Оценка эффективности иммуноферментного метода диагностики трихинеллеза свиней

Верховский О.А., Цибезов В.В., Баландина М.В.
АНО "Научно-исследовательский институт диагностики и
профилактики болезней человека и животных", г. Москва
Шевкопляс В.Н. МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, г. Москва
Алипер Т.И. НПО "НАРВАК", г. Москва
Черных О.Ю. Кропоткинская краевая ветеринарная
лаборатория, г. Кропоткин

Трихинеллез - зоонозная болезнь, которой подвержены различные виды млекопитающих, птиц и амфибий, представляет значительную угрозу сельскохозяйственным животным, главным образом - свиньям и человеку. Трихинеллез относят к природно-очаговым заболеваниям, так как основными носителями и источниками трихинелл являются дикие животные (медведь, барсук, кабан). Свиньи заражаются трихинеллезом при поедании термически необработанных отбросов и остатков пищи, а также от крыс, зараженных трихинеллами. В свою очередь, продукты переработки свинины в стационарных очагах трихинеллеза являются источником заражения человека, синантропных и диких животных. Поэтому инвазия в таких очагах может поддерживаться длительное время [1]. Человек может заразиться трихинеллезом после употребления в пищу сырой, плохо проваренной или прожаренной свинины, в основном в тех местах, где нет надлежащего ветеринарно-санитарного контроля. У человека трихинеллез дает осложнения на дыхательные пути, центральную нервную и сердечно-сосудистую системы. При очень тяжелом течении развиваются иммунопатологические реакции, приводящие к диффузно-очаговому миокардиту, пневмонии, менингоэнцефалиту и в отдельных случаях к летальному исходу.

Возбудителем трихинеллеза свиней в подавляющем большинстве случаев является нематода Trichinella spiralis из семейства Trichinellidae, паразитирующая как у сельскохозяйственных (лошади, свиньи), так и у контактирующих с ними (собаки, крысы, кошки) животных. Половозрелая форма нематод локализуется в тонком отделе кишечника, личинка паразитирует у тех же животных в поперечно-полосатой мускулатуре. Помимо Trichinella spiralis к видам, имеющим наибольшее значение в Европе, относятся: Trichinella britovi, в основном паразитирующая у диких животных, Trichinella pseudospiralis, встречающаяся повсеместно, в том числе у птиц, и Trichinella native, встречающаяся чаще всего у плотоядных.

Диагностика трихинеллеза животных осуществляется по стандартам Всемирной организации здоровья животных (OIE) и "Методическим указаниям по лабораторной диагностике трихинеллеза животных", согласно которым послеубойную диагностику проводят с использованием микроскопического метода (прямое обнаружение личинок нематод в мышцах), прижизненную - методом иммуноферментного анализа (ИФА) [2, 14]. При этом ИФА, относящийся к непрямым методам диагностики, имеет большое значение для выявления специфических антител, вырабатываемых иммунной системой инфицированного животного или человека, и широко используется за рубежом для эпидемиологического мониторинга трихинеллеза и подтверждения благополучия стад, а также в национальных референтных лабораториях по трихинеллезу [4, 7, 8]. Чувствительность и специфичность метода достигает 95 - 100%, однако, наличие неспецифических реакций, наблюдаемое в 2-3% случаев, не позволяет OIE рекомендовать ИФА в качестве единственного метода исследования индивидуального животного (свиней, лошадей и др.) с целью подтверждения биологической безопасности мясной продукции [14]. В нашей стране, несмотря на утвержденные "Методические указания..." и наличие на ветеринарном рынке коммерчески доступных ИФА-наборов, метод практически не применяется.

Целью настоящей работы являлась оценка эффективности ИФА, предназначенного для выявления антител к трихинеллам в сыворотке крови и мясном соке свиней, с целью прижизненной диагностики трихинеллеза свиней.

Материалы и методы исследования. Исследования проводили на базе ГБУ КК "Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория" (г. Кропоткин, Краснодарский край) в течение 2009 - 2012 годов. В качестве испытуемого набора был использован "Набор для выявления антител к возбудителям трихинеллеза (Trichinella spp.) в сыворотке крови и мясном соке свиней иммунноферментным методом" - "Трихинелла-Серотест" (разработчики АНО "НИИ ДПБ", г. Москва, Россия и фирма PRIONICS, Швейцария). Данный набор изготовлен в формате непрямого твердофазного ИФА с использованием белкового комплекса антигенов E/S, абсорбированного в лунках микропанелей. В качестве испытуемого биологического материала были использованы пробы сыворотки крови и мясного сока, полученные от домашних и диких свиней из семи районов Краснодарского края. Постановку ИФА, учет и интерпретацию полученных результатов осуществляли по разработанной методике. Дифференциацию положительных и отрицательных проб проводили по коэффициенту позитивности, определяемому как процентное отношение оптической плотности при 450 нм (А450) испытуемой пробы к оптической плотности положительного контроля.

Все исследования методом ИФА, направленные на выявление антител, сопровождались послеубойной микроскопией по обнаружению личинок трихинелл в мясе.

Результаты и обсуждение. Известно, что специфичность ИФА напрямую связана с типом и количеством антигена трихинелл, используемого для адсорбции [14]. Американскими учеными в 1988 г. был разработан метод выделения экскреторно-секреторных антигенов (E/S) из личинок трихинелл в первые 24 часа после культивирования in vitro [5]. В более поздних работах было показано, что эти антигены представляют собой смесь иммуно-доминантных секреторных гли-копротеидов, и их следует получать из личинок T. spiralis в течение 18-20 ч после культивирования [9, 14]. Данный принцип получения и применения E/S антигена лежит в основе не только набора "Трихинелла-Серотест", но и большинства аналогичных тест-систем, в том числе и прототипного набора PrioCHECK Trichinella Ab (Prionics), обладающего 100%-ной специфичностью, 98%-ной чувствительностью и использующегося в Европе для подтверждения эпидемиологического благополучия стад по трихинеллезу. Показано, что с помощью данного набора можно выявлять антитела у животных при наличии одной личинки/100 г мышц, что соответствует рекомендациям OIE [4].

Диагностическая чувствительность и специфичность набора "Трихинелла-Серотест" была определена при исследовании цельной крови и сывороток крови клинически здоровых и инфицированных свиней, а также подозрительных по заболеванию животных. После убоя туши всех тестированных в ИФА животных микроскопически исследовали на наличие личинок трихинелл в мясе, после чего сопоставляли полученные результаты двух методов (табл. 1).

Таблица 1. Сравнительные результаты ИФА и микроскопического метода при диагностических исследованиях домашних свиней на трихинеллез (n=347)

N°	Биологический материал для ИФА	N	Результаты исследования на трихинеллез
			ИФА	Микроскопический метод
1	Кровь от здоровых свиней	100	-	-
2	Сыворотка крови от здоровых свиней	220	-	-
3	Сыворотка крови от больных трихи­неллезом свиней	7	+	+
4	Сыворотка крови от свиней с подозрением на трихинеллез	3	+	+
		17	-	-

Анализ полученных результатов показал, что все пробы крови и сыворотки крови от незараженных свиней (n=320 или 92% от всех обследованных животных) были отрицательны в ИФА, при последующем послеубойном микроскопическом исследовании туш этих животных личинки трихинелл не были обнаружены. Это свидетельствует об отсутствии ложноположительных результатов ИФА и 100%-ной специфичности метода. При исследовании группы свиней с подтвержденным положительным диагнозом на трихинеллез (n=7 или 2% от всех обследованных) результаты прижизненного (ИФА) и посмертного (микроскопия) исследований также полностью совпали.

Из полученных данных следует, что ИФА является эффективным методом, позволяющим прижизненно дифференцировать инвазированных трихинеллами свиней от здоровых животных. Так, после микроскопического исследования туши свиньи, содержащейся в личном подсобном хозяйстве, и постановки положительного диагноза на трихинеллез, сыворотки крови 20 (6%) оставшихся животных были исследованы в ИФА. Три (0,9%) из них оказались положительными и 17 (4,9%) - отрицательными, что совпало с последующим послеубойным микроскопическим исследованием туш. Таким образом, результаты исследований по выявлению антител положительно коррелировали с результатами по обнаружению личинок трихинелл с помощью микроскопии.

Суммируя полученные результаты прижизненного и послеубой-ного тестирования свиней, был сделан вывод о том, что из 347 обследованных животных десяти (2,9%) был поставлен положительный диагноз на трихинеллез. При этом, совпадаемость результатов ИФА и микроскопического метода составила 100%.

В последующих исследованиях было показано, что помимо домашних свиней набор может использоваться для выявления специфических антител в сыворотке крови и мясном соке диких кабанов (табл. 2).

Таблица 2. Сравнительные результаты ИФА и микроскопического метода при послеубойном исследовании диких кабанов на трихинеллез (n=5)

N°	Биологический материал для ИФА	N	Результаты исследования на трихинеллез
			ИФА	Микроскопический метод
1	Мясной сок из ножек диафрагмы	1	+	+
2	Мясной сок из кусочков мышц	1	-	-
3	Мясной сок из ножек диафрагмы	2	-	-
4	Мясной сок из кусочков мышц	1	+	+
5	Кровь	1	+	+
6	Мясной сок из кусочков мышц	1	-

Как видно из данных, представленных в таблице 2, при исследовании пяти диких кабанов микроскопически личинки трихинелл были обнаружены у 3 животных. При этом у двух из них специфические антитела были выявлены в мясном соке и у одного - только в крови. Это свидетельствует о том, что для исключения ложноотрицательных результатов ИФА на трихинеллез для приготовления проб от диких кабанов целесообразно отбирать не только кусочки мышц и ножки диафрагмы, но и кровь. Полученные нами результаты вполне согласуются с результатами зарубежных авторов, показавших высокую эффективность ИФА при проведении мониторинговых исследований на трихинеллез в странах Европы и Азии [3, 11, 12, 13]. Однако, стоит отметить, что согласно рекомендациям OIE, положительный результат ИФА не может считаться окончательным и должен быть обязательно подтвержден прямым обнаружением нематод в мясе [14]. Вместе с тем, подходы к прижизненной диагностике трихинеллеза постоянно совершенствуются (что особенно важно для человека). Так, ряд последних исследований свидетельствует о перспективе использования иммуноблоттинга в качестве подтверждающего теста, после проведения исследований свиней и человека на трихинеллез в ИФА [6, 10].

Заключение. Разработанный набор "Трихинелла-Серотест" обладает высокой чувствительностью и специфичностью, эффективен для применения в практических условиях и может использоваться в диагностических целях для обследования свиней и подтверждения благополучия поголовья по трихинеллезу.

Список литературы

1. Василевич Ф.И. Паразитарные зоонозы / Ф.И.Василевич, В.Н.Шевкопляс // Ветеринария Кубани. - 2012. - N°3. - С.5-11.
2. Методические указания по лабораторной диагностике трихинеллеза животных от 28 октября 1998 г. N 13-7-2/1428.
3. Cui J., Wang Z.Q. An epidemiological overview of swine trichinellosis in China // Vet. J., 2011, V.190 (3), P.323-328.
4. Gamble H.R., Pozio E., Bruschi F. et al. International commission on Trichinellosis: recommendations on the use of serological tests for the detection of Trichinella infection in animals and human // Parasite, 2004, V.11, P. 3-13.
5. Gamble H.R., Rapid D., Marinculic A., Murrell K.D. Evaluation of excretory-secretory antigens for the serodiagnosis of swine trichinellosis // Vet. Parasitol., 1988, V.30 (2), P.131-137.
6. Gomez-Morales M.A., Ludovisi A., Amati M. et al. A distinctive Western blot pattern to recognize Trichinella infections in humans and pigs // Int. J. Parasitol., 2012, V. 42(11), P.1017-1023.
7. Gomez-Morales M.A., Ludovisi A., Pezzotti P. et al. International ring trial to detect anti-Trichinella IgG by ELISA on pig sera // Vet. Parasitol., 2009, V.166 (3-4), P.241- 248.
8. Gross S., Greiner M., Mayer-Scholl A. et al. Surveillance systems for status monitoring of Trichinella-free declared pig farms: concepts and their confidence for freedom from disease // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr., 2012, V.125 (11-12), P.482-493.
9. Murrell K.D, Zarlenga D.S. Immunodiagnosis of swine trichinellosis // Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health., 1991, 22 Suppl., P.321-325.
10. Nockler K., Reckinger S., Broglia A. et al. Evaluation of a Western Blot and ELISA for the detection of anti-Trichinella-IgG in pig sera // Vet. Parasitol., 2009, V.163(4), P.341-347.
11. Schuppers M.E., Rosenberg G., Graf R. et al. A study to demonstrate freedom from Trichinella spp. in domestic pigs in Switzerland // Zoonoses Public Health, 2010, V.57 (7-8), P. 130-135.
12. Szell Z., Marucci G., Ludovisi A. et al. Spatial distribution of Trichinella britovi, T. spiralis and T. pseudospiralis of domestic pigs and wild boars (Sus scrofa) in Hungary // Vet. Parasitol., 2012, V.183 (3-4), P. 393-396.
13. Thi N.V., De N.V., Praet N. et al. Seroprevalence of trichinellosis in domestic animals in northwestern Vietnam // Vet. Parasitol., 2012, in press.
14. World Organization of Animal Health (OIE). Trichinellosis. Manual of Standards for diagnostic test and vaccines, 2012, Ch.2.1.16.

Реферат

В статье представлены данные по оценке практической эффективности ИФА-набора "Трихинелла-Серотест", предназначенного для выявления антител к трихинеллам в сыворотке крови и мясном соке свиней. Установлена полная совпадаемость результатов ИФА и микроскопического метода при исследовании группы свиней с подтвержденным положительным диагнозом на трихинеллез. Заражение трихинеллезом и наличие личинок трихинелл в мясе в 100% случаев обуславливает высокий уровень циркулирующих специфических антител, выявляемых в ИФА. Это позволяет прижизненно дифференцировать инвазированных трихинеллами свиней от здоровых животных, что подтверждено результатами обследования 20 свиней, 3 из которых оказались зараженными и 17 - здоровыми. Набор "Трихинелла-Серотест" может также использоваться для выявления специфических антител в сыворотке крови и мясном соке диких кабанов, что было продемонстрировано в сравнительных экспериментах. По результатам исследований сделано общее заключение о том, что ИФА-набор "Трихинелла-Серотест" эффективен для применения в практических условиях и может быть использован для прижизненной диагностики болезни и проведения мониторинговых исследований на трихинеллез.

Ключевые слова: трихинеллез свиней, домашние свиньи, дикие кабаны, иммуноферментный анализ, ИФА-набор "Трихинелла-Серотест", чувствительность, специфичность, микроскопия, диагноз.

Сведения об авторах

Цибезов Валерий Владимирович, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник АНО "НИИ ДПБ"; 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16; тел.: 8 (499) 190-75-61; e-mail: tsibezov@yandex.ru .

Баландина Марина Владимировна, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник АНО "НИИ ДПБ"; 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16; тел.: 8 (499) 190-75-61; e-mail: info@dpri.ru .

Черных Олег Юрьевич, доктор ветеринарных наук, директор ГБУКК "Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория"; 352380, Краснодарский край, г. Кропоткин, ул. Красноармейская, д.303; тел.: 8 (86138) 6-23-14; e-mail: gukkvl50@kubanvet.ru .

Шевкопляс В.Н, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры ветсанэк-спертизы ФГБОУ ВПО "Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина"; 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д.23; тел.: 8 (499) 784-62-19; e-mail: shevkoplyasvn@gmail.com .

Алипер Тарас Иванович, доктор биологических наук, профессор, директор ООО "НПО НАРВАК"; 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16; тел.: 8-499-190-30-54; e-mail: aliper@narvac.com .

Ответственный за переписку с редакцией: Верховский Олег Анатольевич, доктор биологических наук, профессор, президент АНО "НИИ ДПБ"; 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16; тел.: 8 (499) 190-75-61; e-mail: info@dpri.ru.

UDС 619:616

ESTIMATION OF ELISA DIAGNOSIS EFFICIENCY AT SWINE TRICHINELLOSIS

Verkhovsky O.A., Tsibezov V.V., Balandina M.V., Shevkoplyas V.N., Aliper T.I., Chernykh O.Yu.

Summary

Sensitive and specific serologic test kit based on solid-phase enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) named as "Trichinella-Serotest" has been evaluated for the detection of anti-Trichinella antibodies in porcine serum and meat juice samples. ELISA was developed using excretory-secretory antigens (E/S) from in vitro cultivated Trichinella spp. muscle larvae and the aim of this study was to compare ELISA results with taking results of artificial digestion method as gold standard. For this purpose 347 domestic pigs and 5 wild boars from different areas of Krasnodar region were examined for swine trichnellosis by both methods and positive results for 10 domestic pigs and 3 wild boars were obtained and analyzed. Results showed that all Trichinella-free domestic pigs were ELISA-negative whereas sera from all Trichinella-infected animals contain specific antibodies which are detectable by ELISA. For wild boars it demonstrates that blood samples can be taken and tested simultaneously with meat juice samples by ELISA for confirmation diagnosis of trichinellosis. In conclusion, ELISA-kit "Trichinella-Serotest" is effective for veterinary laboratories and can be used for monitoring of swine Trichinella infection.

Key words: trichinellosis, domestic pigs, wild boars, enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA-kit Trichinella-Serotest, sensitivity, specificity, diagnosis.

References

1. Vasilevich F.I., Shevkoplyas V.N. Parazitarnye zoonozy [Parasitic zoonoses]. - Veterinariya Kubani. - Krasnodar, 2012 (3). - pp.5-11.
2. Metodicheskie ukazaniya po laboratornoy diagnostike trikhinelleza zhivotnykh [Practical for laboratory diagnostics of animal trichinellosis]. - Moscow, 1998.
3. - 14. Vide supra.

Author affiliation

Tsibezov Valery V., Ph.D. in Biology, leading research associate of theIndependent non-profit organization "Diagnostic and Prevention Research Institute for Human and Animal Diseases" (DPRI); 16, Gamaleya st., Moscow, 123098; phone: +7 (499) 190-75-61; e-mail: tsibezov@yandex.ru.

Balandina Marina V., Ph.D. in Biology, leading research associate of the Independent non-profit organization "Diagnostic and Prevention Research Institute for Human and Animal Diseases (DPRI); 16. Gamaleya st., Moscow, 123098; phone: +7 (499) 190-75-61; e-mail: info@dpri.ru.

Shevkoplyas Vladimir N., D.Sc. in Veterinary Medicine, professor of the department of veterinary-sanitary examination of the Skryabin Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology; 23, Skryabina st., Moscow, 109472; phone: 8 (499) 784-62-19; e-mail: shevkoplyasvn@gmail.com.

Aliper Taras I., D.Sc. in Biology, professor, director of the NARVAC Ltd; 16, Gamaleya str., Moscow, 123098; phone: +7 (499) 190-30-54; e-mail: aliper@narvac.com.

Chernykh Oleg Yu., D.Sc. in Veterinary Medicine, director of the Kropotkin territorial veterinary laboratory; 303, Krasnoarmeyskaya st., Kropotkin, 352380; phone: +7 (86138) 6-23-14; e-mail: gukkvl50@kubanvet.ru .

Responsible for correspondence with the editorial board: Verkhovsky Oleg A., D.Sc. in Biology, professor, president of the Independent non-profit organization -Diagnostic and Prevention Research Institute for Human and Animal Diseases (DPRI)"; 16. Gamaleya st., Moscow, 123098; phone: +7 (499) 190-75-61; e-mail: info@dpri.ru .

	Полезные ссылки
Департамент ветеринарии Краснодарского края Ассоциация Практикующих Ветеринарных Врачей