Биохимические маркеры костеобразования и воспаления у собак при удлинении костей голени по Илизарову

УДК 612.11-002:599.742.1-092.9:616.718.5/.6-001.5-089.227.84

Тушина Н.В., Талашова И.А., Кононович Н.А. ФГБУ "Российский научный центр
"Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова"
Минздрава России, г. Курган

Введение. На сегодняшний день в России и за рубежом одной из проблем ветеринарной медицины остается поиск оптимальных способов лечения и реабилитации мелких домашних животных с патологией опорно-двигательного аппарата различного генеза [7].

В настоящее время метод остеосинтеза по Г.А. Илизарову позволяет получить наилучшие результаты, как при лечении переломов костей, так и ортопедической патологии (врожденные и приобретенные укорочения, ложные суставы, деформации) [4, 5, 6, 11, 12].

Для устранения укорочений костей конечностей наиболее надежными являются методики чрескостного дистракционного остеосинтеза. Классическим режимом считается удлинение на 1 мм в сутки, распределенное на 4 приема. Вместе с тем, исследуются возможности увеличения суточного темпа дистракции до 3 мм, что позволяет сократить период удлинения, а следовательно, и продолжительность лечения животных [1, 2, 8, 10, 14, 15].

Цель исследования - используя биохимические маркеры, определить активность остеосинтетической фазы и оценить реакцию воспаления при удлинении костей голени у собак с применением различных режимов дистракции.

Материал и методы исследования. Для достижения поставленной цели в сыворотке крови животных определяли активность щелочной и тартратрезистентной кислой фосфатаз, как показателей образования и резорбции костной ткани, соответственно, а также динамику общего и С-реактивного белка, белковых фракций и сиаловых кислот, как маркеров воспаления.

Биохимические показатели изучали в сыворотке крови 38 беспородных собак (возраст 1-3 года). Всем животным после чрескостного остеосинтеза костей голени аппаратом Илизарова через 7 суток после флексионной остеоклазии костей голени выполняли удлинение сегмента. Животные были разделены на три группы. В 1-й группе - 19-ти собакам через 7 суток после закрытой флексионной остеоклазии проводили удлинение костей голени по Илизарову с режимом удлинения 1мм/сутки за 4 приема вручную в течение 28 суток. Во 2-й группе - 9-ти собакам после закрытой флексионной остеоклазии проводили удлинение костей голени по Илизарову с режимом удлинения 1,5 мм/ сутки за 6 приемов вручную в течение 20 суток, в 3-й группе - 10-ти собакам после закрытой флексионной остеоклазии проводили удлинение костей голени по Илизарову с режимом удлинения 3 мм/сутки в автоматическом режиме за 120 приемов в течение 10-ти суток. Конечная величина удлинения голени во всех группах была одинакова и в среднем составила 14,5±0,8% от общей длины сегмента.

В сыворотке крови животных в динамике определяли активность щелочной (ЩФ) и тартратрезистентной кислой (ТрКФ) фосфатаз, концентрацию общего белка, белковых фракций, С-реактивного белка, уровень сиаловых кислот (СК).

Активность ЩФ и ТрКФ, концентрацию общего и С-реактивного белка в сыворотке крови определяли на автоматическом биохимическом анализаторе Hitachi/BM 902 (Япония) (регистрационный № МЗ РФ 2000/564), используя наборы реагентов фирмы Vital Diagnostics (Россия). Содержание сиаловых кислот - наборами реагентов "Си-алотест 100" (Россия). Электрофоретическое разделение белковых фракций проводили на системе Paragon (Beckman, США) (регистрационный № 2005/282) с использованием реактивов и пластин этой же фирмы.

На проведение экспериментального исследования получено разрешение Комитета по этике при ФГБУ "РНЦ "ВТО" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздрава России.

Результаты в таблицах представлены в виде средней арифметической и стандартного отклонения. Биохимические показатели, полученные на сроках эксперимента, сравнивали с дооперационными значениями, статистическую значимость различий оценивали с помощью W-критерия Вилкоксона для независимых выборок. Достовер

ность межгрупповых различий на сроках наблюдения определяли с помощью критерия Крускала-Уоллиса, с последующим множественным сравнением с использованием критерия Данна.

Результаты исследования и их обсуждение. Для выяснения характера процесса остеосинтеза определяли активность ЩФ и ТрКФ, так как эти показатели являются маркерами костеобразования и резорбции костной ткани, соответственно. Результаты представлены в таблице 1.

При изучении активности фосфатаз в сыворотке крови собак которым удлиняли голень с режимом 1 мм в сутки за 4 приема (1-я группа), нами было отмечено достоверное повышение ЩФ во второй половине этапа дистракции и в конце фиксации. При этом максимально высокое значение наблюдалось в конце дистракции, что на 46% превышало дооперационный уровень (p<0,05). У животных с темпом удлинения 1,5 мм в сутки за 6 приемов (2-я группа) достоверно высокая активность ЩФ была отмечена в конце этапа дистракции и в конце периода фиксации, что превышало исходные значения на 28 и 29%, соответственно (p<0,05). У собак 3-й группы первое достоверно высокое значение ЩФ в сыворотке крови обнаруживалось в середине этапа дистракции, на значимо высоком уровне активность фермента сохранялась до 15-х суток фиксации. Максимальная активность фермента была отмечена в конце дистракции, что на 108% превышало дооперационный уровень (p<0,05). В целом же у животных этой группы уровень ЩФ в сыворотке крови на этапе дистракции и в первой половине фиксации был достоверно выше значений у собак двух других групп.

Таблица 1. Активность фосфатаз и их соотношение в сыворотке крови собак при удлинении костей голени в различных режимах (Xi±o)

Примечание: * - достоверность различий с дооперационными значениями при уровне значимости р<0,05; верхний индекс - достоверность различий с группами 1, 2, 3 соответственно при уровне значимости р<0,05. 1-я группа - удлинение 1 мм в сутки за 4 приема; 2-я группа - удлинение 1,5 мм в сутки за 6 приемов; 3-я группа - удлинение 3 мм в сутки за 120 приемов в автоматическом режиме.

Максимальные значения активности ТрКФ в сыворотке крови собак 1-й группы наблюдались в начале дистракции (8,80±1,01 Е/л, при p<0,05, до операции 4,77±0,68 Е/л), что также было достоверно выше значений животных 2-й и 3-й групп на этом сроке. В ходе дистракции активность ТрКФ снижалась, и в конце этапа была минимальной. У животных 2-й группы, как и в предыдущем случае, в начале дистракции уровень ТрКФ был достоверно выше нормы (p<0,05), составляя 6,30±0,70 Е/л (до операции 4,80±0,80 Е/л), но уже к середине дистракции резко падал до 3,12±0,72 Е/л (p<0,05). У собак 3-й группы отмечены максимальные значения ТрКФ в середине дис-тракции 7,25±2,62 Е/л (p<0,05) и минимальные - в конце фиксации 3,16±1,02 Е/л (p<0,05), при дооперационном уровне 4,50±1,35 Е/л.

Индекс фосфатаз (соотношение ЩФ/ТрКФ) у животных 1-й группы был минимальным в начале этапа дистракции 7,1±3,8 (p<0,05), к середине дистракции наблюдалось достоверное его увеличение, с максимумом в конце дистракции - 40,6±11,7 (p<0,05). У животных 2й группы максимальный подъем фосфатазного индекса был отмечен в середине этапа дистракции - 28,1±5,1 (p<0,05), затем наблюдалось постепенное его снижение. Соотношение фосфатаз у собак 3-й группы было значимо высоким в начале дистракции 28,6±7,9 (p<0,05), повторный резкий подъем его наблюдался в конце дистракции до 41,3±10,7 Е/л (p<0,05). При межгрупповом сравнении стоит отметить следующие факты: достоверно высокую активность ТрКФ в начале этапа дистракции у собак 1-й группы по сравнению с животными 2-й и 3-й групп; низкую активность ТрКФ и высокое соотношение фосфатаз в середине этапа дистракции у животных 2-й группы относительно животных двух других групп; достоверно высокие значения соотношения ЩФ/ТрКФ у животных 3-й группы на 15-е сутки фиксации; низкую активность ТрКФ в конце этапа фиксации у собак 3-й группы относительно животных других групп.

Полученные данные говорят о том, что наибольшая вариабельность активности фосфатаз в сыворотке крови отмечалась у животных с темпом дистракции 3 мм в сутки (3-я группа). У животных с режимом удлинения 1 мм в сутки за 4 приема вначале отмечалась активация резорбтивных процессов (рост ТрКФ), с последующим переходом в остеосинтетическую фазу (рост ЩФ), которая достигала значительной активности во второй половине дистракции. У животных с режимом дистракции 1,5 мм за 6 приемов активность костеобразования была значительно подавлена, как во второй половине дистракции (10-20-е сутки), так и на этапе фиксации. У собак, которым удлинение проводили в режиме 3 мм в сутки за 120 приемов, значительная активация остеосинтетических процессов приходилась на первую половину (первые 15 суток) фиксации.

В сыворотке крови экспериментальных животных была определена концентрация общего белка, содержание альбумина и глобули-новых фракций (табл. 2).

Таблица 2. Концентрация общего белка и белковых фракций (г/л) в сыворотке крови собак при удлинении костей голени в различных режимах (Xi±o)

Примечание: * - достоверность различий с дооперационными значениями при уровне значимости р<0,05; верхний индекс - достоверность различий с группами 1, 2, 3 соответственно при уровне значимости р<0,05. 1-я группа - удлинение 1 мм в сутки за 4 приема; 2-я группа - удлинение 1,5 мм в сутки за 6 приемов; 3-я группа - удлинение 3 мм в сутки за 120 приемов в автоматическом режиме

Концентрация общего белка у животных всех групп на разных этапах эксперимента была увеличена, так уровень общего белка в сыворотке крови собак 1-й группы был достоверно выше доопера-ционных значений в конце дистракции (74±5 г/л, р<0,05); во 2-й группе - в середине и в конце дистракции, соответственно 74±5 г/л и 74±4 г/л (р<0,05); в 3-й группе - в середине дистракции и во время периода фиксации.

На фоне роста уровня общего белка на протяжении всего периода наблюдения у собак всех групп была отмечена гипоальбу-минемия. Лишь в первой группе в конце фиксации концентрация альбуминов восстанавливалась до значений дооперационного уровня. Рост уровня общего белка у экспериментальных животных, при выраженной гипоальбуминемии, происходил за счет увеличения гло-булиновых фракций.

Во всех трех группах достоверный рост относительно исходных значений а1-глобулинов, представленных преимущественно а1-ан-титрипсином (а1-АТ), был отмечен уже в начале дистракции. Известно, что а1-АТ играет важную регуляторную роль в антивоспалитель-ном ответе, являясь основным инактиватором сериновых протеаз в плазме, ингибируя трипсин, химотрипсин, плазмин, тромбин и др. Белок действует как первичный ингибитор эластазы полимор-фоядерных лейкоцитов (PMN-эластаза) и секретируется во время воспаления, снижая протеолитическую активность PMN-эластазы в месте воспаления [3]. У собак 2-й группы увеличение данного показателя в начале дистракции было максимальным по сравнению с другими сроками наблюдения. Максимальный рост концентрации а1-глобулинов у собак 1-й группы отмечался в конце дистракции, у животных 3-й группы - в середине дистракции.

Концентрация а2-глобулинов, в основном состоящих из а2-макроглобулина (а2-МГ) и гаптоглобина, достоверно возрастала у собак всех групп в начале дистракции, и сохранялась таковой до середины фиксации. а2-МГ - ингибитор всех известных классов эндопептидаз (серин-, цистеин-, аспартатметаллопротеиназ); как острофазный белок защищает эндотелий от действия протеаз.

