Новые штаммы Lactobacillus Acidophilus как перспективные пробиотики для птицеводства

УДК 579.64
DOI 10.33861/2071-8020-2022-6-16-21

Валиуллин Л.Р. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский
научно-исследовательский институт фитопатологии», Московская область, Одинцовский район,
р. п. Большие Вяземы
Мухаммадиев Риш.С., Мухаммадиев Рин.С. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии», Московская область, Одинцовский район,
р. п. Большие Вяземы / Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр
токсикологической, радиационной и биологической безопасности», г. Казань
Тимербаева Р.Р. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Казанская государственная академия ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана», г. Казань
Каримуллина И.Г., Яруллин А.И. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»,
г. Казань

Птицеводство является основной составляющей сельского хозяйства, наиболее динамичной и наукоемкой отраслью агропромышленного комплекса, обеспечивающей население Российской Федерации широким ассортиментом продуктов с диетическими (лечебными) свойствами [11, 12]. В решении актуальной проблемы обеспечения продовольственной безопасности страны значимость данной отрасли колоссальна в связи с промышленным производством полноценной сбалансированной продукции [11].

В условиях птицеводческих предприятий на организм молодняка сельскохозяйственной птицы оказывает воздействие ряд неблагоприятных факторов, которые способны приводить к изменениям состава микробиоты кишечника в сторону повышения уровня условно-патогенных микроорганизмов, к нарушениям функционирования различных органов и систем организма и, таким образом, к резкому снижению его естественной резистентности [3, 24].

Наиболее перспективным подходом восстановления уровня и оптимизации функции микробиоты кишечника птицы является применение биопрепаратов микробного происхождения - пробиотических добавок [4, 15, 26]. Накопленные к настоящему времени результаты исследований российских и зарубежных авторов свидетельствуют о том, что микроорганизмы с пробиотическими свойствами проявляют комплексные свойства: обладают антагонистическим потенциалом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов образованием пероксида водорода, органических кислот (уксусной, янтарной, молочной, муравьиной) антибиотических веществ, лизоцима и бактериоцинов, а также конкуренцией за рецепторные структуры, питательные субстраты и места обитания (механизм конкурентного исключения); играют роль в процессе пищеварения путем продукции гидролаз (амилаз, протеаз и липаз) - аналогов пищеварительных ферментов макроорганизма; синтезируют разнообразный набор биологически активных веществ (витамины, аминокислоты, пептиды, полисахариды, ферменты), обладающих адъювантными, иммуномодулирующими, антиоксидантными и детоксикационное действиями; способствуют выведению токсичных для организма тяжелых металлов (стронция, серебра, кадмия) [9, 16, 29].

В связи с тем, что большинство установленных к настоящему времени пробиотических штаммов являются представителями облигатной микробиоты кишечника млекопитающих, преобладают в ней по численности и физиологической важности, добавки на их основе считаются безопасными и используются без ограничения в сельском хозяйстве [4, 12]. К микроорганизмам, используемым как основа пробиотиков, относят штаммы бифидобактерий, лактобактерий, пропионибактерий, споровых аэробных бацилл, дрожжевых грибов, энтерококков, термофильных стрептококков и индигенных эшерихий [3, 6, 28].

Правильный выбор пробиотических микроорганизмов необходим в связи с получением оптимальных эффектов, которые значимы для улучшения питания и охраны здоровья сельскохозяйственных животных. В этом плане к числу наиболее перспективных объектов относятся штаммы бактерий вида Lactobacillus acidophilus [8, 24]. Установлена способность некоторых штаммов данного вида выживать в условиях, имитирующих желудочную среду (с pH 2.0 в течение 90 мин) [7]. Показано, что они образуют органические кислоты (лактат), витамины (РР, В3, В5, В6, B9 и В12), антибиотики и бактериоцины (ацидоцин, ацидофилин, лактоцидин, лактоцин) [7, 8, 27]. В последние годы за рубежом начали появляться сведения, что штаммы вида L. acidophilus продуцируют различные внеклеточные ферменты гидролитического действия (целлюлазы и амилазы), способные принимать участие в модулировании кишечной микробиоты сельскохозяйственных птиц [20]. Тем не менее, исследования, направленные на комплексный анализ активности данного класса ферментов штаммов L. acidophilus с пробиотическими свойствами, отсутствуют. Кроме того, установлено, что они проявляют лечебнопрофилактический и ростостимулирующий эффект на цыплят-бройлеров [21, 24]. Необходимость дальнейшего исследования в этом направлении не подлежит сомнению для разработки новых средств на основе микробных штаммов и их биологически активных соединений, а также энзимно-пробиотических комплексов.

Цель исследований - оценка пробиотических свойств новых штаммов L. acidophilus in vitro для возможности их использования в птицеводстве.

Материалы и методы исследований. Материалами для исследований служили полученные из фонда Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии (Московская обл., Россия) 6 штаммов L. acidophilus. Для выращивания лактобактерий применяли стерильное обезжиренное молоко или MRS среду (Conda, Испания). В качестве тест-объектов использовали грамположительные (Staphylococcus aureus, Enterococcus sp.) и грамотрицательные (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella sp.) микроорганизмы, изолированные из биоматериала погибших цыплят с клиническими симптомами кишечных инфекций.

Оценку in vitro антагонистических свойств штаммов лактобактерий в отношении тест-микроорганизмов проводили методом, который изложен в работе Nachi et al. (2019) [22].

Способность исследуемых микроорганизмов к росту при различных температурах устанавливали культивированием их в агаризо-ванной среде MRS при 15 и 45°С в течение 48 ч [6]. Способность бактериальных штаммов к росту в условиях различной концентрации водородных ионов или солености оценивали инкубированием их на вышеуказанной питательной среде с рН 4,0 и рН 9,0 или содержанием хлористого натрия 4 и 6,5 % при 37°С в течение 48 ч. [18].

Исследование каталазной активности лактобацилл, выращенных на жидкой (стерильное молоко) питательной среде в течение 48 ч, проводили по ГОСТ Р 56139-2014. Для этого 150 мкл нейтрализованной 10%-ным раствором гидроокиси натрия культуральной жидкости выдерживали на воздухе в течение 30 мин и вносили к ней каплю 5 мкл 3%-ного раствора перекиси водорода. По образованию пузырьков кислорода при воздействии на клетки культуры перекиси водорода судили о споУстойчивость лактобацилл к желчи оценивали in vitro методом, описанным в работе Хадиева и др. (2006) [10]. Для исследования применяли желчь цыплят-бройлеров, стерилизованную путем фильтрования через мембранный фильтр Millex (d пор 0,22 мкм, Millipore, Германия). Бактериальные клетки штаммов получали после их культивирования в бульонах типа Мозера-Рогоза-Шарпа (HiMedia, Индия) в течение 2 суток методом центрифугирования при 10000 об./мин в течение 15 мин. Начальный титр активных клеток для штамма L. acidophilus IV8 составил 2,60*109 КОЕ/мл, для штамма L. acidophilus IV72 - 5,14*109 КОЕ/мл. Клетки лактобацилл вносили в среду MRS, содержащей 1% или 5% желчь, и инкубировали при 37°С в течение 6 ч. Затем отбирали 0,1 мл суспензии, готовили серию ее разведений в 0,1% растворе пептона и высевали газоном на среду MRS для подсчета количества вегетативных клеток (КОЕ/мл). Инкубацию посевов вели при 37°C в течение 48 ч.

Устойчивость лактобацилл к рН и имитацию транзита лактобацилл через желудочно-кишечный тракт сельскохозяйственных птиц in vitro проводили в среде MRS при значениях рН 5.0, 3.0 и 7.0 (соответствует зобу, желудку и кишечнику) и длительности инкубации при 40°С от 60 до 150 мин. Начальный титр активных клеток для штамма L.acidophilus IV8 - 2,60*109 КОЕ/мл, для штамма L. acidophilus IV72 - 5,14*109 КОЕ/мл [10]. Бактериальные клетки исследуемых штаммов выдерживали в бульоне типа Мозера-Рогоза-Шарпа c рН 5.0 в течение 60 мин, концентрировали методом центрифугирования (10000 об./мин в течение 15 мин), осадок суспензировали в таком же объеме свежей среды MRS с рН 3.0 и инкубировали в течение 90 мин. После чего отбирали 0,1 мл клеточной суспензии, готовили серию ее разведений в 0,1 % (масса/объем) растворе пептона и высевали на вышеуказанную агаризованную среду для подсчета КОЕ/мл. Оставшуюся суспензию клеток осаждали путем центрифугирования и переносили в среду MRS с рН 7.0. Инкубацию проводили в течение 150 мин. Аликвоту объемом 0,1 мл отбирали для установления количества вегетативных клеток (КОЕ/мл).

