Метаболизм протеогликанов суставного хряща коленных суставов при дегенеративно-дистрофических изменениях у собак

УДК 363.7-092.9:616.72-007.17-008.8:612.398.12:612.015.31

Матвеева Е.Л., Спиркина Е.С., Гасанова А.Г. «ФГБУ РНЦ «ВТО» имени академика ГА. Илизарова» Минздрава России, г. Курган

Введение. Общеизвестным фактом является то, что в процессе развития дегенеративно-дистрофических изменений (ДДИ) суставов в суставном хряще нарушается динамическое равновесие между катаболическими и анаболическими процессами [6]. Исследование механизмов нарушения этого равновесия, обратимости этих изменений и путей восстановления утраченных функциональных возможностей является актуальной исследовательской задачей. Протеогликаны являются интегральным показателем гомеостаза внеклеточного матрикса соединительной ткани и в её молекулярной архитектонике являются основными элементами сложной упорядоченной структуры, определяющей функциональные потенции суставного хряща [2, 4].

Целью настоящей работы являлось изучение активности лизо-сомальных ферментов и количественное определение гликозамино-гликанов суставного хряща на модели дегенеративно-дистрофических изменений коленного сустава у собак.

Материалы и методы исследований. Материалом данного исследования являлся суставной хрящ от 20-ти беспородных собак: 10-ти интактных (ИК) и 10-ти с моделью дегенеративно-дистрофических поражений суставов. Собаки содержались в экспериментальном отделе ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. акад. Г. А. Илизарова» в соответствии с требованиями инструкции №12/313 Министерства здравоохранения Российской Федерации «Санитарные правила по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальных биологических клиник» от 06.01.1973 г. В опытной группе взрослым беспородным собакам производили стабильную фиксацию коленного сустава под углом, близким физиологическому (125о), устройством предложенной нами конструкции, состоящим из 3-х разъемных перфорированных развальцованных манжет из поливика, соединенных между собой стандартными деталями аппарата Илизарова (рисунок 1). Данное устройство обеспечивает стандартные условия иммобилизации и позволяет получить воспроизводимость результатов. Исследовали ткани коленного сустава оперированной и контралатеральной конечности. В контрольной группе брали аналогичные образцы тканей у интактных собак.

Рис. 1. Схема устройства для иммобилизации сустава

Образцы хрящевой ткани высушивали до постоянного веса и измельчали. Материал до использования хранили в закупоренных стеклянных флаконах при t = 4-6оС. Для определения содержания водного компонента в тканях сустава образцы суставного хряща высушивали до постоянной массы при +56°С в течение 3-х суток, а затем взвешивали на аналитических весах Tekator (LKB, Швеция). Суставной хрящ обрабатывали 0,1 М ацетатным буфером рН 5,5 в течение 24-х часов на магнитной мешалке. Для осаждения ГАГ слабосвязанных с матриксом, отбирали экстракт. Оставшуюся хрящевую ткань подвергали папаиновому протеолизу в присутствии фермента в 0,1 М ацетатном буфере рН 5,5 с 0,005М ЭДТА и 0,001М цистеина. Навеску папаина брали из расчёта 2-3 мг на 100 мг ткани. За 5 ч инкубации при 65°С в протеализате при визуальном наблюдении ткань разрушалась полностью, в частности, происходила деструкция ПГ до ГАГ.

По количеству сульфатов [1] и уроновых кислот, определяемых по методу Дише в модификации Биттера и Муир [7], судили о количественном содержании гликозаминогликанов (ГАГ), а также о соотношении в них сульфатированных и несульфатированных форм. Содержание белка в гомогенатах оценивали методом Лоури [9].

В тканях хряща исследовали общую активность 4 лизосомаль-ных ферментов: кислой фосфатазы (КФ 3.1.3.2), N-ацетилглюкозами-нидазы (гексозидазы) (КФ 3.2.1.30), гиалуронидазы (КФ 3.2.1.35/36) и катепсина Д (3.4.23.5). Для определения активности кислой фосфатазы в качестве субстрата использовали в-глицерофосфат (A.J. Barrett et al., 1971). Активность фермента выражали в мкг неорганического фосфора на мг белка. Концентрацию гексозидазы (КФ 3.2.1.30) определяли по методу Barrett (A.J. Barrett et al., 1971). Активность гиалуро-нидазы (КФ 3.2.1.35/36) по методу Hata [8]. Активность катепсина Д определяли в среде 0,1 М ацетатного буфера рН 3,8, содержащей в качестве субстрата 1% раствор гемоглобина [10].

Обработку полученных результатов проводили методом вариационной статистики, применяемой для малых выборок, с принятием доверительной вероятности р, равной 0,05. Для каждой группы исследования рассчитывали среднюю арифметическую, среднее квадратическое отношение, ошибку средней. Для оценки достоверности различий полученных результатов использовали непараметрический критерий Вилкоксона (непарный), различия считались статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследований и их обсуждение. В опытной серии экспериментальных животных отмечались макроскопические изменения в суставном хряще коленного сустава иммобилизованной конечности (ОК). У интактных собак хрящ гладкий, блестящий, плотный, желтоватого оттенка, имеет толщину около 1 мм, а при иммобилизации 42 дня суставной хрящ истончался, приобретал голубоватый оттенок, был неравномерной толщины, покрыт синими пятнами. В ряде случаев отмечалось единичное врастание кровеносных сосудов и эрозия мыщелков. В суставном хряще контралатеральной конечности (КК) эти изменения были выражены в меньшей степени. Хрящ КК имел голубоватую окраску, был истончен. Эти макроскопические изменения суставной поверхности являются следствием нарушения архитектони- 25 ки хряща и структуры основных его компонентов (табл. 1).

Результаты исследований, проведенных нами в суставном хряще экспериментальных животных, приведены в таблице 1.

Таблица 1. Содержание основных химических компонентов суставного хряща коленных суставов интактных (ИК) и опытных животных (ОК) и контрлатеральной конечности (КК)

Показатель	ИК	ОК	КК
% Н2О	65,3±1,1	52 7±2 4	59 7±2 5
УК мкг/мг экстракт протеолизат	3,08±0,37 25,35±3,9	1,17±0,23 8,62±1,31	1,29±0,31 13,66±2,73
% слабосвязанных ГАГ	13,37±2,56	11,82±1,13	11,00±2,21
Сульфаты мМ/ 100г с.тк.	30,15±3,1	24,50±3,2	27,87±3,25
Сульфаты/УК	2,06	5 02±0 33	419±0 72
КФ мкМ Pi/мг ч	0,2±0,0018	0 72±0 14	0 58±0 09
КатД мкМтир/ мг ч	0,27±0,028	0 68±0 12	0,36±0,08
N-АГА мкМп- НФ/мг ч	0,17±0,011	0,23±0,04	0,31±0,08
Гиа-за пМ N- АГА/мг ч	12,6±5,2	0,0	0,0

Примечание: подчеркнутые данные отличаются от таковых в группе интактных собак с уровнем достоверности p<0,05

Гидратированность суставного хряща обеспечивает его основное механическое свойство - резистентность к сжатию [3]. Данный показатель (% Н2О) уменьшался в хряще как ОК, так и КК (р<0,05). Он составлял 80,6% от нормы в хряще ИК и 91,5% от нормы в хряще КК.

Значительное уменьшение концентрации уроновых кислот (УК), отмечены в хряще ИК и КК. В хряще опытной конечности концентрация УК снижалась на 65%, а в КК - на 50%. Уменьшение содержания протеогликанов в тканях не сопровождалось изменением их агрегации, т.е. следовало предположить, что уменьшение содержания ПГ происходило за счет и агрегированных, и неагрегированных ПГ Это иллюстрируется снижением в равной мере УК как в экстракте, так и в протеолизате суставного хряща. Отношение сульфатов к уро-новым кислотам (S/УК) достоверно возрастало в хряще обеих конечностей собак данного эксперимента (2,06 - в норме; 5,02 - в ИК; 4,19 - в КК). Как показали наши исследования, при иммобилизации конечности в ткани хряща происходила активация ферментов лизо-сом. Увеличивалась активность кислой фосфатазы - маркера лизо-сом - более чем в 3 раза, столь же значительно возрастала активность катепсина Д. Активность гексозидазы не изменялась, а активность гиалуронидазы практически не определялась. Можно предположить, что лизосомальные ферменты, способные деградировать гиалуронат, хондроитинсульфат и кератансульфат, секретировались из лизосом хондроцитов во внеклеточный матрикс и оттуда попадали в синовиальную жидкость. В хряще контралатеральной конечности прослеживалась та же тенденция: увеличение активности ферментов лизосом - кислой фосфатазы (почти в 3 раза), гексозидазы (в 1,8 раза). Активность гиалуронидазы не определялась в гомогенате ткани хряща контрлатеральной конечности, так же как и в хряще опытной конечности. Изменения активности ферментов лизосом в контралатеральной конечности были сходны с таковыми в иммобилизованной конечности.

В литературе уже приводились данные, что белки и полисахаридные компоненты синовии имеют своим источником не только диализат крови (поступление ферментов через гемосиновиальный барьер) и покровные синовиальные клетки (продукты их секреторной деятельности), но и элементы деградирующего и разрушающегося суставного хряща [3, 5]. При развитии дегенеративно-дистрофических изменений суставов, активность лизосомальных ферментов определяет поступление метаболитов в синовиальную жидкость.

Заключение. Таким образом, полученные нами данные дают возможность оценить метаболические изменения в суставном хряще конечности собак, подвергшейся иммобилизации в течение 6-ти недель. Снижение синтеза протеогликанов хондроцитами и усиление их разрушения ферментами лизосом приводит к снижению их содержания в суставном хряще. Структурные изменения органической основы хрящевой ткани поддверждаются данными исследования биохимических маркеров соединительной ткани - гликозаминоглика-нов и активности гликозаминогликангидролаз. Снижение гидратиро-ванности суставного хряща и содержания гликозаминогликанов, возрастание активности лизосомальных ферментов и сульфатированных форм ГАГ являются характерными биохимическими признаками дегенеративно измененного суставного хряща. Вследствие перераспределения нагрузки и условий функционирования при иммобилизации, развитие метаболических нарушений происходят как в опытной, так и в контрлатеральной конечности, но в иммобилизованной конечности более углубленно.