Гаптоглобин - специфический белок (острофазовый протеин, транспротеин), участвующий в связывании с гемоглобином и, тем самым, предохраняющий его от выделения с мочой, что сохраняет очень ценное для организма железо. Усиление гемолиза эритроцитов сопровождается падением уровня гаптоглобина крови, тогда как стрессовые, воспалительные и некробиотические состояния, наоборот, приводят к возрастанию его содержания. Увеличение уровня гаптоглобина в крови отмечается при острых воспалительных процессах, опухолях, нефротическом синдроме [13].

При этом можно отметить определенную тенденцию: на сроках дистракции и фиксации уровень а2-глобулинов крови был повышен в ряду 1<2<3-группы. У собак 2-й и 3-й групп восстановление уровня а2- глобулинов до исходных значений отмечено на 30-е сутки послеснятия аппарата.

Бета-глобулины (трансферрин, С3- и С4- компоненты комплемента) также являются острофазными белками. Содержание р-гло-булинов в крови животных всех групп достоверно возрастало с середины этапа дистракции и сохранялось до конца фиксации.

Уровень Y-глобулинов у собак 1-й группы в течение всего эксперимента достоверно от исходных значений не отличался. Во 2-й группе статистически значимое увеличение Y-глобулинов по сравнению с дооперационным уровнем было в середине и конце дистракции, а в 3-й группе - в конце дистракции и во время фиксации.

Таким образом, представленные данные говорят о развитии диспротеинемии в ходе оперативного удлинения костей голени на фоне гипоальбуминемии и наличии достаточно выраженной воспалительной реакции организма животных на удлинение. Следует отметить, что в группе 1 с режимом дистракции 1 мм в сутки за 4 приема содержание острофазных белков группы а-глобулинов возвращается к дооперционному уровню раньше, чем в двух других группах.

Для оценки воспалительной реакции дополнительно в сыворотке крови экспериментальных животных мы определяли концентрацию С-реактивного белка и сиаловых кислот (табл. 3).

В ходе исследования нами было обнаружено, что концентрация СК у животных 1-й группы была достоверно высокой на протяжении всего эксперимента, при этом максимум отмечался на 15-е сутки фиксации, составляя 4,14±0,66 ммоль/л, что на 33% (p<0,05) превышало дооперационный уровень 3,11±0,46 ммоль/л.

Таблица 3. Концентрация С-реактивного белка и сиаловых кислот в сыворотке крови собак при удлинении костей голени в различных режимах (Xi±o)

Примечание: * - достоверность различий с дооперационными значениями при уровне значимости р<0,05; верхний индекс - достоверность различий с группами 1, 2, 3 соответственно при уровне значимости р<0,05. 1-я группа - удлинение 1 мм в сутки за 4 приема; 2-я группа - удлинение 1,5 мм в сутки за 6 приемов; 3-я группа - удлинение 3 мм в сутки за 120 приемов в автоматическом режиме.

У собак 2-й группы достоверно высокий уровень СК, как и у животных 1-й группы, был отмечен с начала периода дистракции. Максимальная концентрация СК у собак 2-й группы была зафиксирована в середине этапа дистракции - 4,59±0,18 ммоль/л, что на 48% (p<0,05) превышало исходные значения. Значимое увеличение уровня СК у собак данной группы сохранялось и после снятия аппарата.

Уровень СК у собак 3-й группы, как и в других группах, был достоверно высоким с начала периода дистракции. Максимальное значение данного метаболита было зарегистрировано в конце дист-ракции 4,30±0,48 ммоль/л, что на 40% (p<0,05) превышало доопера-ционный уровень, на 30-е сутки после снятия аппарата концентрация СК статистически значимо от нормы не отличалась. Высокая концентрация СК в сыворотке крови животных всех групп в течение периода дистракции и фиксации, также указывала на наличие определенного уровня воспалительной реакции [9].

