Параметры суспензионного культивирования культуры клеток внк-21/13-13 в масштабах биотехнологического производства

УДК 619:578:616.98:578.828.11

Крюкова Е.Н., Самуйленко А.Я., Мельник Р.Н. ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности", Московская область, пос. Биокомбината
Ельников В.В., Красуткин С.Н., Литенкова И.Ю. ФКП "Щелковский биокомбинат", Московская область, пос. Биокомбината
Боровой ВН. Департамент ветеринарии МСХРФ, г. Москва
Мельник НВ. "Национальная Ассоциация ветеринарно-биологической промышленности" ("Ветбиопром"), г. Москва
Дресвянникова С.Г. ГКУ КСББЖ "Краснодарская", г. Краснодар

Введение. Суспензионные культуры являются наиболее перспективными в решении практических проблем, связанных с получением вирусных и клеточных материалов. При благоприятных условиях клетки в суспензии дают более высокий урожай, чем в стационарных средах.

Для изготовления требуемого количества противовирусных вакцин необходимы современные технологии изготовления, в частности, в последние годы для производства вакцин практикуется использование перевиваемых культур клеток. После того как появилась возможность выращивать вирус в культурах, на повестку дня встал вопрос о разработке приемов масштабирования таких культур, которые обеспечивали бы промышленное производство вакцин. С этой целью часто используют клеточную культуру ВНК-21, отдельные клоны которой, можно выращивать в суспензионных условиях без поддерживающей поверхности, практически неограниченно и использовать в качестве биологического субстрата для репродукции многих вирусов, в частности ящура, бешенства [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7].

Целью работы стала адаптация "ВНК-21/13-13 - перевиваемой монослойно-суспензионной сублинии клеток почки новорождённого сирийского хомячка" к суспензионному способу выращивания с использованием питательной среды для суспензионного выращивания в масштабах биотехнологического производства.

Материалы и методы. Нами получена культура клеток ВНК-21/13-13 в Российской коллекции клеточных культур в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (РККК) (СХЖ РАСХН) ВИЭВ при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко. Линии клеток присвоен коллекционный № 89.

Перевиваемая линия клеток ВНК-21/13-13 выделена из линии клеток ВНК-21/13-02, и используется в производстве ФКП "Щелковский биокомбинат".

Результаты исследований. Клетки ВНК-21/13-13 предназначены для промышленного культивирования с целью выработки вируссодержащего сырья для изготовления противовирусных вакцин. Перевиваемая сублиния клеток ВНК чувствительна к вирусу ящура и бешенства, жизнеспособна при хранении в жидком азоте в течение 10 лет и 14 дней при 4°С.

Клетки адаптированы к суспензионному культивированию при аэрации воздухом и выдерживают колебания рН в пределах 6,6-7,4 в пассажах, свободны от контаминатов.

Адаптацию клеток к суспензионным условиям культивирования Б проводили в биоферментёре MD-300 фирмы "MARUBISHI" (Япония) с автоматическим поддержанием концентрации водородных ионов (рН 6,9-7,0), температуры (37°С), ручным регулированием подачи воздуха и скорости перемешивания (до 100 об/мин). Культивирование проводили используя питательную среду на основе раствора Хенкса, содержащую 0.25% суммы гидролизатов лактальбумина и мышечных белков, 7% сыворотки крупного рогатого скота, пять аминокислот и витамины группы В.

В первых трёх пассажах отмечали некоторое уменьшение численности популяции к концу культивирования, что требовало увеличить засевную концентрацию клеток до 500 тыс/мл. Последующие пять пассажей клетки росли с образованием довольно значительных клеточных конгломератов, появлением зернистости в цитоплазме. При дальнейшем пассажировании, с 9-го по 13 пассаж, число конгломератов уменьшалось, цитоплазма становилась прозрачной и гомогенной. Посадочную концентрацию снизили до 200 тыс/мл, популяция клеток в суспензии увеличивалась в 6-7 раз, время генерации составило 48 часов. После проведения 13 пассажей в суспензии, были получены клетки, отличающиеся однообразием морфологии и размера, с небольшим количеством конгломератов и высокой пролиферативной активностью (индекс пролиферации составил 5-7).

Процесс выращивания культуры клеток для формирования производственного банка начинали с извлечения ампул с консервированной суспензией маточной культуры клеток ВНК-21/13-13 из хранилища (рисунок 1).

Выращивание клеток ВНК-21 /13-13 в КС-40 в объеме 30 л. Подготовленный культиватор размещают на установке для культивирования, в стерильный бокс выводят рабочие шланги, заполняют питательной средой в объеме 22 л, включают перемешивающее устройство, подогревают до 37°С и через штуцер по стерильному шлангу перекачивают культуру клеток под давлением 0,2 атм. из КС-40 (где культивируют клетки в объеме 8-10 л). Добавляют 10 мл пеногасите-ля. Исходная концентрация клеток должна быть 0,4-0,5 млн/мл, рН 7,05-7,15, скорость перемешивания постоянной в пределах 35-40 об/мин.

Через два часа после заполнения культиватор (период, необходимый для адаптации культуры, установления газового равновесия между жидкой и газовой фазами, накопления С02 и снижения рН до 7,0) начинают аэрацию культуры воздухом. Подачу воздуха регулируют в зависимости от объема суспензии и продолжительности выращивания клеток. Режим аэрации в КС-40 приведен в таблице 1.

Через 20-48 ч культивирования клеток берут пробу для определения концентрации и жизнеспособности клеток, проводят корректировку рН 7,5 %- ным раствором бикарбоната натрия.

Выращивание клеток ВНК-21/13-13 в 200 л реакторе. Культиватор тщательно моют, проверяют его на герметичность путем подачи в него воздуха до 0,7 атм. Если за 30 минут давление в реакторе упадет не более, чем на 0,1 кг/см, то такой реактор считают герметичным. В случае большой утечки воздуха находят место разгерметизации с помощью мыльного раствора и устраняют неисправности.

Рис. 1. Получение производственного банка клеток ВНК 21/13-13

Таблица 1.

Загрузка 200 л реактора и культивирование клеток. В реактор с питательной средой (80 л), нагретой до 37°С, перекачивают 30 л суспензии клеток из КС-40. Культивирование осуществляют в течение 48 часов, при скорости перемешивания культуры 25-30 об/мин. Аэрацию осуществляют воздухом, подачу которого начинают через 2 часа после начала культивирования. В первые сутки воздух подают из расчета 1,5 объема на один объем суспензии клеток, вторые сутки - 2 объема воздуха на объем клеток в час.

Через 20-48 часа культивирования осуществляют коррекцию рН 7.5 %-ным раствором бикарбоната натрия. Одновременно осуществляют контроль стерильности культуры, определяют концентрацию и жизнеспособность клеток.

Выращивание клеток ВНК-21/13-02 в 600 л реакторе. Культивирование осуществляется в реакторе объемом 600 литров. В реактор фильтруют питательную среду, включают перемешивающее устройство, систему термостатирования. При достижении температуры питательной среды 37°С в реактор перекачивают суспензию клеток из 200 литрового реактора. По истечении 2 часов после посева клеток отбирают пробу для измерения рН, концентрации клеток, контроля стерильности и подают через барбатер воздух для аэрации культуры. Через 20 и 48 часов культивирования осуществляют коррекцию рН 7.5 %-ным раствором бикарбината натрия. Процесс выращивания клеток ведут в течение 48 часов при непрерывном перемешивании со скоростью 35 об/мин., подсчет клеток проводят при взятии пробы для корректировки рН.

В процессе выращивания возможны поломки в системах перемешивания, термостатирования и аэрации культуры. Неисправности устраняют без разгерметизации реактора. После устранения неисправностей процесс выращивания продолжают, если доля жизнеспособных клеток составляет не менее 90%. По окончании цикла выращивания суспензию клеток передают на заражение вирусом, если концентрация не ниже 1,6 млн/мл., жизнеспособных клеток не менее 90%, отсутствует грибково-бактериальная микрофлора.

Заключение. Усовершенствованы технологии получения недорогих эффективных универсальных вакцин для крупного и мелкого рогатого скота, собак и кошек, которые по иммуногенности и стабильности конкурентоспособны лучшим современным зарубежным аналогам. С целью установления оптимального режима культивирования клеток и вируса в суспензии проведены испытания по отработке начальной посевной концентрации клеток и режимов перемешивания. Максимальное накопление клеток и вируса было получено при следующих показателях основных технологических параметров (табл. 2).

