эмбриональных, фетальных, постнатальных и тканеспецифических, но предпочтение всё-таки отдается мезенхимным стволовым клеткам (далее, МСК), которые в норме содержатся в тканях взрослого организма [3]. Огромный терапевтический потенциал МСК объясняется тремя основными механизмами действия [21]. Первый - это способность этих клеток к миграции в очаг повреждения посредством процесса, аналогичного процессу миграции лейкоцитов. Второй механизм - это способность к дифференцировке в другие типы клеток, которые локально приживаются и способствуют восстановлению функций путём частичной замены повреждённых тканей. Третий механизм - секреция биоактивных факторов, регулирующих как местные, так и системные физиологические процессы [21]. При этом современные данные показывают, что ключевым для эффектов МСК является именно третий механизм [3, 20, 21].

Таким образом, в настоящее время мы являемся свидетелями появления нового типа биологической регуляции, включающего связь между клетками через секретируемые ими вещества - секретом. Использование секретома в регенеративной терапии и реабилитации обеспечивает ряд преимуществ по сравнению с применением живых клеток [21]:

  • решение вопросов безопасности, связанных с трансплантацией популяций живых и пролиферирующих клеток, включая иммунную совместимость, онкогенность, образование эмболов и передачу инфекций;
  • для секретома может быть оценена безопасность, дозировка и эффективность аналогично обычным фармацевтическим препаратам;
  • хранение может осуществляться без применения потенциально токсичных криоконсервантов в течение длительного периода без потери активности продукта;
  • использование секретома МСК более экономично и более практично для применения в клинике, поскольку не требует инвазивных процедур;
  • возможно массовое производство с помощью специально созданных клеточных линий в контролируемых лабораторных условиях;
  • применение секретома обеспечивает существенное сокращение времени до начала лечения при острых состояниях;
  • кроме того, состав секретома, полученного для терапевтического применения, может корректироваться с целью достижения желаемых клеточно-специфических эффектов.

Многочисленные экспериментальные исследования демонстрируют, что лечение с применением секретома эффективно на многих животных моделях при различных заболеваниях. Это подтверждает, что возможности бесклеточных методов регенеративной медицины в области ветеринарии крайне широки как у сельскохозяйственных, так и у мелких домашних животных.

Источники секретома и метод его сбора. Для применения в регенеративной медицине были предложены различные популяции стволовых клеток [13]. Но все же первенство в этом вопросе принадлежит МСК, которые находятся в различных тканях взрослого организма. В настоящее время МСК выделяют из костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови, синовиальной жидкости, амниона, плаценты и даже из пульпы зубов. Легче всего получить эти клетки из жировой ткани.

Как обсуждалось выше, секретом МСК представляет собой ряд молекул, секретируемых клетками или сбрасываемых с их поверхности во внеклеточную среду. Поэтому для изготовления бесклеточных препаратов на основе секретома МСК осуществляют сбор кондиционной среды (conditioned medium), в которой культивировались эти клетки [1]. Процедура сбора кондиционной среды относительно проста и не является проблемой для организации промышленного производства. Этот процесс представляет собой накопление, концентрирование, фракционирование и очистку кондиционной среды с помощью стандартных биотехнологических методов. В общих чертах схема производства фармакологических препаратов, действующим веществом которых является секретом МСК, представлена на рисунке 1.

Рис. 1. Общая схема производства препаратов на основе секретома МСК

Состав и виды секретома мезенхимных стволовых клеток. Секретом МСК из разных видов тканей специфичен и изменяется в ответ на колебания физиологических или патологических состояний. Поэтому в зависимости от типа МСК и условий их культивирования состав сек-ретома можно варьировать за счет изменения спектра продуцируемых биоактивных молекул и трофических факторов [14]. Эти факторы включают, среди прочего, растворимые белки и пептиды, свободные нуклеиновые кислоты, биоактивные липиды и внеклеточные везикулы [11, 19].