Для культивирования исследуемых бактериальных штаммов при оценке их способности к продукции внеклеточные гидролаз использовали жидкую модифицированную среду MRS, содержащей в качестве источников питания соответствующие ферментам индукторы их синтеза (карбоксиметилцеллюлоза, ксилан, крахмал и казеин в концентрации 1,0%, дикалиевая соль фитиновой кислоты - 0,1% и оливковое масло - 2,0%). Штаммы бактерий выращивали при температуре 37°С в течение суток. Аликвоты культурального супернатанта, используемого в качестве источника ферментов, получали из культуральной жидкости лактобацилл методом ее центрифугирования при 10 тыс. об/мин в течение 10 мин для оценки гидролазной активности [2].

Активность целлюлазы, ксиланазы и амилазы в культуральных супернатантах бактериальных штаммов устанавливали калориметрическим способом, который основан на определении содержания редуцирующих сахаров после разложения соответствующего субстрата ферментами, с помощью реагента ДНСК (3,5-динитросалициловая кислота), в соответствии с методиками, описанными нами ранее [2, 13, 14] и в работах зарубежных авторов [20]. За 1 единицу активности гидролазы принимали определенное количество фермента, приводящей к образованию 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в эквиваленте соответствующего моносахарида) за 1 мин реакции в 1 мл реакционной смеси в условиях экспериментального исследования.

Активность протеазы лактобацилл оценивали методом, описанным в работе Oke и Onilude (2014) [23]. В качестве субстрата использовали 2% раствор казеина, приготовленный в фосфатно-цит-ратном буферном растворе (0,1 М, рН 5,5). Реакционную смесь, содержащей культуральный супернатант (1 мл) и раствор субстрата (1 мл), инкубировали при 28°С в течение 20 мин, вносили 10% трихлоруксусную кислоту (3 мл) и выдерживали при 4°С в течение 60 мин. Измерение оптической плотности осуществляли при длине волны 660 нм. Активность фермента выражали в международных единицах.

Активность фитазы в культуральных супернатантах бактериальных штаммов устанавливали по методу Tang et al. (2010), используя в качестве субстрата фитат натрия [25]. Реакционная смесь состояла из 10 мМ раствора субстрата (400 мкл) в Na-ацетатном буфере (0,1 М, pH 5,5) и раствора фермента (200 мкл). После инкубации при 50°С в течение 30 мин реакцию останавливали добавлением 100 мкл 20% раствора трихлоруксусной кислоты. Измерение оптической плотности осуществляли при длине световой волны 405 нм. За 1 единицу активности фитазы принимали количество фермента, которое необходимо для образования 1 мкМ неорганического фосфата за 60 мин на 1 мл ферментного раствора в условиях эксперимента.

Активность липазы лактобацилл оценивали титриметрическим способом, основанным на анализе количества жирных кислот, образовавшихся в результате гидролиза ферментом субстрата 40% эмульсии оливкового масла [17]. Приготовление раствора субстрата осуществляли смешением раствора оливкового масла (100 мл) и 2% раствора поливинилового спирта (150 мл). Реакционная смесь содержала 40% раствора субстрата (5 мл), фосфатного буферного раствора (20 мМ, рН 5,0) (5 мл) и неочищенного фермента (1 мл). Инкубацию смеси вели при 37°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали внесением раствора этанола (15 мл), титрацию осуществляли раствором NaOH (0,1 М) в присутствии 1% раствора фенолфталеина в качестве индикатора. За 1 единицу активности липазы принимали количество фермента, которое необходимо для образования 1 мкмоль олеиновой кислоты за 1 мин реакции в опытных условиях.

Результаты исследований и их обсуждение. На промышленных птицеводческих предприятиях Российской Федерации у молодняка сельскохозяйственной птицы широко распространены микроэкологи-ческие нарушения кишечника с преобладанием в нем условно-патогенных и патогенных микроорганизмов рода Escherichia, Pseudomonas, Staphylococcus, Salmonella и Enterococcus [12]. В связи с этим, на первом этапе наших исследований определяли способность изучаемых бактериальных штаммов к подавлению роста Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. и Enterococcus sp.

Сравнительная оценка 6 штаммов L. acidophilus показала выраженные различия в уровне и спектре их антимикробного эффекта в отношении возбудителей кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственной птицы. По степени ингибирования рост тест-мик-роорганизмов изучаемые нами лактобактерии были разделены на 3 основные группы: с отсутствующей или низкой (зоны угнетения роста до 6 мм), средней (от 6 до 12 мм) и более высокой (более 12 мм) антагонистической активностью. Установлено, что штаммы L. acidophilus IV15, L. acidophilus IV29 и L. acidophilus IV144 обладали умеренной способностью подавлять рост S. aureus, Salmonella sp. и Enterococcus sp. (табл. 1).

Таблица 1 Антагонистический потенциал некоторых штаммов молочнокислых бактерий

Примечание: степень проявления антимикробного эффекта: (+) - зона угнетения роста до 6 мм; (++) - от 6 до 12 мм; (+++) - более 12 мм

Проявление антагонистической активности L. acidophilus преимущественно обусловлена их способностью к продукции органических кислот, лизоцима и антибиотических соединений, включая бактериоци-нов [8, 18].

К перспективным микроорганизмам для потенциального применения с целью профилактики и лечения кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственной птицы отнесены штаммы L. acidophilus IV8 и L. acidophilus IV72. В таблице 2 представлены основные физиолого-биохимические характеристики отобранных штаммов, которые используются при видовой идентификации лактобактерий и входят в требования, предъявляемых к микроорганизмам - основам пробиотиков.

Таблица 2 Основные физиолого-биохимические особенности штаммов L. acidophilus

Примечание: (-) - отсутствие признака (+) - наличие принака

Одним из основных свойств пробиотиков в плане их практического использования как кормовых добавок в птицеводстве является их устойчивость к кислотам и желчи желудочно-кишечного тракта животных. Выдерживание бактериальных клеток L. acidophilus IV8 и L. acidophilus IV72 (2,60x109 и 5,14*109 КОЕ/мл, соответственно) в жидкой среде MRS, содержащей 1 и 5 % желчи цыплят-бройлеров, в течение 6 ч показало их устойчивость (рисунок 1). В среде с 1% желчью выживаемость штаммов L. acidophilus IV8 и L. acidophilus IV72 составила соответственно 41,9 и 26,3%, в присутствии 5% желчи -18,0 и 8,4% относительно контроля (числа микроорганизмов на единицу объема суспензии в начале эксперимента) (р<0,05).

Рис. 1. Устойчивость штаммов L. acidophilus IV8 и L. acidophilus IV72 к желчи цыплят-бройлеров (различия между вариантами статистически значимы (p<0,05)

Необходимо отметить, что исследованная концентрация желчи 5% для установления устойчивости изучаемых лактобацилл была существенно выше, чем принято при определении выживаемости бактериальных штаммов, используемых в качестве пробиотиков. Для оценки выживаемости пробиотических штаммов лактобацилл применяют среды с содержанием солей желчи 0,1-0,5% [18]. Результаты нашего исследования согласуются с данными зарубежных авторов, которые установили, что штаммы L. acidophilus значительно различаются по проявлению устойчивости к данному фактору. Так, выживаемость штамма L. acidophilus TISTR1338 после его инкубирования в среде, содержащей 1% соли желчи, в течение 1 ч составила 42,3% относительно контроля [30]. Показана способность некоторых штаммов L. acidophilus, например, L. acidophilus KCTC3140, L. acidophilus KCTC3146 и L. acidophilus KCTC3154, которые изолированы соответственно из крысы, свиньи и курицы, проявлять достаточно высокую устойчивость к различным концентрациям желчи (1-5%) в отличие от выделенного из биоматериала человека штамма L. acidophilus KCTC3179, выживаемость которого после 2 ч воздействия 5% желчи составила 0,65% по сравнению с количеством бактериальных клеток в начале эксперимента [19].

Накопленные к настоящему времени данные исследований российских и зарубежных авторов, свидетельствуют, что в процессе прохождения пробиотических штаммов по желудочно-кишечному тракту сельскохозяйственных животных кислотность способна оказывать значительное воздействие на их выживаемость [7, 19, 29]. Определение устойчивости исследуемых штаммов лактобацилл в средах с приближенными значениями рН к условиям различных отделов пищеварительного тракта птицы показало несущественное снижение количества жизнеспособных бактериальных клеток относительно контроля (числа микроорганизмов на единицу объема суспензии в начале эксперимента) (рисунок 2).

Рис. 2. Устойчивость штаммов L. acidophilus IV8 и L. acidophilus IV72 в средах, значения рН которой аналогичны к условиям в различных отделах пищеварительного тракта сельскохозяйственных птиц (различия между значениями количества жизнеспособных бактериальных клеток L. acidophilus IV72 в условиях, имитирующих их транзит через отделы желудочно-кишечного тракта животных, не значимы (р>0,05)

В результате выдерживания в среде с рН 5.0 (зоб) в течение 1 ч и при pH 3.0 (желудок) в течение 1.5 ч количество жизнеспособных клеток штамма L. acidophilus IV8 снижалось соответственно на 15,4 (2,2x109 К0Е/мл) и 26,9 (1,9x109 К0Е/мл) % по сравнению с числом микроорганизмов в начале экспериментального исследования (2,6x109 КОЕ/мл) (p<0,05). После инкубирования бактериальных клеток данного штамма при рН 7.0 (кишечник) в течение 2.5 ч наблюдали повышение их количества до 2,1x109 КОЕ/мл, что составляло 80,8% от начальной концентрации клеток лактобациллы. Различия между значениями содержания бактериальных клеток L. acidophilus IV72 были статистически не значимы (р>0,05).

Полученные результаты указывают на возможность отобранных лактобацилл к сохранению на всем протяжении ЖКТ сельскохозяйственных птиц пробиотических свойств, необходимых для достижения лечебного эффекта.

В рацион молодняка сельскохозяйственной птицы, прежде всего, включают высокопитательные зерновые и зернобобовые корма, содержащие некрахмалистые полисахариды - факторы, которые ухудшают процесс перевариваемости кормов, негативно воздействуют на определяющей ее здоровье и продуктивность кишечную микробиоту [3, 11]. Одним из проявлений пробиотических функций различных штаммов лактобацилл является способность их к продукции физиологически активных соединений - гидролитических ферментов, которые могут принимать участие в процессе пищеварения, улучшая перевариваемость компонентов кормов и повышая их усвояемость сельскохозяйственными животными [20].

Сравнительный анализ активности гидролаз в культуральных жидкостях L. acidophilus, полученных в процессе гомогенного глубинного их культивирования в течение 24 ч, показал существенные штаммовые различия в способности к продукции ферментов (рисунок 3)

Рис. 3. Активность гидролитических ферментов штаммов L. acidophilus: 1 - целллюлаза, 2 - ксиланаза, 3 - амилаза, 4 - протеаза, 5 - фитаза, 6 - липаза

Так, среди исследуемых лактобацилл наибольшей активностью целлюлазы и амилазы (0,52±0,02 Ед./мл и 3,97±0,09 Ед./мл, соответственно) обладал штамм IV8, что в 1,4 и 1,3 раза выше по сравнению с уровнем продукции данных ферментов у штамма IV72 (р<0,05). Однако в то же время штамм IV72 характеризовался более высоким, по сравнению с штаммом IV8, уровнем биосинтеза протеазы, фитазы и липазы (соответственно 0,26±0,03 Ед./мл, 0,33±0,02 Ед./мл и 4,24±0,15 Ед./мл), активность которых была выше в 2,2, 1,7 и 1,6 раза, соответственно (р<0,05).

Необходимо отметить, что в нашем исследовании в культуральных супернатантах обоих бактериальных штаммов не обнаружена ксила-назная активность. Процесс образования гидролитических ферментов микроорганизмом, в основном, зависит от условий выращивания (температура, кислотность и аэрация), состава питательной среды (содержание основных источников питания), от фазы роста и его штаммовых особенностей [1, 5].

Полученные нами результаты исследований согласуются с данными отечественных и зарубежных авторов, согласно которым штаммы L. acidophilus способны к образованию внеклеточных целллюлаз, амилаз, протеаз, фитаз и липаз [17, 20, 25].

Заключение. На основании полученных результатов отобраны два наиболее активных по антагонистическому потенциалу в отношении возбудителей кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственной птицы штаммы L. acidophilus, а именно, L. acidophilus IV8 и L. acidophilus IV72. Выявленные лактобациллы проявляют высокую степень рН- и желчеустойчивости, способны к синтезу целлюлозо-, амило-, протео-, фито- и липолитических ферментов, что позволяет рекомендовать их к применению в качестве пробиотиков для птицеводства.

Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Всероссийского научно-исследовательского института фитопатологии среди ведущих мировых научно-образовательных центров и поддержана грантом Президента РФ МК-2439.2022.5 (соглашение № 075-15-2022-414 от «12» мая 2022 г).

Благодарности. Авторы выражают огромную благодарность Шамилю Завдатовичу Валидову (НИЛ «Микробные биотехнологии» ИФМиБ Казанского (Приволжского) федерального университета) и Татьяне Вадимовне Багаевой (кафедра биохимии, биотехнологии и фармакологии ИФМиБ Казанского (Приволжского) федерального университета) за помощь и полезные советы в аналитических экспериментах.

Список литературы:

1. Авдеева Л.В., Осадчая А.И., Хархота М.А. Биосинтез целлюлаз пробиотическими штаммами Bacillus subtilis при совместном выращивании// 2010. С. 80-89.

2. Бактерии - антагонисты возбудителей кишечных инфекций и продуценты комплекса целлюлаз как основа для создания добавок, объединяющих функции пробиотика и кормового фермента/ Л.Р. Валиуллин, Риш.С. Мухаммадиев, Рин. С. Мухаммадиев, В.И. Егоров, В.Ю. Рудь, А.П. Глинушкин// Достижения науки и техники АПК. 2021. Т. 35. № 9. С. 60-66.

3. Биопрепараты микробного происхождения в птицеводстве / Н.В. Феоктистова, А.М. Марданова, М.Т. Лутфуллин, Л.М. Богомольная, М.Р. Шарипова// Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки. 2018. Т. 160. № 3. С. 395-418.

4. Влияние пробиотиков Bacillus subtilis GM2 и GM5 на рост и усвояемость кормов у цыплят-бройлеров/ Г.Ф. Хадиева, М.Т. Лутфуллин, А.А. Николаева, Н.К. Мочалова, С.Ю. Смоленцев, А.М. Марданова, М.Р. Шарипова// Учен. зап. Казан. ун-та. Сер. Естеств. науки. 2019. Т. 161, кн. 3. С. 472-489.

5. Влияние различных источников углерода и азота на продукцию ксиланаз грибом Bipolaris sorokiniana/ Р.С. Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, Т.В. Багаева, Л.Р. Валиуллин, А.П. Глинушкин// Достижения науки и техники АПК. 2019. Т. 33. № 1. С. 41-44.

6. Выделение и изучение морфологических и биохимических свойств новых штаммов молочнокислых бактерий, перспективных для создания пробиотических препаратов/ А.С. Мухаммадиева Р.С. Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, Л.Р. Валиуллин// Ветеринарный врач. 2020. № 3. С. 39-46.

7. Ивашкина Н.Ю., Ботина С.Г. Оригинальный отечественный пробиотик аципол: молекулярно-биологические и метаболические характеристики// Российский журнал гастероэнтерологии, гепатологии и колипроктологии. 2009. № 2. С.58-63.

8. Иркитова А.Н., Мацюра А.В. Эколого-биологическая характеристика Lactobacillus acidophilus// Ukrainian Journal of Ecology. 2017. № 4. С. 214-230.

9. Нейтрализация метаболитов Fusarium в растительном сырье / Л.Р. Валиуллин, Риш.С. Мухаммадиев, Рин.С. Мухаммадиев, Е.В. Скворцов, И.С. Рагинов, В.Ю. Рудь, А.П. Глинушкин// Достижения науки и техники АПК. 2020. Т. 34. № 12. С. 73-77.

10. Новые штаммы Bacillus subtilis как перспективные пробиотики/ Г.Ф. Хадиева, М.Т. Лутфуллин, Н.К. Мочалова, О.А. Ленина, М.Р. Шарипова, А.М. Мар-данова// Микробиология. 2018. Т. 87. №4. С. 356-365.

11. Оптимизация состава питательной среды пробиотического штамма B. subtilis GA24 - продуцента кормовых ферментов/ Р.С. Мухаммадиев, Л.Р. Валиуллин, Р.С. Мухаммадиев, А.С. Мухаммадиева, А.С. Сайфуллин, А.П. Глинуш-кин// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2022. Т. 250. № 2. С. 155-159.

12. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus в птицеводстве/ Н.В. Феоктистова, А.М. Марданова, Г.Ф. Хадиева, М.Р. Шарипова// Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки. 2017. Т. 159. № 1. С. 85-107.

13. Ферментативная активность гидролаз штаммов микроорганизмов, перспективных для создания на их основе кормовых добавок и биологических консервантов/ Р.С. Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, И.Г. Каримуллина, В.Г. Гумеров, Л.Р. Валиуллин// Состояние, проблемы и перспективы развития современной науки: материалы национальной научно-практической конференции. Брянск: Брянский государственный аграрный университет (Кокино), 2021. С. 127-133.

14. Ферментативная активность ксиланаз и целлюлаз пробиотических штаммов Bacillus subtilis/ Р.С. Мухаммадиев, Р.С. Мухаммадиев, Л.Р. Валиуллин, В.В. Бирюля, Е.В. Скворцов// Ветеринарный врач. 2019. № 3. С. 19-23.

15. Alayande K.A., Aiyegoro O.A., Ateba C.N. Probiotics in animal husbandry: applicability and associated risk factors// Sustainability. 2020. 12(3). 10871099.

16. Antagonistic properties and biocompatibility as important principles for development of effective and biosafety probiotic drugs/ Rish.S. Mukhammadiev, A.S. Mukhammadieva, E.V. Skvortsov, E.V. Skvortsov, L.R. Valiullin, A.P. Glinushkin// IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2021. 663. 012008.

17. Bhargavi P.L., Manjushri R., Neelakanta Reddy P. Lipase production by lactic acid bacteria in submerged and solid state fermentation// BioTechnology: An Indian Journal. 2010. 4 (3). 126-129.

18. Characterization of Lactobacillus acidophilus isolated from piglets and chicken/ Y.T. Ahn, K.L. Lim, J. Ryu, D.K. Kang, J.S. Ham, Y.H. Jang, H.U. Kim// Asian-australasian Journal of Animal Sciences. 2002. 15. 1790-1797.

19. Comparison of pH and bile resistance of Lactobacillus acidophilus strains isolated from rat, pig, chicken, and human sources/ S.C. Park, M.H. Hwang,Y.H. Kim, J.C. Kim, J.C. Song, K.W. Lee, K.S. Jeong, M.H. Rhee, K.S. Kim, T.W. Kim// World J. Microbiol. Biotechnol. 2006. 22. 35-37.

20. Dumitru M., Ciurescu G., Habeanu M. Evaluation of Lactobacillus spp. based on phenotypical profile as direct-fed microbial candidate for poultry nutrition// Archiva Zootechnica. 2021. 24. 150-166.

21. Effects of Lactobacillus acidophilus on the growth performance, immune response, and intestinal barrier function of broiler chickens challenged with Escherichia coli O157// Z. Wu, K. Yang, A. Zhang, W. Chang, A. Zheng, Z. Chen, H. Cai, G. Liu// Poult. Sci. 2021.100(9). 101323.

22. Microbiological analysis and assessment of biotechnological potential of lactic acid bacteria isolated from Tunisian flours/ I. Nachi, I. Fhoula, I. Smida, H.-I. Ouzari, M. Hassouna// Annals of Microbiology. 2019. 69. 29-40.

23. Oke M.A., Onilude A.A. Partial purification and characterization of extracellular protease from Pedicoccus acidilactici// Nigerian Journal of Basic and Applied Sciences. 2014. 22. 19-25. DOI:10.4314/njbas.v22i1.4.

24. Park Y.H., Hamidon F., Rajangan Ch. Application of probiotics for the production of safe and high-quality poultry meat// Korean J. Food Sci. Anim. Resour. 2016. 36(5). 567-576.

25. Phytase activity from Lactobacillus spp. in calcium-fortified soymilk/ A.L. Tang, G. Wilcox, K.Z. Walker, N.P. Shah, J.F. Ashton, L. Stojanovska// J. Food Sci. 2010. 75(6). M373-376.

26. Probiotics (direct-fed microbials) in poultry nutrition and their effects on nutrient utilization, growth and laying performance, and gut health: a systematic review/ R. Jha, R. Das, S. Oak, P. Mishra// Animals (Basel). 2020. 10 (10). 18631881.

27. Production of vitamins B3, B6 and B9 by Lactobacillus isolated from traditional yogurt samples from 3 cities in Iran, winter 2016/ P. Hamzehlou, A. Akhavan Sepahy, S. Mehrabian, F. Hosseini// Applied Food Biotechnology. 2018. 5(2).107-120.

