Сравнительная характеристика штаммов Bacillus Subtilis как перспективных кандидатов в пробиотики для животноводства

УДК 579.64
DOI 10.33861/2071-8020-2024-5-23-27

Мухаммадиев Риш. С., Мухаммадиев Рин. С. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский
научноисследовательский институт фитопатологии», Московская область / Федеральное государственное
бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической
безопасности», г. Казань
Каримуллина И. Г., Шангараев Р. И., Мухаммадиева А. С., Акбашев И. Р., Сорокина Д. А., Хусаинова Г. И. Федеральное
государственное бюджетное научное учреждение «Федеральный центр токсикологической, радиационной
и биологической безопасности», г. Казань

Микробная экосистема (микробиота) пищеварительной системы сельскохозяйственного животного участвует в процессе поддержании здорового состояния и нормального функционирования его организма [1, 18]. При этом ингредиенты, которые используются в составе рациона животного, утилизируются за счет метаболической способности микроорганизмов, населяющих его желудочно-кишечный тракт [17, 36]. В современных условиях интенсификации животноводства, включая птицеводства, повышается риск возникновения нарушений микроэкологии кишечника (дисбиотическое состояние) у молодняка сельскохозяйственных животных на фоне использования низкого качества рациона и воздействия отрицательных факторов внешней среды [12, 21]. Нарушения структуры кишечного микробиоценоза, которые характеризуются низким разнообразием и количеством уникальных видов бактерий, способствуют развитию различных инфекций [37].

В промышленном животноводстве в качестве средств предотвращения и лечения инфекций животных активно используются антибиотики [16, 21]. В этом плане наиболее применяемыми классами антибиотических препаратов являются макролиды, тетрациклины, сульфонамиды, фторхинолоны, аминогликозиды, в-лактамные и полиеновые антибиотики и другие [3]. Установлено, что активное использование указанных средств в субингибирующих количествах существенно способствует дестабилизации генома бактерий, повышая вирулентность или диссеминацию их генетического материала, который связан с резистентностью [3, 39]. Устойчивые к антибиотикам бактерии могут обнаруживаться продуктах животноводства, включая социально значимых (мясо, яйца и другие) [6, 32], что, в свою очередь, увеличивает риск горизонтального переноса генов резистентности условно-патогенных и патогенных бактерий в микробиом человека. Исследователями экспериментально подтверждено факт передачи клинически важными антибиотикрезистентными генами между сельскохозяйственными животными и сотрудниками ферм [3, 24]. В связи с этим для коррекции дисбиотических состояний кишечника сельскохозяйственных животных и в качестве альтернативы антибиотическим средствам исследователями были предложены пробиотики [11, 18].

Согласно данным группы экспертов Международной научной ассоциации пробиотиков и пребиотиков (International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics, ISAPP), пробиотики определяются как живые идентифицированные организмы, которые в достаточных концентрациях оказывают положительный эффект на здоровье хозяина [8]. В существенной степени в состав указанных препаратов входят микроорганизмы, принадлежащие к родам Lactococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Enterococcus и

Streptococcus [7, 14]. К настоящему времени выявлено, что проявлять пробиотические свойства способны и виды спорообразующих бактерий, принадлежащие к роду Bacillus, которые, отличаясь биологическими особенностями от остальных микроорганизмов-пробиотиков, имеют ряд преимуществ при их использовании [11, 16].

Пробиотический штамм микроорганизма в составе пробиотика обладает индивидуальными метаболическим потенциалом и характеризуется определенной эффективностью [12, 13]. Поэтому особое внимание исследователи отводят поиску новых микробных штаммов и характеристике биологических особенностей последних [11, 14]. В этом плане поливидовой или полиштаммовый пробиотик потенциально способен обеспечивать разные способы воздействия, приводя к синергетическому эффекту [14, 10].

В Федеральном центре токсикологической, радиационной и биологической безопасности (ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ») и Всероссийском научно-исследовательском институте фитопатологии (ФГБНУ ВНИИФ) изолированы спорообразующие штаммы B. subtilis МР2 и B. subtilis RF-45 - продуценты биологически активных метаболитов.

Целью настоящей работы было сравнительно оценить биологические свойства спорообразующих штаммов B. subtilis МР2 и RF-45, их потенциал как кандидатов в пробиотики для животноводства.