Список литературы:

1. Десятниченко К.С. Выделение и биотестирование костных рострегу-лирующих факторов: метод. рекомендации / ВКНЦ «ВТО»; сост. : К. С. Десятниченко и др. - Курган, 1990. - 23 с.
2. Магомедов А.М. Особенности биохимических изменений суставного хряща в зависимости от формы прогрессирования идиопатического коксартроза / А.М. Магомедов, ГВ. Гайко, А.В. Калашников, Л.В. Полищук, Т.А. Кузуб // Укра'шський журнал мшчно! та лабораторно! медицини. - 2012. - Т. 7, № 2. - С. 118-121.
3. Павлова В.Н. Сустав: Морфология, клиника, диагностика, лечение / В.Н. Павлова, ГГ Павлов, Н А. Шостак, Л.И. Слуцкий. - М ООО «Издательство «Медицинское информационное агентство». 2011. - 552 с.
4. Русова Т.В. Особенности метаболизма протеогликанов из разных топографических зон коленного сустава у больных остеоартрозом: вариабельность фенотипа хондроцитов / Т.В. Русова, Е.Л. Строкова, А.А. Воропаева, Е.И. Щелкунова // Сибирский научный медицинский журнал. - 2013. - Т 33, № 5. - С. 78-86.
5. Хитров Н.А. Остеоартроз - болезнь с воспалительными и катаболи-ческими процессами в суставах / Н.А. Хитров // Трудный пациент. - 2012. - Т. 10. № 1. - С. 41-48.
6. Хитров Н.А. Остеоартроз / Н.А. Хитров // Медицинский совет. - 2011. - № 11-12. - С. 132-139.
7. Bitter, T A modified uronic acid carbazole reactions / T. Bitter, H. M. Muir // Anal. Biochem. - 1962. - Vol. 4, No 4. - Р. 330-334.
8. Hata R. A rapid and micro method for separation of acid glicosaminoglycans by two-dimensional electrophoresis / R. Hata, Y. Nagai // Anal. Biochem. - 1972. - Vol. 45, No 2. - Р. 462-468.
9. Protein measurement with the Folin phenol reagent / O. H. Lowry [et al.] // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193, No 1. - Р. 265-275.
10. Tissue proteinases / eds A. J. Barrett, J. T Dingle. - Amsterdam, 1971.

Резюме. На модели развития дегенеративно-дистрофических изменений суставов, полученной путем иммобилизации коленного сустава собак в течение 6-ти недель, были получены изменения, происходящие в обмене протеогликанов суставного хряща. Исследование механизмов нарушения этого равновесия, обратимости этих изменений и путей восстановления утраченных функциональных возможностей является актуальной исследовательской задачей. Протеогликаны являются интегральным показателем гомеостаза внеклеточного матрикса соединительной ткани и в ее молекулярной архитектонике являются основными элементами сложной упорядоченной структуры, определяющей функциональные потенции суставного хряща. Целью настоящего исследования являлось изучение активности лизосомальных ферментов и количественное определение гликозаминогликанов суставного хряща на модели дегенеративно-дистрофических изменений коленного сустава у собак. Материалом данного исследования являлся суставной хрящ от 20 беспородных собак: 10 интактных (ИК) и 10 с моделью дегенеративно-дистрофических поражений суставов. В опытной группе взрослым беспородным собакам производили стабильную фиксацию коленного сустава под углом, близким физиологическому (125о), устройством предложенной нами конструкции, состоящим из 3 разъемных перфорированных развальцованных манжет из поливика, соединенных между собой стандартными деталями аппарата Илизарова. Данное устройство обеспечивает стандартные условия иммобилизации и позволяет получить воспроизводимость результатов. Исследовали ткани коленного сустава оперированной и контралатеральной конечности. В контрольной группе брали аналогичные образцы тканей у интактных собак. Было обнаружено снижение содержания интерстициальной воды, количества уроновых кислот и увеличение активности гликоза-миногликангидролаз.

Ключевые слова: протеогликаны, суставной хрящ, дегенеративно-дистрофические изменения суставов, сульфаты, уроновые кислоты, активность гли-козаминогликангидролаз, гиалуронидаза, кислая фосфатаза, метаболические изменения, контрлатеральная конечность, синовиальная жидкость.

Сведения об авторах:

Матвеева Елена Леонидовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. ГА. Илизарова Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8-3522-450538; е-mail: matveevan@mail.ru.

Гасанова Анна Георгиевна, младший научный сотрудник лаборатории биохимии ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. ГА. Илизарова Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8-3522-450538; е-mail: gasanova08@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Спиркина Елена Сергеевна, младший научный сотрудник лаборатории микробиологии и иммунологии ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; е-mail: spirkina.82@mail.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей