Влияние препарата бактериофага на условно-патогенную микрофлору бройлеров

УДК 619:636.5.033:578.347
DOI 10.33861/2071-8020-2023-2-37-40

Кривоногова А. С., Исаева А. Г., Донник И. М., Логинов Е. А., Мусихина Н. Б. Федеральное государственное
бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Уральский государственный
аграрный университет», г. Екатеринбург

Растущая проблема антимикробной резистентности возродила интерес к применению бактериофагов в терапии инфекционных патологий человека и животных, связанных с условно-патогенными и патогенными бактериями. Имеющиеся у бактериофагов эволюционно закрепленные механизмы проникновения в бактериальную клетку позволяют им эффективно поражать штаммы, устойчивые к химиопрепаратам, а видовая специфичность определяет целенаправленное действие бактериофагов на отдельных представителей микробиома, имеющих комплементарные рецепторы, избегая негативного влияния на полезную симбионтную микрофлору [2, 4]. Основным агентом фагов, разрушающим бактериальную клеточную стенку, являются эндолизины, гидролизующие молекулы пептидогликана. Фаговые лизины также находят применение в терапии [2]. К 2017 году в базы данных INSDC было депонировано более 25 000 нуклеотидных последовательностей бактериофагов [8, 13]. Для изготовления препаратов бактериофагов применяются только высоковирулентные фаги, обладающие лизирующим действием, и которые не содержат умеренных фагов, встраивающих свои гены в геном бактерии и не вызывающих её гибели. Благодаря этому минимизируется риск переноса фагами мобильных генетических детерминант резистентности бактерий, что особенно важно в терапии инфекций, вызванных устойчивыми к антибиотикам штаммами патогенов [2, 7, 10].

К числу наиболее распространенных бактериальных патогенов, связанными с домашней птицей, относятся Salmonella spp., E. coli, Campylobacter spp. и Clostridium spp. [12]. Кроме того, микробиоценозы продуктивной птицы и окружающей среды на птицеводческих предприятиях значительно контаминированы бактериями родов Staphylococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Acinetobacter. Исследования 5 препаратов бактериофагов для перорального введения, проведенные R.W. Miller, E.J. Skinner и соавторами (2010) на 900 цыплятах, инфицированных Clostridium perfringens, показали снижение смертности после обработки фагом на 92% по сравнению с контрольной группой [5]. Одна из вводимых рецептур (INT-401) также способствовала увеличению индексов роста, таких как увеличение уменьшение потери (WG) и индекса конверсии пищи (FCR), по сравнению с птицей в контрольной группе [11]. По данным I.B. Sklar и R.D. Joerger (2001), препарат бактериофага на порядок снижал бактериальную нагрузку Salmonella enterica у бройлеров, в том числе лизировал устойчивый к налидиксовой кислоте штамм Salmonella enterica, серовар Enteritidis (SeE Nalr) после двух недель лечения [12]. Колипротейные бактериофаги успешно использовали для терапии респираторных, менингеальных и септических форм коли-инфекции домашней птицы [1]. A. Gigante и R.J. Atterbury (2019) инфицировали штаммом E. coli (H247 K1+) трехнедельных цыплят, затем вводили внутримышечно препарат фага R в дозе 104 или 106 ПФУ. Фаг R характеризовался способностью размножаться в крови и проникать через гематоэнцефалический барьер. Смертность в группах, обработанных фагом, была нулевой, по сравнению со 100% в необработанной контрольной группе. Ни у одной из птиц, обработанных фагом, не было клинических признаков инфекции. Более того, отсрочка лечения фагом до очевидной клинической манифестации по-прежнему приводила к значительной защите, поскольку все цыплята контрольной группы погибли, а в опытной выживаемость составила 70% при позднем начале терапии. Также A. Gigante и R.J. Atterbury отмечали снижение смертности цыплят при профилактическом введении фага за два дня до заражения бактериями [9].

Результаты исследований D’Angelantonio и соавторов (2021) показали эффективность применения препаратов бактериофагов против Campylobacter jejuni у цыплят-бройлеров. Птице опытных групп вводили фаги на 38 и 39 сутки. После убоя бройлеров анализировали Campylobacter jejuni в содержимом слепой кишки и установили статистически значимое снижение обсемененности C. jejuni в обеих группах, получавших препарат, по сравнению с контрольной группой [6].