Последние в свою очередь классифицируют, главным образом, в зависимости от их размера, плотности, поверхностных маркеров и происхождения на апоптотические тельца, микровезикулы и экзосомы. Экзосомы, как и пептидные фракции секретома, в последнее время стали предметами углубленных научных исследований, основанных на высокой способности их компонентов взаимодействовать с клетками-мишенями и избирательно изменять передачу клеточных сигналов. В биотехнологических центрах всего мира и ведущих био-фармацевтических компаниях исследуются принципы формирования экзосом, доклинические тестирования их эффективности, влияние на активность иммунных клеток, а также их роль в ремоделировании внеклеточного матрикса. Следует отметить, что оба этих процесса прямым образом связаны с восстановлением поврежденных тканей. Однако основные надежды ученых относительно экзосом связаны с возможностью их применения в качестве таргетной и/или иммуномодулирующей терапии при онкологических заболеваниях. В этом случае экзосомы могут выступать в роли «резервуара» для лекарственных препаратов, таких как цитостатики, факторы роста или опухолевые антигены [9, 18].

В свою очередь растворимая фракция секретома МСК включает ряд белково-пептидных молекул размером до 5 кДа [12], с которыми исследователи связывают противовоспалительные эффекты секрето-ма и его способность стимулировать анаболические процессы в тканях (табл. 1).

Таблица 1 Состав и виды секретома мезенхимных стволовых клеток

Состав секретома МСК

Внеклеточные везикулы (апоптотические тельца, экзосомы и микровезикулы)

Пептидная фракция (растворимые регуляторные белки и пептиды)

Компоненты внеклеточного матрикса

МикроРНК мРНК Фрагменты ДНК Регуляторные пептиды Цитокины Ферменты Липидные компоненты

Факторы роста (GF) Интерлейкины (IL) Факторы некроза опухоли (TNF) Интерфероны (IFN) Колониестимулирующие факторы (CSF) Хемокины Ферменты Пептидные гормоны

Коллагены Ламинин Эластин Фибронектин Факторы роста и др. компоненты в зависимости от источника клеток

Механизмы действия секретома. Результаты, полученные в большом количестве экспериментальных и клинических исследований на животных и у человека, показали, что секретом МСК проявляет терапевтические эффекты, аналогичные тем, которые наблюдаются после трансплантации мезенхимных стволовых клеток, что подробно описано ранее [14].

Недавние достижения в клеточной и молекулярной биологии позволили установить множество механизмов действия секретома, что обусловлено его многокомпонентным составом (рисунок 2) [1, 11, 14, 19]. Все они сводятся к одному набору эффектов - во-первых, под действием секретома происходит активация собственных региональных МСК, которые инициируют физиологический процесс регенерации; во-вторых эти препараты способствуют созданию благоприятного для регенерации микроокружения в поврежденных тканях, что в последствии выражается в снижении интенсивности апоптоза, улучшении трофики, подавлении воспаления и предотвращении развития фиброза [8].

Рис. 2. Обобщенная схема механизмов восстановления тканей при воздействии препаратов на основе секретома мезенхимных стволовых клеток (адаптировано из [18])

Характерно, что во время восстановления тканей компоненты секретома не работают самостоятельно, столь выраженный эффект наблюдается лишь при сочетанном функционировании всего спектра факторов растворимой пептидной фракции секретома или его внеклеточных везикул. И растворимая пептидная фракция секретома МСК, и изолированные внеклеточные везикулы способны стимулировать регенерацию тканей, подавлять избыточный иммунный ответ (цитокиновые бури), что особенно актуально при лечении вирусных инфекций, в частности COVID-19, а также индуцировать неоангиогенез в ишемизированных тканях и привлекать в зону повреждения макрофаги и эндотелиальные клетки [2, 16, 17]. Кроме того, было описано, что в исследованиях in vitro секретом МСК повышает скорость миграции и пролиферации различных типов клеток, влияет на дифференцировку клеток-предшественников и ремоделирование внеклеточного матрикса [2], что является одним из механизмов, обеспечивающих регенерацию и ключевые фазы формирования функциональной ткани вместо фиброзной.

Таким образом, на сегодняшний день установлено, что секрето-мы МСК оказывают иммунорегуляторные, ангиомодулирующие, ан-тиапоптотические эффекты, способны к стимуляции клеточной пролиферации и антигипоксическому действию, за счет чего лечение основывается на восстановлении за счет собственной иммунной функции организма. Важно отметить, что благодаря иммуномодулирующему и противовоспалительному эффектам стала возможной разработка терапевтических схем, не включающих антибиотики, что особенно актуально ввиду глобализации проблемы возникновения антибиотикорезистентной патогенной микрофлоры.

Практическое применение секретома мезенхимных стволовых клеток. На сегодняшний день уже не только исследования in vitro и in vivo, но и ветеринарная практика показывают, что на паракринную сигнализацию МСК положительно реагируют большинство типов клеток и тканей. В связи с этим спектр терапевтического применения секретомных препаратов очень обширный. В литературе приводятся множественные сравнительные данные относительно использования секретомных препаратов (растворимой белко-во-пептидной фракции, изолированных внеклеточных везикул и суммарных концентратов кондиционных сред) при различных заболеваниях опорно-двигательного аппарата, сердечно-сосудистой системы, нейродегенеративных поражениях, патологиях внутренних органов и травматических повреждениях [1, 21].

В частности, высокая эффективность секретома МСК была показана для улучшения заживления ран и повреждений мягких тканей различной этиологии [2, 4, 8]. При этом исследователи и клиницисты отмечают, что активируется именно регенеративное заживление функциональной тканью, а не механизмы восстановления, которые приводят к образованию рубцов. Уже благодаря только этому действию секретом мезенхимных стволовых клеток является высокоэффективной и перспективной фармакологической субстанцией, применять которую можно для лечения кожных ран, в послеоперационном периоде и в рамках регенеративной реабилитации [8, 15]. Это обеспечит лучшие клинические исходы по сравнению с традиционными схемами лечения, когда терапевтический компонент предшествует последующему периоду восстановления с применением физиотерапии и лечебной гимнастики [15].

Основными компонентами секретома, которые принимают участие в регенерации мягких тканей, являются регуляторные белково-пептидные вещества разных биологических классов, входящие в состав растворимой фракции секретома (табл. 2). И хотя поиск биоактивных веществ, связанных с регенеративными свойствами секретома, продолжается, нам кажется более разумным, что секретом следует рассматривать как единую биологически активную субстанцию, готовую к применению вместо того, чтобы пытаться найти одну единственную ответственную молекулу.

Таблица 2 Растворимые белково-пептидные факторы секретома мезенхимных стволовых клеток, связанные с заживлением мягких тканей (адаптировано из [8])

Факторы роста

PDGF, IGF-1, EGF, FGF, гранулоцитарно­колониестимулирующий фактор (G-CSF), GM-CSF, HGF, PGE2, TGF-es, VEGF, KGF

Воспалительные белки

IL-1, IL-8, IL-10, IL-11, фактор некроза опухоли a (TNF), фактор ингибирования лейкемии (LIF), IL-6, MCP-1, PGE2, IL-9, IL-13

Белки внеклеточного матрикса

MMP-1,MMP-2, MMP-3, MMP-7, TIMP-1, TIMP-2, ICAM, эластин, коллагены, декорин, ламинин

Ангиогенные факторы

VEGF, ANG-1, ANG-2, PDGF, MCP-1, TGF-в! FGF, EGF, CXCL5, MMPs, TGF-a

Ввиду выраженных противовоспалительных и регенеративных свойств секретомных препаратов одной из сфер их применения является также ортопедия и травматология. Положительные результаты секретомной терапии при лечении повреждений опорно-двигательного аппарата отмечаются как для лабораторных, так и для мелких домашних животных, служебных пород, крупного рогатого скота и лошадей. При этом регенеративные свойства секретома МСК проявляются посредством существенного ускорения гистологического и функционального восстановления костной, хрящевой и соединительной тканей, стимуляции ангиогенеза в зоне повреждения, улучшения трофики и нормализации биохимических маркеров, отражающих метаболический и биоэнергетический баланс [4, 6, 10, 12]. Среди костно-суставных патологий, поддающихся лечению секретомом МСК, - переломы, вывихи, остеоартроз, болезнь межпозвоночных дисков, травматические и аутоиммунные повреждения сухожильно-связочного аппарата и суставов.

Отдельно следует отметить исключительную эффективность препаратов, сконструированных на основе секретома МСК, в отношении инфекционных заболеваний у животных [5, 7]. Последние в основном имеют вирусную этиологию и провоцируются вирусами или смешанными инфекциями, при которых в патологический процесс вовлекается несколько вирусов и патогенные бактериальные агенты, осложняющие инфекционный процесс, что приводит к необходимости нежелательного применения антибиотиков в стандартных схемах лечения. В то же время сочетание всех вышеописанных свойств сек-ретома МСК открывает возможность создания принципиально новых схем профилактики и лечения инфекционных заболеваний с эпидемическим потенциалом у животных без применения антибиотиков, что особенно актуально для сельскохозяйственной отрасли.

Выводы и перспективы на будущее. Таким образом, как экспериментальные, так и клинические данные, представленные в профильной литературе, подтверждают, что секретом МСК является высокоэффективным и многообещающим терапевтическим инструментом для регенеративной реабилитации и лечения воспалительных, инфекционных, дегенеративных заболеваний и травматических повреждений. Важно отметить, что введение белково-пептидных растворимых фракций секретома МСК и его изолированных внеклеточных везикул воспроизводит эффекты трансплантации соответствующих мезенхимных стволовых клеток, исключая при этом общеизвестные риски терапии живыми клетками.

Механизм действия секретома связан с содержанием широкого спектра биоактивных веществ, в первую очередь - противовоспалительных, ростовых и антиапоптотических факторов, а также с активацией собственных региональных МСК организма, что способствует восстановлению за счет собственной иммунной функции организма и формированию в месте дефекта функционально полноценных тканей вместо соединительно-тканного рубцевания.

Ведущие мировые клиники, в том числе и отечественные, успешно применяют бесклеточные технологии регенеративной медицины не только в ветеринарии, но и испытывают секретом МСК в качестве универсального регенеративного препарата для лечения многих заболеваний у людей. На начало 2021 года на российском рынке представлены только две компании, которые производят ветеринарные препараты на основе секретома мезенхимных стволовых клеток: ООО «Т-Хелпер Клеточные Технологии» и ООО «НовиСтем». Первые представлены на рынке препаратами Репарин-Хелпер (выпускается в двух формах: в виде капель и спрея), которые получают из постоянной линии МСК крысы D-SCR05.

«НовиСтем» впервые в мире зарегистрировал 4 вида инъекционных ветеринарных препаратов, которые производятся из аллогенных (видоспецифичных) для каждого животного мезенхимных стволовых клеток [4, 5, 6, 7]: для лошадей - «Ультраселл-Хорс», для собак - «Уль-траселл-Дог» [4, 6], для кошек - «Ультраселл-Кэт» и для крупного рогатого скота - «БовиСтэм» [5, 7]. Если препараты линейки Ультраселл представлены в виде лиофилизированного продукта для курса из 5 инъекций и способствуют увеличению регенерации (до 50 %) в послеоперационный период у животных, восстановлению функциональных тканей без соединительнотканных перерождений (рубцов и спаек) после травм разной степени [4, 6], то препарат для крупного рогатого скота выпускается в жидкой форме и направлен, прежде всего, на стимуляцию центральных (костный мозг) и региональных пулов стромальных клеток, которые в свою очередь являются источником иммунитета. Так, БовиСтэм является эффективным средством моно- и комбинированного лечения таких заболеваний, как мастит, послеоперационных осложнений и прочих заболеваний, которые в современной медицине требуют использования антибиотиков [2, 4, 5, 6, 7].

Список литературы:

  1. Богачева Н.В., Колман М.Э. Кондиционная среда мезенхимальных стромальных клеток: новый класс терапевтических средств// Биохимия. 2019. 84 (11). С. 1701-1717.
  2. Ивановская М., Казеннова Е., Трифонова А. Терапевтические эффекты мезенхимальных стволовых клеток и секретируемых ими факторов при патологиях кожи// Современная ветеринарная медицина. 2018. № 3. С. 34-42.
  3. Калинина Н.И., Сысоева В.Ю., Рубина К.А., Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Мезенхимальные стволовые клетки в процессах роста и репарации тканей// Айа паЪигае. 2011. № 3 (4). С. 32-39.
  4. Лаврик А.А., Али С.Г., Москалев В.Б., Золотарева Д.А. Влияние низкомолекулярной фракции секретома мезенхимальных стволовых клеток на функциональное состояние печени// Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2020. № 6. С. 35-41.
  5. Лаврик А.А., Москалев В.Б., Али С.Г., Заремба А.В., Эльдаров Х.Д. Препарат БовиСтэм в профилактике послеродовых осложнений у коров и иммунодефицитов у телят// Ветеринария и кормление. 2020. № 2. С. 29-32.
  6. Лаврик А.А., Али С.Г., Москалев В.Б., Никольченко О.А., Леонтьева Ф.С., Ашукина Н.А. Регенеративные свойства пептидного препарата «УльтраСелл-Дог» при травмах коленного сустава (экспериментальное исследование)// Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2020. № 5. С. 6-19.
  7. Лаврик А.А., Москалев В.Б., Али С.Г., Заремба А.В., Эльдаров Х.Д. Сравнительная эффективность лечения послеродовых осложнений и восстановления репродуктивной функции коров// Ветеринария и кормление. 2020. № 3. С. 2527.
  8. Ahangar P., Mills S.J., Cowin A.J. Mesenchymal stem cell secretome as an emerging cell-free alternative for improving wound repair. Int J Mol Sci. 2020. 21(19). Р. 7038.
  9. Beer L., Mildner M., Ankersmit H.J. Cell secretome based drug substances in regenerative medicine: when regulatory affairs meet basic science. Ann Transl Med. 2017. 5 (7). Р. 170.
  10. Chen W., Sun Y., Gu X. [et al.]. Conditioned medium of mesenchymal stem cells delays osteoarthritis progression in a rat model by protecting subchondral bone, maintaining matrix homeostasis, and enhancing autophagy. J Tissue Eng Regen Med. 2019. 13 (9). Р. 1618-1628.
  11. Cunningham C.J., Wong R., Barrington J. [et al.]. Systemic conditioned medium treatment from interleukin-1 primed mesenchymal stem cells promotes recovery after stroke. Stem Cell Research & Therapy. 2020. 1 (11). Р. 32.
  12. D'Arrigo D., Roffi A., Cucchiarini M. [et al.]. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. J Clin Med. 2019. 8 (11). Р. 1867.
  13. El Moshy S., Radwan I.A., Rady D. [et al.]. Dental stem cell-derived secretome/ conditioned medium: the future for regenerative therapeutic applications. Stem Cells Int. 2020. 2020:7593402.
  14. Ferreira J.R., Teixeira G.Q., Santos S.G. [et al.]. Mesenchymal stromal cell secretome: influencing therapeutic potential by cellular pre-conditioning. Front Immunol. 2018. 9. Р. 2837.
  15. Glatt V., Evans C.H., Stoddart M.J. Regenerative rehabilitation: the role of mechanotransduction in orthopaedic regenerative medicine. J Orthop Res. 2019. 37(6). Р. 1263-1269.
  16. Harrell C.R., Fellabaum C., Jovicic N. [et al.]. Molecular mechanisms responsible for therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived secretome. Cells. 2019. 5 (8). Р. 467.
  17. Li J., Wang X., Li N. [et al.]. Feasibility of mesenchymal stem cell therapy for COVID-19: a mini review. Curr Gene Ther. 2020. 20 (4). Р. 285-288.
  18. Silva A.M., Teixeira J.H., Almeida M.I. [et al.]. Extracellular vesicles: immunomodulatory messengers in the context of tissue repair/ regeneration. Eur J Pharm Sci. 2017. 98. Р. 86-95.
  19. Teixeira F.G., Carvalho M.M., Sousa N. [et al.]. Mesenchymal stem cells secretome: a new paradigm for central nervous system regeneration? Cell Mol Life Sci. 2013. 20(70). Р. 3871-3882.
  20. Varderidou-Minasian S., Lorenowicz M.J. Mesenchymal stromal/ stem cell-derived extracellular vesicles in tissue repair: challenges and opportunities. Theranostics. 2020. 10 (13). Р. 5979-5997.
  21. Vizoso F.J., Eiro N., Cid S. [et al.]. Mesenchymal stem cell secretome: toward cell-free therapeutic strategies in regenerative medicine. Int J Mol Sci. 2017. 18(9). Р. 1852.

