Поиск маркеров лейкоза крупного рогатого скота на основе цитогенетических исследований

УДК 619:616.98

Донник И.М. ФГБОУ ВО "Уральский государственный аграрный университет", г. Екатеринбург
Трофимов О.В., Пак И.В. ФГБОУ ВО "Тюменский государственный университет", г. Тюмень

Лейкозы - гетерогенная группа злокачественных заболеваний крови, для которых характерна экспансия незрелых бластных клеток. Точные молекулярные механизмы возникновения и прогрессии лейкозов до сих пор не установлены. В злокачественных клетках с высокой частотой выявляются мутантные гены, в норме ответственные за пролиферацию и дифференцировку кроветворных клеток-предшественников [2]. В настоящее время во многих лабораториях мира ведутся работы, направленные на изучение свойств "лейкозных онкогенов" и их вклада в развитие лейкозов у человека и животных.

Первые случаи лейкоза крупного рогатого скота в нашей стране были официально зарегистрированы в 1965 году, и с этого времени идет неуклонный рост заболеваемости, а многочисленные попытки справиться с распространением заболевания в большинстве случаев оказались безуспешными. Это связано с целым рядом причин: широким распространением в сельскохозяйственных предприятиях и организациях разных форм собственности, отсутствием средств терапии и профилактики. Однако все причины экономического характера лишь усугубляют ситуацию, и устранение их не решит основной задачи - ограничения распространения данного заболевания. Добиться успехов в решении этой проблемы можно лишь благодаря созданию системы, включающей меры профилактики и лечения животных, которая может быть разработана только на основе знания механизмов передачи и развития заболевания, а также устойчивости животных к возбудителю лейкоза. В последние годы учеными достигнуты определенные успехи в изучении возбудителя болезни - вируса лейкоза крупного рогатого скота, расшифровке патогенетических особенностей проявления инфекции. Эти успехи, во многом, связаны с работами ученых США, Бельгии, Германии, Японии и России. Однако, несмотря на эти достижения, основная задача по выяснению механизмов развития лейкоза и создания универсальной методики дифференцированного определения лейкоза до сих пор не решена.

Целью настоящей работы явилось исследование изменений, характерных для лейкемической крови, которые существенны не только для понимания фундаментальных механизмов и закономерностей протекания заболевания, но и определения на этой основе целесообразности применения геномных и постгеномных технологий для поиска ранних маркеров заболевания.

Материалы и методы исследований. Научно-исследовательская работа проведена сотрудниками кафедры экологии и генетики на базе научно-образовательного центра молекулярной биологии и биотехнологии (НОЦ МБиБ) Тюменского государственного университета и кафедры инфекционной и незаразной патологии Уральского государственного аграрного университета. Исследованию были подвергнуты пробы крови от РИД-положительных (1 275 шт.) и контрольных РИД-отрицательных (169 шт.) коров чёрно-пестрой породы возраста (от 1 года до 1,5 лет) из сельскохозяйственных предприятий Урала.

Мазки крови животных готовили по стандартной методике [6]. После чего их окрашивали 2%-ным раствором Гимза. Выявление активности миелопероксидазы проводили по методу Вашбурна, модифицированному Лилли [5]. Приготовленные препараты рассматривали с использованием микроскопа "Axiostar" фирмы "Zeiss" при увеличении в 1000 раз.

Белки сыворотки крови животных анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (до-децилсульфата натрия) по методу Лэммли с использованием 5%-го концентрирующего и 12%-го разделяющего гелей [7]. Анализируемые препараты сыворотки предварительно разбавляли в 250 раз деионизованной водой. Электрофорез проводили в камере "Mini-Protean Tetra Cell" фирмы "Bio-Rad" при напряженности поля 15 В/см. Гели окрашивали серебром [8]. Статистическая обработка данных проводилась по стандартным методикам [1, 4].

Результаты и обсуждение. Предварительное исследование мазков крови, приготовленных с использованием материала от РИД-положительных (больных лейкозом) и РИД-отрицательных (контрольных) животных, выявило разнообразие лейкемоидных реакций, что, очевидно, является отражением наличия нескольких форм лейкоза.

В крови больных животных выявлены особенности, которые отсутствуют в контроле. У больных лейкозом коров отмечали высокую частоту скоплений бластных клеток (рисунок 1). Следует отметить, что скопления бластных клеток в мазках крови встречаются и у здоровых животных, как это отмечалось ранее [3], но с меньшей частотой.

Рис. 1. Скопления бластных клеток в крови больных лейкозом коров

У больных лейкозом животных изменялся качественный состав лимфоидных элементов: появлялись широкоцитоплазменные лимфоциты, двуядерные формы, тени Боткина-Гумпрехта (рисунок 2), которые отсутствовали у контрольных животных. Нередко появление измененных форм лимфоцитов сочеталось с акантоцитозом эритроцитов (рисунок 3).

Рис. 2. Измененные формы лимфоцитов в крови больных животных

Рис. 3. Акантоцитоз эритроцитов

Отмечено появление в лимфоцитах больных животных микроядер, которые являются следствием хромосомных аберраций (рисунок 4), что свидетельствует о нарушении стабильности генетического аппарата клеток больных животных.

Рис. 4. Микроядра в лимфоцитах больных животных

Методом ДСН-электрофореза было проанализировано 205 проб сыворотки крови от РИД-положительных коров и 55 проб от РИД-отри- цательных коров. В сыворотке крови крупного рогатого скота выявили от 12 до 18 отдельных белковых фракций, обладающих определенной электрофоретической подвижностью (табл. 1).

Таблица 1. Характеристика электрофоретических фракций

Группа белков	Число фракций	Относительная электрофоретическая подвижность
Альбумины	1	1,00
а-глобулины	2	0,92-0,87
Y-G-глобулины	1	0,82
у-А-глобулины	2	0,77-0,70
Гаптоглобины	2	0,65-0,60
Трансферрины	3	0,55-0,50
S-фракция	7	0,38-0,25

Стабильно выявили следующие группы: альбумины, а-глобу-лины, Y-G-глобулины, У-А-глобулины, гаптоглобины, трансферрины, S-фракция. У контрольных животных выявляется от 15 до 18 белковых фракций, соответствующих вышеперечисленным группам. У РИД-положительных животных выявляется меньшее количество фракций от 12 до 15 (рисунок 5). Анализ распределения разных белковых фенотипов (по числу белковых фракций) выявил значительные различия между двумя группами животных (рисунок 6). Различия затрагивают, в основном, минорные фракции в области глобулинов и гаптоглобинов. Очевидно, исчезновение минорных фракций глобулинов у больных лейкозом животных, является отражением нарушения функций иммунной системы, хотя не исключены и другие причины, вызывающие резкое изменение содержания в организме животных белков, участвующих в реакциях иммунитета, процессах свертывания крови, транспорте железа. Одной из таких возможных причин может быть нарушение деятельности регуляторных генов. Общее снижение концентрации глобулинов, вероятно, повлекло за собой и резкое уменьшение концентрации гаптоглобинов, что нашло отражение в отсутствии у некоторых особей соответствующих белковых фракций. С одной стороны, уменьшение содержания гаптоглобина, который с высокой аффинностью связывает гемоглобин, высвобождающийся из эритроцитов, и ингибирует его активность, является признаком анемии, при которой происходит разрушение эритроцитов внутри кровеносного русла с выделением гемоглобина в плазму и потере его. Косвенным подтверждением этого является отмеченный у некоторых больных животных акантоцитоз (рисунок 3), который является признаком анемии. С другой стороны, гаптоглобины относятся к белкам острой фазы, повышение уровня которых отмечается при патологических процессах, и связано со стимуляцией клеток интерлейкинами. На основе имеющихся данных сложно объяснить подобное противоречие, для выяснения этого требуются дополнительные исследования.

Рис. 5. Мажорные белковые фракции сыворотки крови коров. Электрофорез в 12% полиакриламидном геле. Окрашено серебром.

Рис. 6. Встречаемость особей с определенным количеством выявляемых белковых фракций в сыворотке крови

Таким образом, в ходе исследования были выявлены существенные изменения в белковом составе сыворотки крови животных, больных лейкозом. Эти изменения затрагивают преимущественно глобулины и гаптоглобины. Проведение одномерногого электрофореза позволило получить предварительные результаты, свидетельствующие о различии протеомов больных и здоровых животных, и показало, что перспективным направлением исследований является поиск маркеров лейкоза крупного рогатого скота в области минорных белковых фракций посредством проведения двумерного электрофореза.

Список литературы:

1. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. М.: Мир. 1988. Т.3. 335 с.
2. Баскаран Д, Спирин П.В., Прасолов В.С. Активированные лейкозные онкогены, определяющие злокачественное перерождение кроветворных клеток // Молекулярная биология. 2010. Т.44, №3. С. 418-430.
3. Герунова Л.К., Околелов В.И., Бойко Т.В. Гематотоксическое действие пестицидов на теплокровных животных // Сельскохозяйственная биология. 2003. № 4. С. 75-78.
4. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. 1980. 291 с.
5. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 1969. 624 с.
6. Роскин ГИ. Микроскопическая техника. М.: Советская наука, 1951. 447 с.
7. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.
8. Oakley B.R., Kirsch D.R., Morris N.R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1980. Vol. 105. P. 361-363.

Резюме. Лейкозы - гетерогенная группа злокачественных заболеваний крови, для которых характерна экспансия незрелых бластных клеток. Точные молекулярные механизмы возникновения и прогрессии лейкозов до сих пор не установлены. Авторами проведены исследования изменений, характерных для лейкемической крови, которые существенны не только для понимания фундаментальных механизмов и закономерностей протекания заболевания, но и определения на этой основе целесообразности применения геномных и постге-номных технологий для поиска ранних маркеров заболевания. На основе проведенных гематологических исследованиях коров, больных лейкозом крупного рогатого скота, выявлен ряд особенностей цитогенетического и протеомного характера. У больных лейкозом коров отмечается высокая частота скоплений бластных клеток, изменяется качественный состав лимфоидных элементов: появляются широкоцитоплазменные лимфоциты, двуядерные формы, тени Ботки-на-Гумпрехта. Нередко отмечается акантоцитоз эритроцитов. Также наблюдается появление в лимфоцитах больных животных микроядер. Отмечаются изменения белкового состава сыворотки крови. У больных животных снижается количество выявляемых белковых фракций сыворотки. Различия затрагивают, в основном, минорные фракции: глобулины и гаптоглобины. Проведение одномерногого электрофореза позволило получить предварительные результаты, свидетельствующие о различии протеомов больных и здоровых животных, и показало, что перспективным направлением исследований является поиск маркеров лейкоза крупного рогатого скота в области минорных белковых фракций посредством проведения двумерного электрофореза.

Ключевые слова: лейкоз крупного рогатого скота, кровь, сыворотка крови, мазок, цитогенетические исследования, маркеры лейкоза, протеомные изменения, бластные клетки, микроядро, белковые фракции.

Сведения об авторах:

Трофимов Олег Владимирович, ассистент кафедры экологии и генетики ФГБОУ ВО "Тюменский государственный университет"; 625003, г. Тюмень, ул. Семакова, 10; тел.: 8-906-875-35-43; e-mail: oleg_v_trofimov@mail.ru.

Пак Ирина Владимировна, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой экологии и генетики ФГБОУ ВО "Тюменский государственный университет"; 625003, г. Тюмень, ул. Семакова, 10; тел.: 8-(3452)-25-52-78; e-mail: pakiv57@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Донник Ирина Михайловна, доктор биологических наук, профессор, академик РАН, ректор ФГБОУ ВО "Уральский государственный аграрный университет"; 620075, Россия, Свердловская область, г. Екатеринбург, ул. Карла Либкнехта, 42; тел.: 8-(343)-371-33-63; e-mail: rector@urgau.ru.

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей