Выявление ДНК курицы в мясной продукции, реализуемой в Москве и Московской области методом полимеразной цепной реакции

УДК 577.29
DOI 10.33861/2071-8020-2020-5-26-29

Меньшикова З.Н. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины
и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина», г. Москва
Любкина К.О., Девришова З.С., Преображенская А.С., Белоусов В.И., Нурлыгаянова Г.А.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральная
научно-методическая ветеринарная лаборатория», г. Москва

Введение. Один из важных элементов поддержания здоровья населения - обеспечение качества пищевых продуктов, контроль которого осуществляется различными методами ветеринарно-санитарной экспертизы. Один из аспектов проведения такой оценки - определение ассортиментной фальсификации продуктов, под которой подразумевается замена одного вида животного сырья другим, менее ценным, и иногда опасным для здоровья человека [6]. Кроме экономических последствий такой обман может нанести большой моральный вред той категории потребителей, национальные или религиозные верования которых не позволяют употреблять мясо отдельных видов животных и птицы [4].

По этим причинам требуется всесторонний комплексный контроль качества продукции и соответствия ее потребительским требованиям. На практике при оценке качества продукта возникает необходимость идентифицировать его реальный состав в соответствии с декларированными нормативными документами. Идентификация сырья и продуктов животного происхождения - важный элемент в системе Государственного ветеринарного надзора, направленный на:

1. Защиту потребителя от недобросовестного изготовителя (поставщика, продавца);

2. Обеспечение безопасности продукции для окружающей среды, жизни, здоровья потребителя, его имущества;

3. Подтверждение соответствия продукции предъявляемым к ней требованиям [1, 2].

Традиционно видовую идентификацию мяса птицы проводят морфологическим методом, однако он практически неприемлем для оценки переработанных продуктов, когда морфологические признаки вида абсолютно утеряны (фарш, паштет, консервы и др.). Использование гистологических методов не находит широкого применения вследствие их длительности и трудоемкости [5].

Также для видовой идентификации применяют такие аналитические методы, как масс-спектрометрический анализ выявления специфических различий в актине, гемоглобине, миоглобине и альбумине, фракционное разделение экстрактов мышечной ткани посредством газовой хроматографии, метод иммунодиффузии и др. Но все они основаны на анализе белков или неразрушенных тканевых структур и их применение невозможно при оценке переработанных продуктов, подвергшихся механической или термической обработке, влекущей дегенеративные клеточные изменения [6].

Наиболее стабильная структура животного организма - ДНК. Будучи устойчивой к воздействию температурных, химических и механических факторов, она не утрачивает своей информативной функции под влиянием агрессивных воздействий. В связи с этим наиболее чувствительным и специфичным для идентификации видовой принадлежности ДНК и определения сырьевого состава продукции сегодня считается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [6].

Применение метода ПЦР при анализе мясной продукции имеет ряд преимуществ, такие как быстрота и легкость использования; высокие показатели специфичности; подходит для видовой идентификации, как биологического материала (кровь, кожа, шерсть, перо), так и пищевых продуктов различного происхождения; возможность применения метода, как для качественной, так и для количественной оценки содержания того или иного ингредиента; метод подходит для анализа продуктов, имеющих в составе два или более видовых источника. Также метод отличается универсальностью, т.е. данным методом возможно исследовать как сырье, так и продукты, прошедшие технологическую обработку [9, 7].

Кроме идентификации видового состава мясных полуфабрикатов и готовых мясных изделий, также необходимо оценивать процентное соотношение фальсифицирующих примесей к основному мясному сырью, и определять источник проникновения данных веществ в продукт (технологически неизбежная контаминация в процессе производства или умышленная замена сырья и подлог готовой продукции) [3].

Цель работы - идентификация незаявленной в составе мясной продукции ДНК курицы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени для выявления фальсификации продукции, реализуемой в Москве и Московской области.

Материалы и методы исследований. Исследования проводились в Московской испытательной лаборатории Федерального государственного бюджетного учреждения «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория».

Для проведения комплексных лабораторных исследований отобрали десять видов мясной продукции (мясной фарш, полуфабрикаты, готовая продукция), реализуемых в розничных продовольственных магазинах города Москвы и Московской области (табл. 1).

Согласно нормативным документам ГОСТ 9959-2015, ГОСТ 105742016, ГОСТ Р 51478-99 (ИСО 2917-74), ТР ТС 021/2011 провели лабораторные испытания.

Образцы подверглись органолептической оценке, физико-химическим исследованиям, люминесцентной микроскопии, определению показателей безопасности (количество химических элементов, пестицидов, антибиотиков и радионуклидов).

При проведении исследований методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ), использовались коммерческие тест-системы производства ООО «Синтол»:

• «Gallus gallus/ Meleagris gallopavo/ Anas platyrhynchos Ident RT multiplex» для обнаружения видоспецифичной ДНК курицы (Gallus gallus), индейки (Meleagris gallopavo) и утки (Anas platyrhynchos);
• «Sus scrofa Ident RT» для обнаружения видоспецифичной ДНК свиньи;
• «Bovinae Ident RT» для обнаружения видоспецифичной ДНК крупного рогатого скота;
• абор реагентов для выделения ДНК из растительного сырья и пищевых продуктов «Сорб ГМО-Б».

Получение и обработка результатов ПЦР-РВ проводились с помощью прибора для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Rotor-Gene Q и программного обеспечения Software v2.3.1.48. (ООО «Синтол»).

Таблица 1 Характеристика проб мясной продукции

Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе работы была проведена органолептическая оценка отобранных образцов мясной продукции (фарш, полуфабрикаты и готовая продукция) согласно действующим нормативно-техническим документам. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 Результаты органолептического исследования мясной продукции

Данные таблицы 2 свидетельствуют, что по органолептическим показателям все десять образцов мясной продукции соответствуют действующему ГОСТ 9959-2015.

На втором этапе исследований определили свежесть мясной продукции. С этой целью провели физико-химические исследования по четырем показателям. Полученные результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 Результаты физико-химических исследований мясной продукции

Примечание: * - проба на сероводород для оценки вареного мяса и вареных колбас нехарактерна, так как в результате деструкции белков мяса при варке из него выделяется сероводород; ** - проба Эбера на свободный аммиак неприменима для парного мяса, солонины, колбасы, мясных консервов, так как она может дать ложную реакцию. Неточные результаты получаются и при исследовании вареного мяса.

Результаты, полученные при исследовании 10 проб на определение концентрации водородных ионов (рН) и выявление крахмала с раствором Люголя, соответствуют ГОСТ 10574-2016 и ГОСТ Р 5147899 (ИСО 2917-74). В пробе № 10 по результатам исследования на выявление крахмала с раствором Люголя присутствует синее окрашивание, что является допустимым согласно маркировке образца (производитель указал наличие крахмала в продукте).

Постановку и учет реакции на сероводород и на аммиак по Эберу ставили согласно учебному пособию «Лабораторные методы в ветеринарно-санитарной экспертизе пищевого сырья и готовой продукции» [8]. При исследовании шести проб получены отрицательные результаты (образцы № 1, 2, 3, 4, 5, 6).

С целью выявления начальной стадии порчи (гниения) мясной продукции, неразличимой при обычном визуальном осмотре провели люминесцентное исследование. При люминесцентном исследовании всех десяти образцов мясных экстрактов был отмечен прозрачный цвет, что говорит о свежести мясной продукции.

Также провели исследования по определению показателей безопасности, результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 Результаты исследования мясной продукции на показатели безопасности

Данные таблицы 4 свидетельствуют, что согласно ТР ТС 021/2011 в исследованных образцах мясной продукции количество химических элементов, пестицидов, антибиотиков и радионуклидов было в допустимых пределах. Нарушений предельно допустимого уровня по показателям безопасности не выявлено ни по одному из исследованных десяти образцов.