28.Selectedalternativefeedadditivesusedtomanipulatetherumenmicrobiome/ M. Michalak, K. Wojnarowski, P. Cholewinska, N. Szeligowska, M. Bawej, J. Pacon// J. Animals. 2021. 11(6). 1542-1554.

29. Survival of probiotic strains of microorganisms under imitating digestion in the stomach and intestines of farm animals/ Rish.S. Mukhammadiev, Rin.S. Mukhammadiev, E.V. Skvortsov, L.R. Valiullin, A.P. Glinushkin, V.P. Kalinitchenko// IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2021. 663. 012038.

30. Thaweesang S., Leenanon B. Survival of Lactobacillus acidophilus TISTR1338 in bile salt stress conditions// Asian Journal of Microbiology, Biotechnology and Environmental Sciences. 2016. 18(3). 569-579.

Резюме. В работе проведена оценка пробиотических свойств новых штаммов L. acidophilus in vitro для определения возможности их использования в птицеводстве. Изучено 6 штаммов L. acidophilus, антагонистическую активность которых устанавливали чашечным методом. Относительно высоким антимикробным потенциалом по отношению к возбудителям кишечных инфекций молодняка сельскохозяйственной птицы характеризовались штаммы L. acidophilus IV8 и L. acidophilus IV72. Выдерживание их бактериальных клеток (2,60x109 и 5,14x109 КОЕ/мл, соответственно) в жидкой среде MRS, содержащей 1 и 5 % желчи цыплят-бройлеров, в течение 6 ч показало их устойчивость. В среде с 1% желчью выживаемость штаммов IV8 и IV72 составила соответственно 41,9 и 26,3%, в присутствии 5% желчи - 18,0 и 8,4% относительно контроля. После последовательного инкубирования в средах с рН (5.0, 3.0 и 7.0), приближенных к условиям различных отделов пищеварительного тракта птицы (соответственно зобу, желудку и кишечнику), количество жизнеспособных клеток штамма IV8 составило 2,1x109 КОЕ/мл, что сооответствует 80,8% от начальной концентрации клеток лактобациллы. Различия между значениями содержания бактериальных клеток штамма IV72 были статистически не значимы. Оба штамма лактобациллы способны секретировать в среду внеклеточные гидролитические ферменты. Наибольшей активностью целлюлазы и амилазы (0,52±0,02 Ед./мл и 3,97±0,09 Ед./мл, соответственно) обладал штамм IV8: в 1,4 и 1,3 раза выше по сравнению с уровнем продукции данных ферментов у штамма IV72. Штамм IV72 характеризовался более высоким, по сравнению с штаммом IV8, уровнем биосинтеза протеазы, фитазы и липазы (соответственно 0,26±0,03 Ед./мл, 0,33±0,02 Ед./мл и 4,24±0,15 Ед./мл), активность которых была выше в 2,2, 1,7 и 1,6 раза, соответственно.

Ключевые слова: птицеводство, лактобактерии, Lactobacillus acidophilus, штамм, антагонистический потенциал, активность внеклеточных гидролитических ферментов, пробиотическая добавка, питательная среда, культивирование, антимикробный эффект.

Сведения об авторах:

Валиуллин Ленар Рашитович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела экологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии»; 143050, Московская область, Одинцовский район, р. п. Большие Вяземы, ул. Институт, вл. 5; тел.: 8-950-9698469; е-mail: valiullin27@mail.ru.

Мухаммадиев Ринат Салаватович, кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела экологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии»; научный сотрудник отдела биотехнологии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-987-4214127; е-mail: tanirtashir@mail.ru.

Тимербаева Разалия Рустамовна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры эпизоотологии и паразитологии ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»; 420029, г. Казань, ул. Сибирский Тракт, 35; тел. 8-903-3401420; е-mail: 8-903-3401420@mail.ru.

Каримуллина Ильсияр Габделгазизовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела вирусных и ультраструктурных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-904-7699225; е-mail: 89047699225@mail.ru.

Яруллин Айнур Ильнурович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, заведующий отдела вирусных и ультраструктурных исследований ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-905-3174170; е-mail: abii@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Мухаммадиев Ришат Салаватович, кандидат биологических наук, научный сотрудник отдела экологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии»; научный сотрудник отдела биотехнологии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, ул. Научный городок-2; тел.: 8-939-3728789; е-mail: tashir9891@mail.ru.