Материалы и методы исследований. Объектами исследований были спорообразующие штаммы B. subtilis МР2 и RF-45, которые изолированы из природных источников экониш Республики Татарстан (Россия) и Московской области (Россия). Их физиолого-биохимические особенности, идентификация, способность к продукции внеклеточных гидролаз, а также некоторые другие свойства in vitro и in vivo были установлены нами ранее [27, 28]. Бациллярные культуры поддерживали и выращивали, используя соответственно среду LB-агар или LB-бульон (Luria Bertani) (Condalab, Испания). Тест-культурами служили бактерии Staphylococcus aureus (грамположительные), Escherichia coli, S. enterica (грамотрицатель-ные) и грибы F. graminearum, F. moniliforme, F. sporotrichioides (из коллекций ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» и ФГБНУ ВНИИФ).

Антимикробный потенциал исследуемых спорообразующих бактерий относительно возбудителей различных инфекций сельскохозяйственных животных определяли с помощью метода диффузии в агар [14]. Для этого отделяли бактериальные клетки от супернатанта (далее, БС) бацилл путем центрифугирования культуральной жидкости (далее, КЖ) при 3.8 тыс. g в течение 12 мин. Клетки бактерий суспендировали, применяя стерильный физиологический раствор, с целью получения их клеточной суспензии (далее, КС) [14, 23]. Далее вносили по 100 мкл КС, КЖ или БС спорообразующих бактерий в лунки (диаметр 10 мм) агара с тест-культурой. Инкубацию осуществляли при температуре (35,0±1,0)°C в течение 24 ч. Степень антимикробного потенциала бацилл устанавливали согласно зоне задержки роста возбудителя различных инфекций животных вокруг лунок.

Антимикробный потенциал бацилл относительно токсин-обра-зующих грибов осуществляли с помощью способа, который был описан нами в более раннем исследовании [27]. Анализ степени антагонистической активности бациллярных штаммов оценивали согласно размеру зоны ингибирования тест-грибов.

Имитацию процесса транзита спор бациллярных штаммов по пищеварительной системе животного in vitro осуществляли последовательным их выдерживанием в среде LB-бульон с пепсином (Sigma-Aldrich, США) (рН 2.5) (соответствует желудку) и бычьей желчью (pH 7,5) (Merck, США) (соответствует кишечнику) в течение 3 и 8 ч соответственно [11]. Содержание жизнеспособных клеток (КОЕ/мл), которые прорастали из спор бацилл, анализировали способом последовательных 10-кратных разведений с использованием LB-агара.

Анализ адгезивной способности бацилл осуществляли in vitro с помощью клеток линии НТ-29 [22, 35].

Установление гемолитической активности бациллярных штаммов проводили, используя Колумбийский (кровяной) агар (Conda, Испания) [35, 38].

Поиск генов, которые кодируют различные токсины, в бациллах проводили методом, описанным нами в более раннем исследовании [28].

Эксперименты, в которых использовались лабораторные животные (мыши), осуществляли строго, опираясь на принципы Европейской Конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986), а также требования, определенные в Директиве Европейского Парламента и Совете Европейского Союза [15].

Определение эффективности исследуемых в работе бацилл в коррекции нарушений кишечной микроэкологии животных осуществляли на 36 белых мышах (живая масса 19-21 г.), используя модель дисбактериоза, индуцированного антибиотическим препаратом гентамицином [19]. Мышей с гентамицин-ассоциирован-ным дисбиозом разделяли на 4 равные группы:

• группа № 1 - животные, получавшие per os 0,1 мл суспензии спор B. subtilis МР2 в количестве (4,70±0,35)х109 КОЕ/животное в течение 8 суток;
• группа № 2 - животные, получавшие per os 0,1 мл суспензии спор B. subtilis RF-45 в количестве (4,70±0,26)х109 КОЕ/животное в течение 8 суток;
• группа № 3 - животные, получавшие per os 0,1 мл суспензии спор B. subtilis МР2 и B. subtilis RF-45 в количестве (4,70±0,31)х109 КОЕ/животное в течение 8 суток;
• группа № 4 - 0,5 мл физиологического раствора.

На последние сутки исследования осуществляли патологоанатомическое вскрытие мышей всех групп с целью забора из толстой кишки их фекальных масс. В фекалии животных количественно (КОЕ/мл) анализировали различные группы микроорганизмов методом последовательных 10-кратных разведений фекальной суспензии с последующим переносом ее в соответствующие питательные среды [9, 14].

Статистическую обработка полученных после экспериментальных исследований данных проводили, используя стандартные методики, как описано нами ранее [4].

Результаты исследований и их обсуждение. В настоящей работе анализировали антимикробный потенциал КС, КЖ и БС спорообразующих штаммов B. subtilis МР2 и RF-45 против видов бактерий - возбудителей различных инфекций сельскохозяйственных животных, а также микромицетов, способных к продукции фузариотоксинов. Установлено, что КЖ и БС исследуемых бацилл характеризовались ингибирующим эффектом относительно всех использованных в нашем исследовании тест-бактерий. Тем не менее, по сравнению с штаммом МР2, B. subtilis RF-45 на 8,18-18,07 % эффективнее подавлял рост тест-бактерий (рисунок 1).

Рис. 1. Антимикробный потенциал КС, КЖ и БС штаммов B. subtilis МР2 (слева) и RF-45 (справа) относительно бактерий-возбудителей различных инфекций сельскохозяйственных животных (различия между значениями антагонистической активности КЖ и антагонистической активности БС бацилл статистически не значимы при p=0,05)

Следует отметить, что в условиях эксперимента КС бацилл не проявляла антагонистического влияния на S. aureus, E. coli и S. enterica.

Бациллярные штаммы проявляли антагонистические свойства относительно токсинобразующих микромицетов (табл. 1) [27], при этом в случае штамма RF-45 отмечали его более высокий анти-грибной потенциал.

Таблица 1 Антимикробный потенциал бациллярного штаммов МР2 в отношении токсинобразующих микромицетов

Способность штаммов B. subtilis МР2 и RF-45 подавлять рост не только условно-патогенных и патогенных бактерий, но и видов микромицетов Fusarium spp. является одной из основных характеристик пробиотиков, в связи с тем, что корма могут заражаться грибами-продуцентами микотоксинов, которые потенциально способствуют развитию дисбиотических изменений кишечной микробиоты сельскохозяйственных животных [11]. Наличие антимикробного потенциала изучаемых бацилл в отношении использованных в нашем исследовании тест-микроорганизмов безусловно связано с их способностью продуцировать ряд биологически активных метаболитов. Ранее нами было показано, что бациллярный штамм МР2 образует экзополисахариды, бактерио-цины сидерофоры и ферменты [28], а штамм RF-45 - гидролазы [27]. В литературе указывается, что уникальность представителей вида Bacillus subtilis заключается в том, что около 5 % их генома кодирует образование разных противомикробных соединений [33]. Антибактериальный и антигрибной потенциал данных спорообразующих бактерий связан с их способностью к синтезу летучих соединений (CO2, H2S, HCN, NH3, жирные кислоты, терпеноиды), поликетидов (диффицидин, бациллаен, макролактин), гидролитических ферментов (лактоназа, хитозаназа, целлюлаза, глюканаза, протеаза) и многих других метаболитов [11, 33].

Одним из основных факторов, который способен ограничивать применение в животноводстве штаммов микроорганизмов - потенциальных кандидатов в пробиотики, является устойчивость последних к пищеварительным стрессам [10, 12]. Некоторые штаммы, обладающие пробиотическими свойствами, утрачивают существенную часть (до 90%) своего функционального потенциала вследствие воздействия на них пищеварительных ферментов и кислот желудка, высокой осмолярности среды, недостатка источников питания, солей желчных кислот кишечника животного [5, 37].

После последовательного инкубирования спор B. subtilis МР2 и RF-45 в питательной среде с пепсином (рН 2,5) в течение 3 ч и бычьей желчью (рН 7,5) в течение 8 ч их жизнеспособность находилась на уровне контроля (концентрации спор бактерий в начале нашего исследования) (рисунок 2).

Рис. 2. Жизнеспособность спор штаммов B. subtilis МР2 и RF-45 в условиях in vitro, имитирующих процесс их транзита по пищеварительной системе животного (различия между значениями концентрации спор бацилл статистически не значимы (р>0,05))

Обеспечение колонизационной резистентности слизистой оболочки кишечника по отношению к возбудителям кишечных инфекций животного является значимым свойством пробиотиков [22, 35]. Нами показано, что споры исследуемых штаммов бацилл обладали способностью адгезироваться на клетках линии НТ-29. При этом наиболее высокий показатель адгезии выявлен у B. subtilis МР2: после инкубации в течение 2 ч при 37,0°С количество адгезированных на клетках колоректального рака жизнеспособных его спор было выше в 1,87 раза относительно значений данного показателя спор штамма RF-45 (табл. 2).

Таблица 2 Сравнительная характеристика некоторых пробиотических свойств бациллярных

Примечание: «-» - отсутствие признака; * - результаты исследования представлены в более ранней нашей работе [28]; различия статистически значимы при p<0,05

В изученной нами литературе указано, что по сравнению с пробиотическими микроорганизмами, характеризующимися низким уровнем адгезии, высокоадгезивные бактерии, закрепляясь на поверхности колоноцитов, более эффективно выполняют свои функциональные свойства, тем самым, оказывают положительное воздействие на рост организма животного и устойчивость последнего к различным инфекционным агентам. [2].

Несмотря на то, что штаммам Bacillus subtilis присвоен статус QPS Qualified Presumption of Safety), их безопасность должна быть подтверждена в исследованиях in vitro и in vivo [11, 35]. В наших исследованиях безопасность B. subtilis МР2 и RF-45 была протестирована по направлению поиска факторов патогенности и генов, кодирующих энтеротоксины и цитотоксин K.

Оба изучаемых штамма бацилл не характеризовались гемолитической активностью, а также не несли гены синтеза токсинов (hbl, nhe и cytK) (табл. 2) [29], что указывает о их потенциальной безопасности.

Схожие результаты были получены зарубежными исследователями, которые не выявили у изолированных из кимчи и почвы штаммов B. subtilis P223 и BS50 генов, ответственных за продукцию энтеротоксинов и цитотоксина K [34, 35].

Необходимо отметить, что наличие активности гидролитических ферментов (ксиланазы, целлюлазы, пектиназы, амилазы, фитазы, протеазы и липазы) у B. subtilis МР2 и RF-45 [27, 28] свидетельствует о их возможной способности нормализовать процессе пищеварения: повышать перевариваемость (гидролиз) компонентов рациона, содержащих некрахмалистые полисахариды (антипита-тельные факторы), способствуя увеличению всасывания питательных веществ кишечником сельскохозяйственных животных.

Важным этапом при разработке пробиотиков является оценка их эффективности на модельных животных. В настоящей работе изучали эффективность B. subtilis МР2 и/или RF-45 при нормализации нарушений микроэкологии кишечника у белых мышей с дисбиозом, индуцированным антибиотиком гентамицином. Для инициации у животных дисбиоза животным вводили антибиотик per os в дозе 5,8 мг/ сутки в течение 7 дней. В результате применения гентамицина отмечали существенное снижения содержания основных представителей (бифидобактерий (БФ), лактобактерий (ЛК) и кишечной палочки (КП)), а также общего количества микроорганизмов (ОМЧ) кишечной микробиоты животных опытных и контрольной групп (табл. 3).

Таблица 3 Численность микроорганизмов (КОЕ/г [lg N]) в содержимом кишечника белых мышей гентамицин-индуцированным дисбиозом

Примечание: различия статистически значимы при p<0,05

Установлено, что раздельное или совместное выпаивание спор бациллярных штаммов приводило к повышению численности ОМЧ, БФ, ЛК и КК в содержимом кишечника животных с гента-мицин-индуцированным дисбиозом. При этом в группе мышей, которые получали суспензию спор штамма RF-45, содержание кишечной палочки было больше в 1,02 раз, бифидобактерий - в 1,12 раза, лактобактерий - 1,04 раза относительно значений указанного показателя группы животных, получавших суспензию спор штамма МР2 (рисунок 3).

Рис. 3. Сравнительная оценка эффективности B. subtilis МР2 и/или RF-45 при нормализации нарушений микроэкологии кишечника у белых мышей с гентамицин-ассоциированным дисбиозом (различия между значениями ОМЧ в содержимом кишечника животных 1 группы и ОМЧ в содержимом кишечника животных 2 группы не значимы (р>0,05))

В ряде работ отечественных и зарубежных исследователей показано, что штаммы Bacillus subtilis способны стимулировать рост бактериальных клеток представителей семейства Lactobacillaceae [26, 30, 31]. Некоторыми исследователями подтверждена взаимосвязь вышеуказанного эффекта со способностью Bacillus subtilis образовывать циклические дипептиды [25] и различные белки (субтилизин, каталаза, супероксиддисмутаза, амилаза и протеаза) [26, 29].

Более низкая эффективность B. subtilis МР2 при нормализации нарушений микроэкологии кишечника у мышей с дисби-озом, по-видимому, обусловлена пониженным пробиотическим потенциалом бациллы.

