Эффективность РИД- и ПЦР-методов в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота

УДК 619.616.392:636.98
DOI 10.33861/2071-8020-2022-5-3-5

Микаилов М.М., Будулов Н.Р., Гунашев Ш.А., Яникова Э.А. Прикаспийский зональный научно-исследовательский
ветеринарный институт - филиал ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Республики Дагестан»,
Республика Дагестан, г. Махачкала
Черных О.Ю., Лысенко А.А. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина», г. Краснодар

Вирус лейкоза крупного рогатого скота (далее, ВЛКРС) -РНК-содержащий онкогенный вируссемейства Retroviridae, рода Deltaretrovirus, вызывающий инфекционное злокачественное лимфопролиферативное заболевание животных. Возбудитель болезни широко распространен во всем мире. В Российской Федерации вирусная инфекция длительное время занимает лидирующее положение. Установлено, что в процессе патогенеза болезни вирус приводит к трансформации клеток, представляющей собой реальный риск развития онкологических болезней человека [1, 3, 7, 12]. К настоящему времени случаев инфицирования человека вирусом лейкоза не выявлено, однако, возможность перераспределения между ВЛКРС и вирусом Т-клеточного лейкоза у человека не исключена. К тому же за последние годы ряд исследователей установил наличие отдельных фрагментов генома провируса у людей, в частности, в клетках молочной железы [13].

Прижизненная диагностика является основой проводимых про-тивоэпизоотических мероприятий при заболевании лейкозом крупного рогатого скота. Специфичность, чувствительность, легкость технического выполнения и низкая стоимость диагностики определяют ее эффективность.

В арсенале практической ветеринарной медицины страны в настоящее время имеется комплекс методов прижизненной диагностики лейкоза, что позволяет установить факт инфицирования животного, выявить наличие возбудителя болезни, определить стадию заболевания и эффективно проводить оздоровительные противолей-козные мероприятия в неблагополучных по заболеванию хозяйствах.

Реакция иммунной диффузии (далее, РИД) в геле агара является наиболее применяемым в практике и широко освоенным методом, основным тестом для прижизненной диагностики, достаточно чувствительным и простым в постановке. Это очень важно для установления контроля эпизоотологического благополучия стад по лейкозной инфекции и тестирования животных в условиях неблагополучия. Необходимо отметить, что данный тест иммунной диффузии не позволяет выявить всех зараженных вирусом животных, так как у некоторых из них уровень антител в сыворотке крови остается ниже порога чувствительности.

В настоящий момент заслуживает особого внимания иммунофер-ментный анализ (далее, ИФА), как еще один серологический метод для тестирования инфекции вирусного лейкоза. Благодаря высокому уровню восприимчивости и видовой специфичности, он широко используется в ветеринарной практике многих стран мира, в том числе Российской Федерации, при реализации основных программ по ликвидации лейкозной инфекции [5, 9].

Как и у любого способа диагностики, у ИФА есть существенные недостатки. Например, он, как и РИД, не позволяет отличить колостральные антитела у телят от активных антител, продуцирующийся при развитии лейкозной инфекции.

аслуживает особого внимания и является актуальной задачей применение генно-молекулярных методов диагностики, таких как молекулярная гибридизация и полимеразная цепная реакция (далее, ПЦР). ПЦР позволяет выявлять, по разным данным, на 10-42% больше инфицированных ВЛКРС животных, чем РИД или ИФА. При помощи ПЦР возможно также отличить зараженных вирусом телят от таковых с колостральными антителами [11].

Ряд ученых, принимая во внимание то, что ни молекулярно-биологический, ни, тем более, серологический методы не лишены недостатков, предлагает комплексное использование диагностических тестов. В частности, учитывая недостаточность серологических методов, особенно в стадах с низкой частотой BLV-инфекции, рекомендуется использование ПЦР [14, 15].

Цель исследования - оценка эффективности РИД- и ПЦР-методов диагностики инфекции ВЛКРС.

Материалы и методы исследований. Настоящую работу выполняли в лаборатории инфекционных болезней сельскохозяйственных животных Прикаспийского зонального научно-исследовательского ветеринарного института - филиала ФГБНУ «Федеральный аграрный научный центр Республики Дагестан». Биоматериалом исследования являлись сыворотка крови и цельная кровь коров черно-пестрой породы в возрасте 3-8 лет из неблагополучного по лейкозу крестьянско-фермерского хозяйства. Пробы крови для проверки в ПЦР отбирали у животных в вакуумные пробирки с содержанием ЭДТА. Серологические и молекулярно-генетические анализы проводили на сертифицированном оборудовании в ГБУ КК «Кропоткинская краевая ветеринарная лаборатория» согласно «Методическим указаниям по диагностике лейкоза крупного рогатого скота», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ от 23.08.2000 г. [8]. Исследования сыворотки крови на носительство вируса лейкоза осуществляли в реакции иммунной диффузии в геле агара - РИД (производства ФКП «Курская биофабрика - фирма «Биок», Россия). Молекулярно-генетические исследования выполняли с помощью набора реагентов «ПЦР-ЛЕЙКОЗ-КРС-ФАКТОР» для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BVL) в биологическом материале методом ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, производства ВЕТ ФАКТОР (г. Троицк).

Результаты исследований и их обсуждение. В опытах по испытанию тест-системы ПЦР исследовались пробы крови коров чернопестрой породы в возрасте от 3 до 8 лет из неблагополучного по вирусному лейкозу крестьянско-фермерского хозяйства. Исследования проводились в сравнении с выявлением специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови реакцией иммунодиффузии.

На предварительном этапе работы сыворотку крови коров подвергли анализу в РИД, затем провели молекулярно-генетический анализ крови для выявления генома возбудителя. Результаты проведенных исследований отражены в таблице 1.

Таблица 1 Выделяемость инфицированных ВЛКРС коров методами РИД и ПЦР

По результатам серологических исследований в реакции иммунной диффузии были выявлены характерные антитела к лейкозному вирусу крупного рогатого скота в 26 случаях, что составляет 20% встречаемости от числа подвергнутых анализу, серонегативными оставались 104 коровы (80%).

Молекулярно-генетическим тестом исследования выявлено присутствие провируса ДНК у 38 животных (ПЦР+), что составило 29,2% случаев встречаемости. У 92 животных по результатам ПЦР-диагнос-тики ДНК провирус не детектировался, что составило 70,8% исследованных.

Таким образом, в крестьянско-фермерском хозяйстве ПЦР методом диагностировали с провирусной ДНК на 12 коров больше, чем РИД-позитивных.

Анализ данных по выявлению провирусной ДНК показывает, что процент зараженных вирусом лейкоза на основании ПЦР-исследований не соответствует проценту РИД-позитивных животных. В 26 (68,4%) случаях выявлено совпадение результатов РИД и ПЦР.

Существуют различные данные по чувствительности и специфичности реакций: РИД, ИФА и ПЦР. В предыдущих наших публикациях было показано преимущество ПЦР, в сравнении с РИД при выявлении животных, инфицированных вирусом лейкоза. Напомним, что выявляемость зараженных ВЛКРС животных в ПЦР была на 18,9% выше, чем в РИД, что сопоставимо с результатами, полученными рядом ученых [6].

Двоеглазов Н.Г. (2009) в сравнительном анализе на репрезентативном поголовье показал, что эффективность методов РИД, ИФА, ПЦР для диагностики ВЛКРС составила 76,1, 83,3 и 58,3-72,6%, соответственно. Для достижения наилучшего диагностического эффекта при вирусном лейкозе крупного рогатого скота автор предлагает комбинированное использование серологических и генно-молекулярных методов [2].

В ряде отечественных и зарубежных работ показано превосходство ИФА и ПЦР в сопоставлении с РИД в геле агара [2, 3, 4, 9, 10, 11, 12].