Спектр препаратов бактериофагов, разрешенных к применению в медицине и ветеринарии, позволяет использовать их для коррекции дисбиозов, лечения раневых инфекций, гнойно-септических патологий, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, в том числе метициллин-резистентными стафилококками (MRSA), ван-комицин-резистентными энтерококками (VRE), энтеробактериями, продуцирующими бета-лактамазы [2, 3]. При этом активно исследуются новые терапевтические подходы, включающие использование бактериофагов в качестве альтернативы антибиотикам либо дополнения к традиционным схемам антибиотикотерапии.

Материалы и методы исследований. Исследовали возможность применения бактериофагов в качестве альтернативы антибиотикам для нормализации микрофлоры желудочно-кишечного тракта у кур мясного кросса. Для опыта методом пар-аналогов было отобрано 30 цыплят кросса «Росс 308» из одной партии, цыплят разделили на две группы - опытную (I) и контрольную (II), обе группы поместили в стерильные боксы и содержали при одинаковых условиях до 56 суток. Кормление и поение проводили согласно технологическим инструкциям одинаково в обеих группах. В возрасте 26 суток у всех цыплят были взяты смывы из клоаки для микробиологического анализа. После этого в опытной группе цыплятам перорально давали препарат «Интести-бактериофаг» (НПО «Микроген», Россия) в дозе 1 мл/голову в сутки в течение 10 дней. Производителем заявлена активность препарата в отношении S. flexneri, S. sonnei, S. typhimurium, S. flexneri, Salmonella, Е. coli, Proteus, Enterococcus, Staphylococcus и Р. aeruginosa. Цыплята контрольной группы препарат не получали. Через 4 дня после завершения выпаивания (14 дней от начала опыта) повторно отобрали смывы с клоаки цыплят опытной и контрольной групп.

Микробиологические исследования проводили в соответствии с Национальным Стандартом ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010; Клиническими рекомендациями, утв. на Расширенном совещании Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (Москва, 15.05.2017 г.); Критериями для интерпретации категорий чувствительности по EUCAST: Clinical breakpoints - bacteria (v.10.0), по CLSI VET06.2017 1th edition. Для микробиологических исследований смывы забирали стерильным тампоном в транспортную среду CARY BLAIR. Биоматериал высевали методом истощающего посева на питательные среды. Засеянные чашки Петри инкубировали по стандартной методике с оценкой роста через 24, 48, 72 часа. Идентификацию выросших колоний производили методами классической микробиологии, а также методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, масс-спектры рибосомальных белков сравнивали с базой данных с использованием программного обеспечения Myla. Чувствительность к антибиотикам определяли следующими методами: диско-диффузионным и последовательных микроразведеий с определением минимальной подавляющей концентрации (МПК) по стандартной методике, описанной EUCAST и ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010. Математическую и статистическую обработку полученных результатов исследований проводили с использованием программ MS Excel и Statistica 10,0 параметрическими и непараметрическими методами. При нормальном распределении использовали t-критерий Стьюдента, в остальных случаях при анализе независимых выборок U-критерий (Манн-Уитни), при анализе зависимых выборок W-критерий (Вилкоксона).

Результаты исследований и их обсуждение. Проведенные микробиологические исследования в опытной группе (I) цыплят-бройлеров после применения бактериофага показали, что частота встречаемости S. aureus не изменилась, S. gallinarum -снизилась в 3,8 раза, а S. sciuri - снизилась почти в 1,9 раза. Изоляты E. faecium после применения препарата выявляли в биоматериале опытной группы в 1,2 раза реже. При этом другие представители энтерококков, такие как E. fecalis и E. cecorum, встречались чаще - в 2,3 и 1,6 раза, соответственно. Снизилась частота выявления изолятов Escherichia fergusonii - в 2,6 раза. При этом изоляты E. coli также обнаруживали реже, чем до применения бактериофага. Установили, что после опыта в биоматериале от цыплят из группы (I) увеличилась в 1,4 раза частота встречаемости изолятов Enterobacter spp., в 1,6 раза - коринебактерий C. xerosis и C. coyleae. В отношении Proteus spp. не установили значимой динамики, а представителей Klebsiella spp. в данном микробиоценозе после опыта не обнаружили (рисунок 1).