Полученные нами данные указывают на более высокую эффективность полиштаммовых пробиотиков по сравнению с моно-штаммовыми пробиотиками как средствами терапии кишечных инфекций животных, что, вероятно всего, связано со способностью входящих в их состав различных штаммов обеспечивать разные способы воздействия, приводя к синергетическому эффекту.

Заключение. Таким образом, штаммы B. subtilis МР2 и RF-45 обладали антимикробным потенциалом против патогенных и условно-патогенных бактерий и токсинпродуцирующих микромицетов, что может быть связано с действием биологически активных метаболитов, включая гидролитических ферментов. Споры обоих бацилл сохраняли жизнеспособность в условиях in vitro, имитирующих процесс их транзита по пищеварительной системе животного, характеризовались способностью адгезироваться на клетках линии НТ-29 и эффективностью при нормализации нарушений микроэкологии кишечника у мышей с гентамицин-ассоциированным дисбиозом. Вегетативные клетки исследуемых бациллярных штаммов не проявляли гемолитическую активность, а также не несли гены, ответственные за синтез энтеротоксинов и цитотоксина K, указывая о их потенциальной безопасности. Согласно полученным нами данным, можно заключить, что штаммы B. subtilis МР2 и RF-45 являются перспективными кандидатами в пробиотики для животноводства.

Работа поддержана грантами Президента РФ МК-2439.2022.5 и РНФ № 23-26-00161.

Список литературы:

1. Бактериальное сообщество слепых отростков кишечника цыплят-бройлеров на фоне питательных рационов различной структуры / В. И. Фи-синин, Л. А. Ильина, Е. А. Йылдырым [и др.] // Микробиология. 2016. Т. 85. № 4. С. 472-480.

2. Влияние адгезивной активности бактерий Lactobacillus paracasei B-11821 на эффективность биопрепарата, предназначенного для использования в свиноводстве / Н. В. Позолотина, И. В. Дармов, И. В. Маракулин [и др.] // Ученые записки Казанского университета. Серия: Естественные науки. 2018. Т. 160. № 1. С. 54-66.

3. Влияние антибиотиков, использующихся в животноводстве, на распространение лекарственной устойчивости бактерий (обзор) / И. С. Сазы-кин, Л. Е. Хмелевцова, Е. Ю. Селиверстова [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2021. Т. 57. № 1. С. 24-35.

4. Выделение, очистка и изучение физикохимических свойств кси-ланазы штамма Bacillus subtilis 9 / Л. Р. Валиуллин, Р. С. Мухаммадиев, Р. С. Мухаммадиев [и др.] // Достижения науки и техники АПК. 2021. Т. 35. № 10. С. 66-71.

5. Выживаемость микроорганизмов пробиотиков в желудочно-кишечном тракте экспериментальных животных / И. В. Дармов, И. Ю. Чичерин, И. П. Погорельский [и др.] // Журнал инфектологии. 2012. Т. 4. № 1. С. 68-74.

6. Динамика антибиотикочувствительности штаммов Enterococcus faecium на молочно-товарных фермах в районах с разным уровнем загрязнения агробиоценозов / И. М. Донник, О. А. Быкова, Я. Ю. Лысова [и др.] // Ветеринария Кубани. 2019. № 1. С. 7-10.

7. Исследование цитотоксичности молочнокислых и пропионовокислых бактерий в тесте in vitro / Р. С. Мухаммадиев, Р. С. Мухаммадиев, Е. В. Скворцов, [и др.] // Ветеринарный врач. 2019. № 4. С. 17-20.

8. Лактобациллы: правовое регулирование и перспективы создания препаратов нового поколения / Р. А. Юнес, Е. У. Полуэктова, Т. В. Белкина [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2022. Т. 58. № 5. С. 520-534.

9. Молочнокислые и пропионовокислые бактерии: формирование сообщества для получения функциональных продуктов с бифидогенными и гипотензивными свойствами / А. В. Бегунова, И. В. Рожкова, Е. А. Зверева [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. 2019. Т. 55. № 6. С. 566-577.

10. Молочнокислые и спорообразующие бактерии: формирование сообществ как основы функциональных добавок с пробиотическими свойствами для птицеводства / Р. С. Мухаммадиев, Р. С. Мухаммадиев, Л. Р. Валиуллин [и др.] // Ветеринария Кубани. 2023. № 2. С. 30-36.

11. Новые штаммы Bacillus subtilis как перспективные пробиотики / Г. Ф. Хадиева, М. Т. Лутфуллин, Н. К. Мочалова [и др.] // Микробиология. 2018. Т. 87. № 4. С. 356-365.