Заключение. По результатам серологических исследований в РИД были выявлены антитела к вирусу лейкоза в 26 (20%) случаях, молекулярным ПЦР-методом выявлено присутствие провируса ДНК -38 (29,2%), соответственно. ПЦР-метод диагностики превосходит РИД тест в 1,5 раза. Для максимального выявления всех серопозитивных ВЛКРС животных предлагаем комплексное использование РИД и ПЦР, как перспективной системы в противолейкозных мероприятиях. Внедрение молекулярного метода ПЦР-диагностики в ветеринарную практику Республики Дагестан позволит выявлять зараженных животных среди молодняка в ранние сроки, что особенно важно при проведении оздоровительной работы в племенных и товарных хозяйствах, исследований быков-производителей, а также на заключительных этапах оздоровления сельхозпредприятия.

Список литературы:

1. Анализ современной эпизоотической обстановки по хроническим инфекционным заболеваниям крупного рогатого скота в Республике Дагестан/ Н.Р. Будулов, А.Ю. Алиев, М.М. Микаилов, Э.А. Яникова, А.А. Халиков// Ветеринария Кубани. 2021. № 2. С. 9-12.

2. Двоеглазов Н.Г. Оценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота: автореф. дис. ... канд. вет. наук// 2009. 19 с.

3. Донник И.М., Татарчук А.Т., Красноперов В.А. Уральская система оздоровительных мероприятий// 1996. 52 с.

4. Лысенко А.А., Черных О.Ю., Хахов Л.А. Использование методов ранней диагностики при оздоровлении от лейкоза крупного рогатого скота учебноопытных хозяйств «Кубань» и «Краснодарское» КубГАУ// Год науки и технологий 2021: Сб. тез. по матер. Всероссийской науч.-практ. конф. 2021. С. 56.

5. Мальцева Н.А. ПЦР-диагностика лейкоза крупного рогатого скота// Ветеринарная патология. 2003. № 1. С. 129-131.

6. Махиева Б.М., Будулов Н.Р. Сравнительное изучение тест-систем РИД и ПЦР в диагностике ВЛКРС-инфекции// В сб.: Проблемы ветеринарной науки и пути решения. 2019. С. 151-156.

7. Мелкина П.С., Агольцов В.А., Дружаева Н.А. Эпизоотологическая обстановка по лейкозу крупного рогатого скота и эффективность противолейкозных мероприятий в Саратовской области// Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана. 2012. Т. 209. С. 216-220.

8. Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота. 2000. № 13-7-2/2130.

9. Петропавловский М.В. Эффективность диагностических тестов в выявлении вируса лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых от лейкоза стадах: автореф. дис. . канд. вет. наук// 2010. 24 с.

10. Прогноз развития эпизоотии вируса лейкоза крупного рогатого скота в Западно-Казахстанской области/ В.С. Власенко, У.Ж. Кужебаева, Ж.К. Кошеме-тов, Е.С. Борисов [и др.]// Ветеринария и кормление. 2021. № 4. С. 19-22.

11. Сравнительная диагностическая оценка серологического и молекулярно-генетического методов лабораторных исследований на лейкоз крупного рогатого скота/ В.А. Агольцов [и др.]// Вестник Алтайского государственного аграрного университета. 2012. № 4 (90). С. 56-59.

12. Трансформация клеток под действием вируса лейкоза крупного рогатого скота - реальный риск развития онкологических болезней человека/ Н.З. Хази-пов, Р.Р. Вафин, А.Ю. Шаева, Л.И. Зайнуллин// Современные проблемы науки и образования. 2013. № 6. 1061 с.

13. Bovine Leukemia Virus Gene Segment Detected in Human Breast Tissue/ G. Mesa, J. C. Ulloa, A. M. Uribe, M. F. Gutierrez// Open Journal of Medical Microbiology. 2013. Vol. 3. Р. 84-90.

14. Mohammadabadi M.R. Using PCR for early diagnosis of bovine leukemia virus infection in some native cattle/ M.R. Mohammadabadi, M. Soflaei, H. Mostafavi, M. Honarmand// Gen. Mol. Res. 2011. Vol. 10. P. 2658-2663.

15. Saepulloh M. Efektivitas metode PCR dan AGID dalam mendeteksi penyakit enzootic bovine leucosis di Indonesia/ M. Saepulloh, I. Sendow // JITV. 2015. Vol. 20 (1). P. 71-78.

Резюме. В статье собраны и изложены сведения по применению сравнительной диагностической оценки полимеразной цепной реакции и иммунной диффузии в лабораторных исследованиях при диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Прижизненная диагностика является основой проводимых про-тивоэпизоотических мероприятий при заболевании лейкозом крупного рогатого скота. Специфичность, чувствительность, легкость технического выполнения и низкая стоимость диагностики определяют ее эффективность. Биоматериалом исследования являлись сыворотка крови и цельная кровь коров черно-пестрой породы, в возрасте 3-8 лет, из неблагополучного по лейкозу крестьянско-фермерского хозяйства. Серологические и молекулярно-генетические анализы проводили на сертифицированном оборудовании в Кропоткинской краевой ветеринарной лаборатории. В неблагополучном по лейкозу крестьянско-фермерском хозяйстве метод полимеразной цепной реакции позволил выявить на 9,2% больше серопозитивных коров, чем в реакции иммунной диффузии. Молекулярно-генетический метод диагностики лейкоза по чувствительности превосходит серологический в 1,5 раза. Для максимального выявления всех серопозитивных животных предлагаем комплексное использование полимеразной цепной реакции и иммунной диффузии как перспективной системы в противолейкозных мероприятиях. Внедрение молекулярного метода ПЦР-диагностики в ветеринарную практику региона позволит выявлять зараженных животных среди молодняка вы ранние сроки, что особенно важно при проведении оздоровительной работы в племенных и товарных хозяйствах, исследований быков-производителей, а также на заключительных этапах оздоровления сельскохозяйственного предприятия.

Ключевые слова: лейкоз, инфекция, вирус лейкоза крупного рогатого скота, лабораторная диагностика, реакция иммунной диффузии (РИД), иммунофермент-ный анализ (ИФА), полимеразная цепная реакция (ПЦР), неблагополучное по лейкозу хозяйство, серологический метод, молекулярно-биологический метод.

Сведения об авторах:

Микаилов Микаил Муслимович, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории инфекционной патологии сельскохозяйственных животных Прикаспийского зонального НИВИ - филиала ФГБНУ «ФАНЦ РД»; 367000, Республика Дагестан, г. Махачкала, ул. Дахадаева, 88; тел.: 8-8722-682702; e-mail: mikail.mikailov1981@mail.ru.

Будулов Нурдин Рагимханович, доктор ветеринарных наук, главный научный сотрудник лаборатории инфекционной патологии сельскохозяйственных животных Прикаспийского зонального НИВИ - филиала ФГБНУ «ФАНЦ РД»; 367000, Республика Дагестан, г. Махачкала, ул. Дахадаева, 88; тел.: 8-963-7939455; e-mail: budulov1951@mail.ru.

Гунашев Шахрудин Алиевич, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории инфекционной патологии сельскохозяйственных животных Прикаспийского зонального НИВИ - филиал ФГБНУ «ФАНЦ РД»; 367000, Республика Дагестан, г. Махачкала, ул. Дахадаева, 88; тел.: 8-8722-682702; e-mail: sgunashev@mail.ru.

Черных Олег Юрьевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры микробиологии, эпизоотологии и вирусологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-918-4956659; e-mail: gukkvl50@kubanvet.ru.

Лысенко Александр Анатолиевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры терапии и фармакологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И. Т. Трубилина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.: 8-961-5075415; e-mail: vet.kubgau@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Яникова Эльмира Арслановна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник лаборатории инфекционной патологии сельскохозяйственных животных Прикаспийского зонального НИВИ - филиал ФГБНУ «ФАНЦ РД»; 367000, Республика Дагестан, г. Махачкала, ул. Дахадаева, 88; тел.: 8-8722-682702; e-mail: vetmedservis@mail.ru.