Рис. 1. Частота встречаемости изолятов в биоматериале от цыплят-бройлеров опытной группы до и после использования бактериофагов

Микробиологический анализ биоматериала цыплят-бройлеров в контрольной группе (II), в которой препарат бактериофага не применялся, показал, что частота встречаемости изолятов S. aureus, S. sciuri, Enterococcus spp., A. viridans и Candida spp. практически не изменилась. Тенденцию к увеличению выявили для изолятов Proteus spp. (в 1,2 раза), E. coli (в 1,5 раза), E. fergusonii (в 1,6 раза) и Klebsiella spp. (в 1,2 раза). При этом отметили снижение частоты обнаружения изолятов S. gallinarum, Enterobacter spp. и Corynebacterium spp. в среднем в 1,5-1,9 раза (рисунок 2).

Рис. 2. Частота встречаемости изолятов в биоматериале от цыплят-бройлеров контрольной группы до и после опыта

Средняя микробная обсемененность микробиоценозов после опыта с применением препарата, содержащего бактериофаги, в разных (опытной и контрольной) группах имела отличия в отношении Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Corynebacterium spp., Klebsiella spp., Proteus spp. и Escherichia spp. В опытной группе (I) обсемененность стафилококками составила 11x103 КОЕ/обра-зец, что в 2 раза меньше, чем в контрольной группе (II). В контрольной группе (II) также в 2,3 раза выше была обсемененность биоматериала изолятами Enterococcus spp. - 281,6x103 КОЕ/ образец. Количество КОЕ Corynebacterium spp. в опытной группе (I) было в 1,8 раза меньше, чем в контрольной (II). Изоляты Klebsiella spp. в микробиоценозе цыплят-бройлеров после проведенного опыта с бактериофагами в опытной группе (I) не встретились совсем, тогда как в контрольной группе (II) их численность составила 4,5x103 КОЕ/образец. Обсемененность кишечными палочками и Proteus spp. почти не изменилась (рисунок 3).

Рис. 3. Средняя микробная обсемененность биоматериала от бройлеров опытной и контрольной групп после применения бактериофагов

Анализировали чувствительность изолятов к антибиотикам с оценкой от 0 (резистентность) до 3 (чувствительность). Средняя чувствительность к антимикробным препаратам изолятов Staphylococcus spp. в опытной группе (I) до применения препарата с бактериофагами составила: к ципрофлоксацину - 1,8, энрофлоксацину - 2,1, меропенему - 2,5, доксициклину - 1,7, тобрамицину - 2,2 и ампициллину - 2,3. Наиболее часто изо-ляты стафилококков проявляли хорошую чувствительность (3) к ципрофлоксацину, меропенему, тобрамицину, ампициллину и эн-рофлоксацину, когда как к доксициклину большинство изолятов имели низкую чувствительность - 1. После проведения опыта средняя чувствительность к АМП у стафилококков к ципрофлоксацину, доксициклину, тобрамицину и энрофлоксацину увеличилась до 2,5, 2,0, 2,8 и 2,6 соответственно. К меропенему и ампициллину не изменилась. После опыта увеличилось количество изолятов, чувствительных к доксициклину (рисунок 4).

Рис. 4. Динамика средней антибиотикочувствительности изолятов Staphylococcus spp., выделенных в опытной группе (до и после применения препарата)

Средняя чувствительность к антимикробным препаратам выделенных изолятов стафилококков в контрольной группе (II) перед началом опыта составила: к ципрофлоксацину - 2,5, ме-ропенему - 2,6, доксициклину - 2,3, тобрамицину - 2,6, ампициллину - 2,1 и энрофлоксацину - 1,9. При повторном отборе проб биоматериала в контрольной группе, проведенном после завершения опыта, и тестировании изолятов на АБЧ, установили, что средняя чувствительность Staphylococcus spp. к ципрофлоксацину снизилась в 1,3 раза, к доксициклину - в 1,5 раза, а к меропенему, тобрамицину, ампициллину и энрофлоксацину почти не изменилась. В смывах до начала опыта, и в смывах после опыта высевали стафилококки, которые чаще всего имели хорошую чувствительность (3) ко всем исследованным антимикробным препаратам (рисунок 5).

Рис. 5. Динамика средней антибиотикочувствительности изо-лятов Staphylococcus spp., выделенных в контрольной группе (перед началом опыта и после завершения)

Анализ E. coli из биоматериала группы I, взятого до опыта, показал, что средняя чувствительность изолятов была максимальной к тобрамицину (2,4) и меропенему (2,3) и низкой к амоксициллину (0,9), левомицетину (0,3), и энрофлоксацину (0,6). После применения бактериофагов отметили тенденцию к увеличению средней чувствительности изолятов E. coli к тобрамицину, ме-ропенему, левомицетину и энрофлоксацину. Чувствительность к амоксициллину и цефазолину, напротив, снизилась (рисунок 6).

Рис. 6. Динамика средней антибиотикочувствительности изоля-тов E. coli, выделенных в опытной группе (до и после применения препарата)

В контрольной группе (II) средняя чувствительность изолятов E. coli к АМП до опыта составила: к тобрамицину - 1,8, к меропе-нему - 2,6, к амоксициллину - 0,6, к левомицетину - 0,9, к цефа-золину - 1,7 и к энрофлоксацину - 0,9. После опыта отметили тенденцию к улучшению средней восприимчивости к тобрамицину и меропенему (до 2,2 и 2,8, соответственно) на фоне снижения чувствительности изолятов к остальным антибиотикам. До опыта мода чувствительности к тобрамицину и цефазолину составляла 2,0, к меропенему - 3,0, а к оставшимся - 0. В тестах изолятов, взятых после опыта, мода увеличилась у левомицетина до 1,0, а у цефазолина снизилась до 1,0 (рисунок 7).

В опытной группе (I) наблюдали тенденцию к снижению частоты встречаемости мультирезистентных к антимикробным препаратам изолятов (MDR) E. coli - она уменьшилась в 1,6 раза, что могло свидетельствовать об изменении соотношения резистентных и восприимчивых штаммов в кишечном микробиоценозе после применения фагов.

Рис. 7. Динамика средней антибиотикочувствительности изо-лятов E. coli, выделенных в контрольной группе (перед началом опыта и после завершения)

В контрольной группе (II) цыплят-бройлеров встречаемость MDR-изолятов в биоматериале, взятом после завершения опыта, выросла: Staphylococcus spp. - в 2,5 раза, а E. coli - в 1,4 раза (рисунок 8). Результаты полученных данных могут косвенно свидетельствовать о быстром росте числа бактерий, имеющих фенотипическую резистентность к антибиотикам в кишечном микробиоме. Предположительно, увеличение количества муль-тирезистентных к антимикробным препаратам изолятов связано с численным ростом популяции Staphylococcus spp. и E. coli, а также с горизонтальным переносом генов резистентности между бактериями в пределах смежных локусов микробиома, что согласуется с имеющимися в литературе данными [7, 10].

Рис. 8. Частота встречаемости мультирезистентных изолятов

Перед убоем на 56 сутки анализировали живой вес цыплят опытной и контрольной групп (табл. 1).

Таблица 1 Живой вес бройлеров опытной и контрольной групп перед убоем на 56 сутки, г

В опытной группе средний вес составил 3 997 г, а в контрольной - 3 847 г, разница составила 149,6 г. При этом разброс между крайними значениями в контрольной группе был больше (2 160 г), чем в опытной (1 736 г), а медианное значение - меньше (3 640 в контрольной группе и 3 930 в опытной). Таким образом, живой вес бройлеров опытной группы характеризовался большей однородностью при положительной разнице в среднем значении.

Заключение. Проведенные исследования показали, что применение препарата бактериофага у цыплят-бройлеров оказало влияние на частоту встречаемости изолятов условно-патогенной микрофлоры в биоматериале. После опыта реже выявляли изоляты Staphylococcus spp., Enterococcus faecium, Escherichia fergusonii, а изоляты Klebsiella spp. в пробах после применения бактериофагов не обнаруживали. Также выявили тенденцию к изменению частоты встречаемости у Corynebacterium spp., Aerococcus viridans, Candida spp. В биоматериале, взятом после окончания опыта в опытной (I) и контрольной группах (II), установили различия обсемененности Staphylococcus spp. и Enterococcus faecium - в опытной (I) группе она была в среднем в 2 раза ниже, чем в контрольной (II). Полученные данные согласуются с заявленной производителем активностью бактериофага, однако виды бактерий в пределах одного рода имели разную восприимчивость к препарату, о чем косвенно свидетельствовали отличия в динамике обсемененности и частоты встречаемости изолятов. Средняя антибиотикочувствительность изолятов Staphylococcus spp. и E. coli, выделенных из биоматериала до и после опыта в обеих группах имела отличия. Изоляты Staphylococcus spp., выявленные после применения препарата с бактериофагами в опытной группе (I), проявляли более высокую чувствительность к ципрофлоксацину, доксициклину, тобрамицину и энрофлоксацину, чем изоляты, выделенные до начала опыта. В контрольной группе отметили снижение восприимчивости стафилококков к ципрофлоксацину и доксициклину. Количество MDR-изолятов Staphylococcus и E. coli снизилось в опытной группе и увеличилось в контрольной. Анализ живого веса бройлеров перед убоем показал, что применение препарата бактериофага не имело негативного влияния на данный показатель, и наоборот, среднее значение живого веса цыплят было выше на 149 г в опытной группе, получавшей бактериофаг. Таким образом, использование бактериофагов у продуктивной птицы мясных кроссов может быть перспективным для коррекции микробиоценозов и снижения их обсеменённости изолятами, резистентными к антибиотикам, а также для профилактики дисбиозов.

Исследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 18-16-00040 П).

Список литературы:

1. Барроу, П. Использование литического бактериофага для борьбы с экспериментальной септицемией и менингитом, вызванным кишечной палочкой, у цыплят и телят / П. Барроу, М. Ловелл, А. Беркьери // Клин. Диагн. Лаб. Иммунол. -1998. - № 5 (3). - C. 294-298.

2. Перепанова, Т. С. Терапевтическое применение бактериофагов: назад в будущее / Т. С. Перепанова, А. В. Казаченко, П. Л. Хазан, Ю. А. Малова // Клиническая микробиология и антимикробная терапия. - 2021. - Т. 23. - № 1. - C. 55-64.

3. Bacteriophage EF-P29 Efficiently Protects against Lethal Vancomycin-Resistant Enterococcus faecalis and Alleviates Gut Microbiota Imbalance in a Murine Bacteremia Model / M. Cheng, J. Liang, Y. Zhang [et al.] // Front Microbiol. - 2017. -No. 8. - p. 837.

4. Bacteriophage receptors, mechanisms of phage adsorption and penetration into host cell / D. V. Rakhuba, E. I. Kolomiets, E. S. Dey, G. I. Novik // Pol J Microbiol. -2010 - Vol. 59. - pp. 145-155.

5. Bacteriophage therapy for control of necrotic enteritis of broiler chickens experimentally infected with Clostridium perfringens. / Miller, R.W.; Skinner, E.J.; Sulakvelidze, A.; Mathis, G.F.; Hofacre, C.L. // Avian Dis.- 2010. - 54.- 33-40.

6. Bacteriophage Therapy to Reduce Colonization of Campylobacter jejuni in Broiler Chickens before Slaughter/ D. D’Angelantonio, S. Scattolini, A. Boni [et al.] // Viruses. - 2021. - Vol. 13 (8). - pp. 14-28.

7. Forecasting the dissemination of antibiotic resistance genes across bacterial genomes / M.M.H. Ellabaan, C. Munck, A. Porse [et al.] // Nature Communications. -2021. - No. 12.

8. Kakasis A., Panitsa G. Bacteriophage therapy as an alternative treatment for human infections. A comprehensive review. - Int J Antimicrob Agents. - 2019. -No. 53 (1) - pp. 16-21.

9. Gigante A., Atterbury R. J. Veterinary use of bacteriophage therapy in intensively-reared livestock. - Virol J. - 2019. No. 16 (1). - p. 155.

10. Lerminiaux N. A., Cameron A. D. S. Horizontal transfer of antibiotic resistance genes in clinical environments. - Canadian Journal of Microbiology. - 2019. -No. 65 (1). - p. 34-44.

11. Phage Therapy in Veterinary Medicine / R. Loponte, U. Pagnini, G. Iovane, G. Pisanelli // Antibiotics. - 2021. - No. 10 (4). - p. 421.

12. Sklar I. B., Joerger R. D. Attempts to utilize bacteriophage to combat Salmonella Enterica Serovar Entemtidis infection in chickens. - J. Food Saf. - 2001. -21. - p. 15-29.

13. Wernicki A., Nowaczek A., Urban-Chmiel R. Bacteriophage therapy to combat bacterial infections in poultry. - Virol J. - 2017. - No. 14 (1). - p. 179.

Сведения об авторах:

Кривоногова Анна Сергеевна, доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВО «Уральский государственный аграрный университет»; 620075, г. Екатеринбург, ул. К. Либкнехта,42; тел.: 8-343-371-33-63; e-mail: tel-89826512934@yandex.ru.

Донник Ирина Михайловна, доктор биологических наук, профессор, академик РАН, заведующий кафедрой инфекционной и незаразной патологии ФГБОУ ВО «Уральский государственный аграрный университет»; 620075, г. Екатеринбург, ул. К. Либкнехта, 42; тел.: 8-343-371-33-63; e-mail: ktqrjp7@yandex.ru.

Логинов Егор Александрович, аспирант факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО «Уральский государственный аграрный университет»; 620075, г. Екатеринбург, ул. К. Либкнехта, 42; e-mail: loginov.ea19@gmail.com.

Мусихина Нина Борисовна, старший преподаватель кафедры инфекционной и незаразной патологии ФГБОУ ВО «Уральский государственный аграрный университет»; 620075, г. Екатеринбург ул. К. Либкнехта, 42, e-mail: musikhina83@mail.ru.

Резюме. Исследовали возможность применения бактериофагов для коррекции состава микробиоценоза желудочно-кишечного тракта у цыплят-бройлеров. Опытной группе цыплят выпаивали препарат, содержащий бактериофаги, активные против условно-патогенных и энтеропатогенных бактерий - S. flexneri, S. sonnei, S. typhimurium, S. flexneri, Salmonella, Е. coli, Proteus, Enterococcus, Staphylococcus и Р. aeruginosa. Установили, что использование препаратов бактериофага оказывало положительный эффект на состав микрофлоры кишечника бройлеров, уменьшая в его структуре долю клинически значимых условно-патогенных бактерий, в том числе, имеющих резистентность к антибиотикам. После использования бактериофагов снизилась частота встречаемости изолятов Staphylococcus spp., Enterococcus faecium, Escherichia fergusonii, Klebsiella spp. в биоматериале цыплят опытной группы. В опытной группе увеличилась средняя чувствительность изолятов Staphylococcus spp. после применения бактериофагов - к ципрофлоксацину - в 2,5 раза, к доксициклину - в 2, к тобрамицину - в 2,8 раза и к энрофлоксацину - 2,6 раза. В контрольной группе отметили снижение восприимчивости стафилококков к ципрофлоксацину и доксициклину. Количество MDR-изолятов Staphylococcus и E. coli снизилось в опытной группе и увеличилось в контрольной. При этом у получавших бактериофаг бройлеров была отмечена положительная тенденция увеличения живой массы к сроку убоя. При этом среднее значение живого веса было выше на 149 г в опытной группе, получавшей бактериофаг. Таким образом, использование бактериофагов у продуктивной птицы мясных кроссов может быть перспективным для коррекции микробиоценозов и снижения их обсеменённости изолятами, резистентными к антибиотикам, а также для профилактики дисбиозов.

Ключевые слова: poultry farming, broiler chickens, meat cross, bacteriophage, antimicrobial resistance, intestinal microflora, microbial contamination, opportunistic bacteria, enteropathogenic bacteria, microbiocenosis, isolate.

Ответственный за переписку с редакцией: Исаева Альбина Геннадьевна, доктор биологических наук, доцент, профессор кафедры инфекционной и незаразной патологии, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Уральский государственный аграрный университет»; 620075, г. Екатеринбург, ул. К. Либкнехта, 42; тел.: 8-343-371-33-63; e-mail: isaeva.05@bk.ru.