12. Новые штаммы Lactobacillus acidophilus как перспективные пробиотики для птицеводства / Л. Р. Валиуллин, Р. С. Мухаммадиев, Р. С. Мухам-мадиев [и др.] // Ветеринария Кубани. 2022. № 6. С. 16-21.

13. Новые штаммы микроорганизмов как перспективные добавки с функциональными свойствами для птицеводства / Р. С. Мухаммадиев, Р. С. Мухаммадиев, А. И. Яруллин [и др.] // Актуальные проблемы аграрной науки: прикладные и исследовательские аспекты: материалы III Всероссийской (национальной) научно-практической конференции. Нальчик: ФГБОУ ВО «Кабардино-Балкарский государственный аграрный университет имени В.М. Кокова», 2023. С. 98-101.

14. Оптимизация параметров совместного культивирования Bacillus subtilis GA27 и Bacillus subtilis RF-45 для возможности создания пробиотиков, метапробиотиков и метабиотиков для птицеводства/ Р. С. Мухамма-диев, Р. С. Мухаммадиев, Л. Р. Валиуллин [и др.] // Ветеринария Кубани. 2023. № 3. С. 32-38.

15. Параметры острой токсичности и кожно-раздражающего потенциала кормовой композиции с метапробиотическими свойствами/ Г. Л. Латыпов, А. С. Мухаммадиева, Л. Р. Валиуллин [и др.] // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2023. Т. 253. № 1. С. 174-179.

16. Пробиотики на основе бактерий рода Bacillus в птицеводстве / Н. В. Феоктистова, А. М. Марданова, Г. Ф. Хадиева [и др.] // Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки. 2017. Т. 159. № 1. С. 85-107.

17. Севастьянова, Т. В. Функциональные кормовые добавки для сельскохозяйственных животных и их влияние на показатели продуктивности / Т. В. Севастьянова, Б. В. Уша // Аграрная наука. 2021. № S4. С. 99-103.

18. Сравнительная характеристика кишечного микробиома местного крупного рогатого скота и скота абердин-ангусской породы, импортированного в Казахстан/ А. Т. Даугалиева, С. Т. Даугалиева, М. А. Кинеев [и др.] // Ветеринария сегодня. 2022. Т. 11. № 1. С. 53-60.

19. Сравнительная экспериментальная оценка эффективности современных пробиотиков, пребиотиков, синбиотиков и метабиотиков при коррекции нарушений микробиоценоза кишечника у животных с антибиотико-ассоциированным дисбиозом / И. Ю. Чичерин, И. П. Погорельский, И. Г. Лундовских [и др.] // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2016. № 7. С. 106-120.

20. Ферментативная активность гидролаз штаммов микроорганизмов, перспективных для создания на их основе кормовых добавок и биологических консервантов / Р. С. Мухаммадиев, Р. С. Мухаммадиев, И. Г. Каримуллина [и др.] // Состояние, проблемы и перспективы развития современной науки: материалы национальной научно-практической конференции. Брянск: Брянский государственный аграрный университет (Кокино), 2021. С. 127-133.

21. Antagonistic properties and biocompatibility as important principles for development of effective and biosafety probiotic drugs/ Rish.S. Mukhammadiev, A.S. Mukhammadieva, E.V. Skvortsov et al. // IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2021. 663. 012008.

22. Antioxidant effects of live and heat-killed probiotic Lactobacillus plantarum Ln1 isolated from kimchi/ H.J. Jang, M.W. Song, N.K. Lee et al. // J. Food Sci. Technol. 2018. 55(8). 3174-3180.

23. Bacillus subtilis M6 improves intestinal barrier, antioxidant capacity and gut microbial composition in AA broiler/ L. Ji, L. Zhang, H. Liu, J. Shen, Y. Zhang, L. Lu, X. Zhang, X. Ma// Front. Nutr. 2022. 9. 965310. DOI: 10.3389/ fnut.2022.965310.

24. Carriage of extended-spectrum в-lactamases in pig farmers is associated with occurrence in pigs/ W. Dohmen, M.J. Bonten, M.E. Bos, S. van Marm, J. Scharringa, J.A. Wagenaar, D.J. Heederik// Clin. Microbiol. Infect. 2015. 21(10). 917-923. DOI: 10.1016/j.cmi.2015.05.032.

25. Effective bifidogenic growth factors cyclo-Val-Leu and cyclo-Val-Ile produced by Bacillus subtilis C-3102 in the human colonic microbiota model/ M. Hatanaka, H. Morita, Y. Aoyagi, K. Sasaki, D. Sasaki, A. Kondo, T. Nakamura// Sci. Rep. 2020. 10(1). 7591-7600. DOI:10.1038/s41598-020-64374-w.

26. Evaluation of probiotic and prebiotic-like effects of Bacillus subtilis BN on growth of lactobacilli/ M. Horie, T. Koike, S. Sugino, A. Umeno, Y. Yoshida// J. Gen. Appl. Microbiol. 2018. 64(1). 26-33. DOI: 10.2323/jgam.2017.03.002.

27. Exploring the potential of Bacillus subtilis as an additive for decontamination of feed/ L. Valiullin, R. Mukhammadiev, M. Sevostyanov, D. Demin, I. Karimullina, A. Mukhammadieva, V. Gumerov, D. Sorokina, A. Yarullin, R. Mukhammadiev// E3S Web of conferences. 2023. 462. 01021. DOI: 10.1051/e3sconf/202346201021.

28. Formation of the bacterial community as the basis of probiotic supplement for livestock/ L.R. Valiullin, R.S. Mukhammadiev, V.G. Gumerov, B.A. Sadykov, R.S. Mukhammadiev, D.A. Sorokina, E.Yu. Tarasova, A.S. Mukhammadieva// BIO Web of conferences. 2024. 105. 04001. DOI:10.1051/bioconf/202410504001.

29. Improved growth and viability of lactobacilli in the presence of Bacillus subtilis (natto), catalase, or subtilisin/ T. Hosoi, A. Ametani, K. Kiuchi, S. Kaminogawa// Can. J. Microbiol. 2000. 46(10). 892-897. DOI: 10.1139/w00-070.

30. Kimelman H., Shemesh M. Probiotic bifunctionality of Bacillus subtilis-rescuing lactic acid bacteria from desiccation and antagonizing pathogenic Staphylococcus aureus// Microorganisms. 2019. 7(10). 407-423. DOI: 10.3390/microorganisms7100407.

31. Mazkour S., Shekarforoush S., Basiri S. The effects of supplementation of Bacillus subtilis and Bacillus coagulans spores on the intestinal microflora and growth performance in rat// Iran. J. Microbiol. 2019. 11(3). 260-266.

32. Occurrence of Salmonella enterica and Escherichia coli in raw chicken and beef meat in northern Egypt and dissemination of their antibiotic resistance markers/ A.A. Moawad, H. Hotzel, O. Awad, H. Tomaso, H. Neubauer, H.M. Hafez, H. El-Adawy// Gut Pathog. 2017. 9. 57-70. DOI: 10.1186/s13099-017-0206-9.

33. Overview of the antimicrobial compounds produced by members of the Bacillus subtilis group/ Caulier S, Nannan C, Gillis A, Licciardi F, Bragard C, Mahillon// J. Front. Microbiol. 2019. 10. 302-321. DOI: 10.3389/ fmicb.2019.00302.

34. Preclinical safety assessment of Bacillus subtilis BS50 for probiotic and food applications/ L.M. Brutscher, C. Borgmeier, S.M. Garvey, J.L. Spears// Microorganisms. 2022. 10(5). 1038-1059. DOI: 10.3390/ microorganisms10051038.

35. Probiotic characterization of Bacillus subtilis P223 isolated from kimchi/ H.L. Jeon, N.K. Lee, S.J. Yang, W.S. Kim, H.D. Paik// Food Sci. Biotechnol. 2017. 26(6). 1641-1648. DOI: 10.1007/s10068-017-0148-5.

36. Supplementation of Bacillus subtilis GM5 enhances broiler body weight gain and modulates cecal microbiota/ G. Hadieva, M. Lutfullin, D. Pudova, Y. Akosah, E. Shagimardanova, N. Gogoleva, M. Sharipova, A. Mardanova// 3 Biotech. 2021 11(3). 126-139. DOI: 10.1007/s13205-020-02634-2.

37. Survival of probiotic strains of microorganisms under imitating digestion in the stomach and intestines of farm animals/ Rish.S. Mukhammadiev, Rin.S. Mukhammadiev, E.V. Skvortsov, L.R. Valiullin, A.P. Glinushkin, V.P. Kalinitchenko// IOP Conf. Ser. Earth Environ. Sci. 2021. 663. 012038. DOI:10.1088/1755-1315/663/1/012038.

