Диаrностика гриппа: опередить инфекцию

А.Д. 3абережный, Т.В. Гребенникова, Т .И. Aлипер, НПО НАРВАК, Москва

Вирус гриппа А широко распространен в природе, поражает многие виды млекопитающих и птиц, в основном водного и око­ловодного комплекса, и способен вызывать эпидемии, пандемии и эпизоотии. Вирус гриппа А отличается высокой степенью вариа­бельности, особенно это касается поверхностных гликопротеинов вириона: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Известно 16 антигенных подтипов гемагглютинина (Н1-Н16) и 9 подтипов нейраминидазы (N1-N9). От диких птиц изолированы вирусы со всеми известными сочетаниями поверхностных белков, при этом инфекция у диких птиц протекает в виде энтерита, без видимых признаков заболевания. Это указывает на высокую степень адап­тации вирусов гриппа А к диким птицам, которые являются естес­твенными хозяевами вирусов гриппа. Вирус сохраняется в воде в течение длительного времени (6-8 месяцев), а водно-фекальный путь инфицирования является основным механизмом поддержа­ния персистенции вируса гриппа в природе, откуда вирус проника­ет в популяции домашних животных.

Отличительной особенностью вируса гриппа является его спо­собность к реассортации, в результате которой появляются новые варианты.

За последние 45 лет описано свыше 30 эпизодов возникновения эпизоотий среди домашних животных в ряде случаев сопровожда­ющихся заболеванием людей, подчас с высокой смертностью.

Вирусы H5N1 периодически выделялись от кур и других ви­дов птиц. В 1997 году в Гонконге отмечена вспышка заболевания, обусловленная прямой передачей вируса гриппа птиц H5N1 от кур человеку. Это был первый подтвержденный случай передачи ви­руса гриппа от птиц человеку. В результате заболело 18 человек, 6 из которых умерли. В Юго-Восточной Азии с тех пор подтвержде­ны случаи инфицирования людей вирусом гриппа птиц, при этом смертность достигала 85%. Теперь мы видим повторение подоб­ной картины в Турции.

Особо следует отметить отсутствие во всех случаях передачи вирусов от человека к человеку.

Разработка средств молекулярной диагностики для вируса гриппа А

Угроза возникновения новой пандемии, предупреждение за­носа и распространения возбудителя высоко патогенных вирусов гриппа на территории нашей страны требует проведения монито­ринга среди людей, домашних и диких животных с использовани­ем современных средств диагностики.

Молекулярные методы диагностики являются быстрыми, высоко­чувствительными и специфичными при определении вируса гриппа А птиц и его подтипов. В НПО НАРВАК разработан комплекс молекуляр­ных методов для определения вируса гриппа А, которые могут явить­ся источником будущих пандемий, опасных для человека.

Тест-система для определения РНК вируса гриппа А методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Разработанная тест-система для определения вируса гриппа А в сыворотках человека и животных методом ПЦР, является уни­версальной для животных и человека и позволяет определять РНК вируса гриппа А в различных биологических образцах животных и человека.

Тест-система для определения и дифференциации РНК вируса гриппа А подтипов Н5 и Н7 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Разработанная тест-система позволяет не только определять РНК вируса гриппа А в биологических образцах, но и дифферен­цировать Н5 и Н7 от других подтипов вируса гриппа А.

Тест-система для определения РНК вируса гриппа А подтипа Н5 методом ПЦР в реальном времени
Разработанная тест-система "ПЦР В реальном времени" позво­ляет проводить количественное определение вируса. Кроме того, это чувствительный, быстрый и более технологичный метод, ко­торый может быть использован для массового анализа образцов от человека и животных на наличие РНК разных подтипов вируса гриппа А. Метод с успехом апробировался при скрининге полевого материала, что позволяет рекомендовать его для массового изуче­ния образцов, полученных от животных и человека.
Описанные тест -системы успешно прошли Государственные конт­рольные испытания и имеют сертификационные документы.

Новейшие разработки в области диагностики гриппа
Одной из современных технологий является создание микро­чипов (биочипов), основанных на гибридизации нуклеиновых кислот. Данная технология разработана совместно НПО НАРВАК, НИИ вирусологии им. Ивановского РАМН, НИИ молекулярной биологии им. Энгельгарда РАН для определения и дифференциа­ции вируса гриппа А подтипов Н1-Н15, N1-N2. По затратам средств и времени один биочип эквивалентен 17 реакциям (ПЦР). Считыва­ние и документирование происходит с использованием специаль­ного прибора, который сравнивает каждый зонд с положительным и отрицательным контролем. В результаты применения микрочипа для анализа образцов из Новосибирской области в 2005 г. сразу было установлено, что это H5N1. Внедрение нового метода требует дополнительных испытаний.

Анализ первичной структуры генома вирусов гриппа (секвенирование)

Вирус гриппа генетически чрезвычайно изменчив и этим опа­сен. Изменения свойств вируса могут происходить как из-за из­менения генов (мутации), так и в ходе обмена генами (реассор­тация). Генетический материал вируса состоит из 8 несвязанных фрагментов РНК. При попадании в организм двух вирусов гриппа одновременно, они с легкостью обмениваются соответствующими фрагментами РНК, следя лищь за тем, чтоб у каждого вируса был полный набор фрагментов. Поэтому всегда есть угроза появления опасных гибридов: в 1918 г. это был H1N1, а сегодня это может быть H5N1. ДЛЯ лучшего понимания и прогнозирования ситуации, для изучения происхождения и эволюции штаммов вируса гриппа при­меняют метод секвенирования, Т.е. молекулярного "чтения" вирус­ных генов. Метод появился на рубеже 70-80х годов 20 века. Се­годня секвенирование фрагментов вирусного генома является уже почти обязательным требованием при возникновении новых или спорных вирусных вариантов. Для вируса гриппа установлено, что его патогенность связана с последовательностью аминокислотных остатков в Т.Н. "сайте разрезания" гемагглютинина (Н). Поэтому се­годня этот сай,Т всегда определяют у выделяемых вирусов гриппа. Раньше у птиц на территории России находили вирус подтипа Н5 с "сайтом разрезания" как у низко патогенных штаммов. Сегодняш­ний возмутитель спокойствия (H5N1) имеет "сайт разрезания" та­кой же как у высоко патогенных штаммов. Неудивительно, что он оказывается патогенным для домашней птицы.

Грипп остается непредсказуемой и опасной инфекцией. Имея своим природным резервуаром дикую водоплавающую птицу, он неизбывно будет пребывать в соседстве с человеком. Поэтому за­дача сегодняшнего и завтрашнего дня - опередить инфекцию и за­щититься от нее раньше, чем она примет новые формы.