В результате постановки ПЦР-РВ с помощью набора регентов «Gallus gallus/ Meleagris gallopavo/ Anas platyrhynchos Ident RT multiplex» (ООО «Синтол»), было выявлено наличие видоспецифичной ДНК курицы (Gallus gallus) в шести образцах, что составило 60% от исследованных (Рисунок 1).

Рис. 1. График накопления флуоресценции сигнала

Положительные образцы были подвергнуты дальнейшему исследованию для определения относительного количества ДНК курицы в пробах. Так, в случае, если разница величин пороговых циклов Ct составляет более 7, то содержание меньшего вида мяса (большая величина Ct) относительно превалирующего вида (меньшая величина Ct) составляет менее 1%, согласно инструкции производителя тест-системы (Табл. 5).

Таблица 3 Определение относительного количества ДНК курицы в пробах

Данные, представленные в таблице 5, свидетельствуют, что ДНК курицы (Gallus gallus) обнаружена в шести образцах мясной продукции. Полуколичественный анализ показал наличие искомого компонента в образцах № 2, 7, 8, 9, 10 более 1%, а в образце № 6 менее 1% по отношению к заявленному ингредиентному составу.

Выводы. По комплексным органолептическим и физико-химическим исследованиям десять образцов мясной продукции (мясной фарш, полуфабрикаты, готовая продукция) соответствуют требованиям ГОСТ, действующим в настоящее время. Люминесцентный анализ подтвердил отсутствие порчи в исследуемых образцах мясной продукции. При проведении исследований по определению показателей безопасности согласно ТР ТС 021/2011 установлено, что по остаткам химических элементов, пестицидов, антибиотиков и радионуклидов продукция признана безопасной. Исследование образцов методом полимеразной цепной реакции выявило ДНК курицы в шести пробах мясной продукции. При полуколичественном анализе в одном мясном продукте (образец № 6) количество искомого компонента составило менее одного процента, что свидетельствует о наличии возможных случайных или технически неустранимых примесей.

Заключение. Результаты проводимых исследований показали, что для точного утверждения о наличии фальсификации мясной продукции, выявленной методом ПЦР-РВ, необходим не только качественный анализ, но и количественный. В настоящее время в целях повышения качества лабораторных исследований и своевременного выявления некачественной продукции необходимо:

1. Подвергать мясную продукцию не только базовому комплексу исследований в соответствии с действующими нормативными документами, но и включать методы, направленные на выявление возможной фальсификации продукта.

2. На законодательном уровне установить точное определение технически неустранимой примеси в пищевой продукции, что позволит дифференцировать возможную фальсификацию продукции от следовых количеств не заявленных ингредиентов (технологическая примесь).

Список литературы:

1. Астапова М.С. Сравнительная оценка методов идентификации сырья животного и растительного происхождения и пищевых продуктов// Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2009. № 1. С. 90-98.
2. ГОСТ Р 51293-99. Идентификация продукции. Общие положения.
3. Ковалева О.А. Поиск методов для выявления видового состава мясной продукции и разработка критериев отнесения ее к фальсифицированной/ О.А. Ковалева, Е.М. Здрабова, М.В. Яркина, Ю.В. Комарова// Вестник ТвГУ. Серия «Биология и экология». 2019. № 2. С. 260-271.
4. Комарова И.Н. Разработка ПЦР тест-системы для видовой идентификации и количественной оценки мясного сырья в составе мелкоизмельченных полуфабрикатов и готовых мясных продуктов: дисс. . канд. вет. наук/ И.Н. Комарова. - Москва, 2005. - с. 182.
5. Коновалова Е.Н. Видовая идентификация мяса птицы в животноводческой продукции с применением метода полимеразной цепной реакции/ Е.Н. Коновалова, Е.А. Гладырь, Н.А. Зиновьева// Достижения науки и техники АПК. 2011. № 10. С. 67-69.
6. Коновалова Е.Н. Оценка чувствительности и специфичности метода ПЦР для видовой идентификации коров, свиней и кур/ Е.Н. Коновалова, О.В. Вавилова, Е.А. Гладырь, Н.А. Зиновьева// Достижения науки и техники АПК. 2012. № 8. С. 44-45.
7. Минаев М.Ю. Методы ПЦР для определения сырьевых компонентов в готовой продукции/ М.Ю. Минаев, Б.А. Лисицын, Т.А. Фомина// Мясная индустрия. 2008. № 6. С. 36-37.
8. Серегин И.Г. Лабораторные методы в ветеринарно-санитарной экспертизе пищевого сырья и готовой продукции/ И.Г. Серегин, Б.В. Уша// РАПП. 2008. С. 26-40.
9. Фомина Т.А. Разработка метода идентификации видовой принадлежности мясных и растительных ингредиентов на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени: дисс. канд. техн. наук/ Т.А. Фомина// Москва. 2012. с. 149.

Резюме. Наиболее часто встречающийся тип фальсификации продуктов животного происхождения - подмена сырья более ценных видов менее ценными, в том числе и мясом птицы. В данной работе представлены результаты исследований по идентификации незаявленной в составе мясной продукции ДНК курицы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) для выявления возможной фальсификации продукции, реализуемой в Москве и Московской области. В результате ПЦР исследования ДНК курицы (Gallus gallus) обнаружена в шести из десяти образцов мясной продукции, что составило 60% от исследованных образцов. Однако при определении относительного количества ДНК курицы в пробах полуколичественный анализ исключил один мясной продукт, так как количество искомого компонента составило менее одного процента, что свидетельствует о наличии возможных случайных или технически неустранимых примесей. Все десять образцов также подверглись органолептической оценке, физико-химическим исследованиям, люминесцентной микроскопии, определению показателей безопасности (количество химических элементов, пестицидов, антибиотиков и радионуклидов). Результаты комплексных исследований отклонений не выявили. Таким образом, метод полимеразной цепной реакции позволяет определить видовую принадлежность сырья в составе мясных фаршевых продуктов, мелкоизмельченных полуфабрикатов и в том числе подвергшихся тепловой обработке. Для точного утверждения о наличии фальсификации мясной продукции, выявленной методом ПЦР-РВ, необходим не только качественный анализ, но и количественный, что позволит дифференцировать возможную фальсификацию от следовых количеств не заявленных ингредиентов (технологическая примесь).

Ключевые слова: домашняя птица, видовой состав, фальсификация пищевых продуктов, мясная продукция, свинина, говядина, метод полимеразной цепной реакции, метод полимеразной цепной реакции в реальном времени, идентификация ДНК.

Сведения об авторах:

Меньшикова Зинаида Николаевна, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»; 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23; тел.: 8-495-3778569; e-mail: dec_fvm@mgavm.ru.

Любкина Ксения Олеговна, ветеринарный врач отдела молекулярных исследований ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная, д. 23; e-mail: ksenia.luybkina@gmail.com.

Девришова Зелиха Султановна, заведующий отделом молекулярных исследований ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная, д. 23; e-mail: zul3646@yandex.ru.

Преображенская Анастасия Сергеевна, научный сотрудник отдела молекулярных исследований ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная, д. 23; e-mail: a.pcrvet@gmail.com.

Белоусов Василий Иванович, доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник отдела координации научно-исследовательских работ ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная, д. 23.

Ответственный за переписку с редакцией: Нурлыгаянова Гульнара Ахметовна, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник отдела координации научно-исследовательских работ ФГБУ «Центральная научнометодическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная д. 23. Тел.: 8(495)700-01-37. E-mail: cnmvl@cnmvl.ru