38. Tenea G.N., Gonzalez G.L., Moreno J.L. Probiotic characteristics and antimicrobial potential of a native Bacillus subtilis strain Fa17.2 rescued from wild Bromelia sp. flowers// Microorganisms. 2022. 10. 860-876. DOI: 10.3390/microorganisms10050860.

39. Viswanathan V.K. Off-label abuse of antibiotics by bacteria// Gut Microbes. 2014. 5(1). 3-4. DOI: 10.4161/gmic.28027.

Резюме. В настоящей работе проведена сравнительная оценка свойств спорообразующих штаммов B. subtilis МР2 и RF-45, их потенциала как кандидатов в пробиотики для животноводства. Исследуемые бациллы обладали антимикробным потенциалом против бактерий S. aureus, E. coli и S. enterica - возбудителей различных инфекций сельскохозяйственных животных, а также токсинпродуцирующих микромицетов F. graminearum, F. moniliforme и F. sporotrichioides. По сравнению с бациллярным штаммом МР2, B. subtilis RF-45 на 8,18-18,07 и 16,74-28,10 % эффективнее ингибировал рост тест-бактерий и микромицетов соответственно. Установлено, что после последовательного выдерживания спор обоих бацилл в среде с пепсином (рН 2.5) в течение 3 ч и бычьей желчью (рН 7,5) в течение 8 ч их жизнеспособность находилась на уровне контроля. Наиболее высокий показатель адгезии выявлен у штамма МР2: после инкубации в течение 2 ч при 37,0°С количество адгезированных на клетках НТ-29 жизнеспособных его спор было выше в 1,87 раза относительно значений данного показателя спор штамма RF-45. Вегетативные клетки обоих бацилл не проявляли гемолитическую активность, а также не несли гены, ответственные за синтез энтеротоксинов и цитотоксина K, указывая о их потенциальной безопасности. Раздельное или совместное выпаивание спор исследуемых бацилл приводило к повышению численности кишечной палочки, бифидо-и лактобактерий в содержимом кишечника белых мышей с дисбиозом, индуцированным антибиотиком гентамицином. При этом в группе мышей, которые получали суспензию спор штамма RF-45, содержание кишечной палочки было больше в 1,02 раз, бифидобактерий - в 1,12 раза, лактобактерий - 1,04 раза относительно значений указанного показателя группы животных, получавших суспензию спор штамма МР2. Сделано заключение, что штаммы B. subtilis МР2 и RF-45 являются перспективными кандидатами в пробиотики для животноводства.

Ключевые слова: Bacillus subtilis, антимикробный потенциал, устойчивость, желчь, пепсин, адгезия на клетках, безопасность, нарушения микроэкологии кишечника, эффективность, пробиотики, животноводство.

Сведения об авторах:

Мухаммадиев Ринат Салаватович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории прикладной и экспериментальной микробиологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии», научный сотрудник лаборатории кормов и кормовых добавок ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», 420075, г. Казань, Научный городок-2; тел.: 8-987-4214127; е-mail: tanirtashir@mail.ru.

Каримуллина Ильсияр Габделгазизовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории вирусологии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, Научный городок-2; тел.: 8-904-7699225; е-mail: 89047699225@mail.ru.

Шангараев Рафкат Искандарович, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетического анализа ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, Научный городок-2; тел.: 8-917-22883344; е-mail: rafkat.shangaraev@mail.ru.

Мухаммадиева Алина Сергеевна, кандидат ветеринарных наук, младший научный сотрудник лаборатории культур клеток и питательных сред ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, Научный городок-2; тел.: 8-917-2396095; е-mail: alinasakura_mail.ru@mail.ru.

Акбашев Ильгизар Расилович, кандидат ветеринарных наук, научный сотрудник лаборатории вирусологии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, Научный городок-2; тел.: 8-950-9474056; е-mail: ilgizar.92@mail.ru.

Сорокина Диана Анатольевна, младший научный сотрудник лаборатории вирусологии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, Научный городок-2; тел.: 8-927-8875729; е-mail: diana-sorokina2013@mail.ru.

Хусаинова Гульнара Ильдусовна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории вирусологии ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; 420075, г. Казань, Научный городок-2; тел.: 8-917-2627283; е-mail: GulnaraI13@yandex.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Мухаммадиев Ришат Салаватович, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории прикладной и экспериментальной микробиологии ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии», научный сотрудник лаборатории кормов и кормовых добавок ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», 420075, г. Казань, Научный городок-2; тел.: 8-939-3728789; e-mail: tashir9891@mail.ru