Резюме. В современной ветеринарии и клинической медицине трансплантация стволовых клеток, в особенности мезенхимных стволовых клеток, является широко распространенным методом лечения многих патологических состояний. Среди показаний к применению этого метода в ветеринарии - травматические повреждения и дегенеративные изменения тканей опорно-двигательного аппарата, ожоги, системные иммунные заболевания, гематологические нарушения, в том числе онкологического характера, послеоперационные состояния, инфекционные заболевания и многие другие. За последнее десятилетие подходы, основанные на клеточной терапии, начали усовершенствоваться и стремительно смещаться в сторону использования секретируемых клетками биологически активных продуктов - клеточного секретома. Существенными преимуществами секретомных препаратов по сравнению с трансплантацией МСК является их доступность, удобство хранения и транспортировки, возможность исключить иммунное отторжение, онкологические риски и необходимость применения антибиотикотерапии. Ввиду этого, в данной статье представлен обзор информации относительно современного состояния применения секретомной терапии при различных патологиях. Авторами обсуждаются ключевые вопросы, связанные с этой темой: каковы основные источники клеточного секретома, состав и методы его сбора, механизмы влияния секретома на регенерацию тканей, его терапевтический потенциал и перспективы дальнейших исследований в этой области. Представленная обобщенная информация способствует прояснению основных вопросов, которые в настоящее время существуют в области терапии на основе секретома, и, следовательно, может быть полезной для практического использования секретома в ветеринарной практике.

Ключевые слова: регенерация, регенеративная ветеринарная медицина, мезенхимные стволовые клетки, секретом стволовых клеток, биологически активные вещества, клеточная терапия, восстановление тканей, функциональное восстановление, иммуномодуляция, репарация.

Сведения об авторах:

Лаврик Алексей Анатольевич, генеральный директор ООО «НовиСтем»; 119192, г. Москва, ул. Мосфильмовская, 74 б, оф. 79; e-mail: lavrik@novistem.ru.

Бубличенко Игорь Сергеевич, ветеринарный врач ООО «НовиСтем»; 119192, г. Москва, ул. Мосфильмовская, 74 б, оф. 79; e-mail: bis@novistem.ru.

Анненкова Галина Васильевна, ветеринарный врач ООО «НовиСтем»; 119192, г. Москва, ул. Мосфильмовская, 74 б, оф. 79.

Дресвянникова Светлана Георгиевна, кандидат ветеринарных наук, научный консультант ООО «НовиСтем»; 119192, г. Москва, ул. Мосфильмовская, 74 б, оф. 79; e-mail: dsg@novistem.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Али Сабина Гульзаров-на, заместитель генерального директора ООО «НовиСтем»; 119192, г. Москва, ул. Мосфильмовская, 74 б, оф. 79; e-mail: ali.s@novistem.ru.

 

 
 
2011 © Ветеринария Кубани Разработка сайта - Интернет-Имидж