Выводы. Таким образом, в результате эксперимента выявлено, что у животных с режимом удлинения 1 мм в сутки за 4 приема значительная активность остеосинтетической фазы (рост ЩФ) наблюдалась во второй половине дистракции. У животных с режимом дистракции 1,5 мм за 6 приемов активность костеобразования была подавлена во второй половине дистракции (10-20-е сутки) и на этапе фиксации. У собак, которым удлинение проводили в режиме 3 мм в сутки за 120 приемов, значительная активация остеосинтетических процессов приходилась на первую половину (первые 15 суток) фиксации.

У животных всех трех групп во время этапа дистракции обнаружено увеличение концентрации в сыворотке крови С-реактивного белка, сиаловых кислот, а также общего белка за счет роста уровня глобулинов на фоне гипоальбуминемии. Отмечено, что в группе 1 с режимом дистракции 1 мм в сутки за 4 приема содержание острофазных белков фракций а1- и а2-глобулинов достигает дооперационных значений в более ранние сроки эксперимента.

Проведенное исследование позволяет сделать следующее заключение: определенный уровень воспалительной реакции наблюдается при разных режимах удлинения, что является важным компонентом дистракционного остеогенеза. При этом интенсивность первичной воспалительной реакции, по нашему мнению, определяет дальнейший характер и исход репаративных процессов, в связи с этим определение показателей воспаления может использоваться для прогноза течения и мониторинга дистракционного остеогенеза.

Список литературы:

1. Биохимические исследования сыворотки крови и скелетных мышц при удлинении голени аппаратом Илизарова с темпом дистракции 3 мм в сутки в автоматическом режиме / С.А. Ерофеев, С.Н. Лунева, М.В. Стогов, Н.В. Тушина // Вестник новых медицинских технологий. - 2005. - № 3-4. - С. 89-91.
2. Горбач Е.Н. Особенности морфогенеза костной ткани при удлинении голени методом чрескостного дистракционного остеосинтеза при повышенном суточном темпе / Е.Н. Горбач, М.А. Степанов // Морфология. - 2015. - Т. 147. № 2. - С. 69-74.
3. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике (в 2-х томах). - Минск, 2000. - 463 с.
4. Кирсанов К.П. Технология лечения повреждений таза у мелких домашних животных методом чрескостного остеосинтеза / К.П. Кирсанов, В.В. Краснов, В.Н. Тимофеев // Ветеринарная патология. - 2006. - №2. - С. 57-63.
5. Лечение открытых диафизарных переломов костей голени у кошек / С.В. Тимофеев, Ю.И. Филлипов, В.А. Бахтинов, Н.В. Петровская, Н.А. Кононович // Ветеринария. - 2006. - №2. - С. 61-62.
6. Неведров А. В. Оперативное лечение ложных суставов костей голени у собак методом чрескостного компрессионно-дистракционного остеосинтеза аппаратом ГА. Илизарова / А. В. Неведров, К. В. Мануйлов // Ветеринария.-2004. - №5. - С. 56 - 57.
7. Осложнения у собак карликовых пород при лечении переломов костей предплечья / С.Я. Ягодников, П.С. Кожушко, О.А. Кулешова, Я.А. Кулешова // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. 2014. - № 1. С. 6-10.
8. Особенности энергетического метаболизма скелетных мышц собак в условиях удлинения голени по Илизарову / М.В. Стогов, Л.С. Кузнецова, С.Н. Лунева, С.А. Ерофеев // Бюллетень Восточно-Сибирского научного центра СО РАМН. - 2002. - № 6. - С. 176-179.
9. Оценка остеорепарации у пациентов в ходе косметической коррекции длины нижней конечности по методу Илизарова / Э.С. Колесникова, М.В. Стогов, К.И. Новиков, З.С. Велиев, Н.В. Тушина // Гений ортопедии. - 2013. - № 2. С. 98-101.
10. Попков А.В. Дистракционный остеосинтез - перспективы развития / А.В. Попков, Д.А. Попков // Гений ортопедии. - 2006. - № 4. - С. 30-37.
11. Силантьева Т.А. Репаративная регенерация и адаптивная перестройка тканей нижней челюсти при лечении ее множественной травмы методом чрескостного остеосинтеза (экспериментально-морфологическое исследование) / Т.А. Силантьева, В.В. Краснов, Н.А. Добычина // Стоматология. - 2012. Т. 91. № 4. - С. 7-10.
12. Шакирова Ф.В. Метод чрескостного внеочагового остеосинтеза стержневым аппаратом наружней фиксации у собак / Ф.В. Шакирова // Международный вестник ветеринарии. - 2009. - №1. - С. 19-21.
13. Шевченко О.П., Долгов В.В., Олефиренко ГА. Электрофорез в клинической лаборатории. I. - М.: Реафарм, 2006. - 160 с.
14. Paley D. Principles of deformity correction. - Berlin, Heidelberg, New York, Barcelona, Hong Kong, London, Milan, Paris: Springer, 2002. - 806 p.
15. Sailhan F. Bone lengthening (distraction osteogenesis) / F. Sailhan // Osteoporos Int. - 2011. - v. 22. - № 6. - Р. 2011-2015.

Резюме. На сегодняшний день в России и за рубежом одной из проблем ветеринарной медицины остается поиск оптимальных способов лечения и реабилитации мелких домашних животных с патологией опорно-двигательного аппарата различного генеза. Целью работы стало определение активности ос-теосинтетической фазы костеобразования и оценка воспалительной реакции у собак при оперативном удлинении костей голени по Илизарову. В сыворотке крови беспородных собак, которым проводили удлинение костей голени, определяли концентрацию общего белка, белковых фракций, С-реактивного белка, сиаловых кислот, активность щелочной и кислой фосфатаз. Результаты исследования показали, что у животных 1-й группы остеосинтетическая фаза достигала значительной активности во второй половине дистракции, во 2-й - активность костеобразования была подавлена как во второй половине дистракции, так и на этапе фиксации; в 3-й - активация остеосинтетических процессов приходилась на первую половину фиксации. У собак всех групп во время дистракции обнаружено увеличение концентрации в сыворотке крови С-реактивного белка, сиаловых кислот и общего белка за счет роста уровня глобулинов на фоне ги-поальбуминемии. В группе 1 с режимом дистракции 1 мм в сутки за 4 приема содержание острофазных белков фракций а1- и а2-глобулинов достигало доопе-рационных значений в более ранние сроки эксперимента. У животных с темпом удлинения 1,5 и 3 мм в сутки наблюдалась гиперактивация воспалительных и защитных механизмов, что приводило к нарастанию интоксикации и быстрому истощению их резервов. Таким образом, интенсивность первичной воспалительной реакции определяет исход репаративных процессов при дистракцион-ном остеосинтезе. В связи с этим определение показателей воспаления может использоваться для прогноза течения и мониторинга дистракционного остеогенеза.

Ключевые слова: опорно-двигательный аппарат, дистракционный остеосинтез, дистракционный остеогенез, удлинение костей голени, флексионная остеоклазия, метод Илизарова, биохимия крови, маркеры костеобразования, остеосинтетическая фаза, воспалительная реакция.

Сведения об авторах:

Талашова Ирина Александровна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биохимии ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8(3522)450538; e-mail: i_talashova@mail.ru.

Кононович Наталья Андреевна, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник лаборатории коррекции деформаций и удлинения конечностей, ветеринарный врач ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8(3522)454060; e-mail: n.a.kononovich@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Тушина Наталья Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории биохимии ФГБУ "Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" им. акад. Г.А. Илизарова" Минздрава России; 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, 6; тел.: 8(3522)450538; e-mail: ntushina76@mail.ru.