Таблица 2. Основные показатели технологического режима культивирования клеток ВНК-21 и вируса бешенства, штамм "Щелково-51"

Разработанная нами технология позволила обеспечить потребность сельского хозяйства Российской Федерации и стран СНГ в эффективных препаратах и внести весомый вклад в улучшение эпизоотической ситуации по ящуру и бешенству, наметить пути совершенствования технологий с переходом на инновационную технологию изготовления противоящурных, антирабических вакцин, с использованием вирусов ящура и бешенства, культивируемых в суспензии клеток ВНК-21/13-13.

Список литературы:

1. Сергеева С.П. Потребности культур клеток в пластических I веществах и некоторые вопросы конструирования питательных сред. Бюллетень ВИЭВ, №33, М., 1978.
2. Дьяконов Л.П. Специализированная Коллекция клеточных культур сельскохозяйственных и промысловых животных (СХЖ РАСХН) РККК РАН и криобанк ВИЭВ, "Консервация генетических ресурсов", Материалы XIV рабочего совещания, Пущино, 28-30 мая 1996, 76-79 с.
3. Дьяконов Л.П., Бахарев В.Н. Методические рекомендации по получению и субкультивированию культур клеток из репродуктивных органов самок крупного рогатого скота. М. 1983 г.
4. Дьяконов Л.П. Проблемы культивирования клеток животных и некоторые вопросы цитопатологии. Бюлл, ВИЭВ, выпуск 49, 1983 г. стр. 3-8.
5. Игнатова Т.Н. Трансформация клеток. В кн. "Биология клетки в культуре" Ленинград, 1984, стр. 101-194.
6. Федотова А. В., Снежко А. Г., Федотов А. В. и др. Культивирование клеток млекопитающих на биологически активном полимерном субстрате. "Биотехнология" - 1992, №4, с. 15-17.
7. Животная клетка в культуре. Под ред. Л.П. Дьяконова, В.М. Ситькова. М., Спутник+, 2000. 400 с.

Резюме. Суспензионные культуры являются наиболее перспективными в решении практических проблем, связанных с получением вирусных и клеточных материалов. При благоприятных условиях клетки в суспензии дают более высокий урожай, чем в стационарных средах. В статье представлены научные данные по изучению суспензионного культивирования культуры клеток ВНК-21/13-13 в масштабах биотехнологического производства, адаптации к суспензионному способу выращивания и использовании ее в изготовлении проти-воящурных и антирабических вакцин. Показана технологическая постадийная схема получения производственного банка клеток ВНК-21/13-13. Показаны параметры культивирования в КС-40 в объеме 30 л, выращивание клеток в 200600 литровых реакторах в промышленных технологиях по изготовлению противовирусных вакцин. В статье описаны основные показатели технологического режима культивирования культуры клеток ВНК-21/13-13 в производственных условиях. Авторами усовершенствованы технологии получения недорогих эффективных универсальных вакцин для крупного и мелкого рогатого скота, собак и кошек, которые по иммуногенности и стабильности конкурентоспособны лучшим современным зарубежным аналогам. С целью установления оптимального режима культивирования клеток и вируса в суспензии проведены испытания по отработке начальной посевной концентрации клеток и режимов перемешивания. Разработанная авторами технология позволила обеспечить потребность сельского хозяйства Российской Федерации и стран СНГ в эффективных препаратах и внести весомый вклад в улучшение эпизоотической ситуации по ящуру и бешенству, наметить пути совершенствования технологий с переходом на инновационную технологию изготовления противоящурных, антирабических вакцин, с использованием вирусов ящура и бешенства, культивируемых в суспензии клеток ВНК-21/13-13.

Ключевые слова: культура клеток, суспензия, питательная среда, суспензионное культивирование, перевиваемая сублиния клеток, пассаж, фильтры, реакторы, технологическая схема производства, аэрация.

Сведения об авторах:

Крюкова Елена Николаевна, соискатель ФГБНУ "Всероссийский научноисследовательский и технологический институт биологической промышленности"; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8(985)3948012; e-mail: krukovaen@biocombinat.ru.

Самуйленко Анатолий Яковлевич, доктор ветеринарных наук, академик РАН, директор ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности"; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8(910)4253914; e-mail: vnitibp@mail.ru.

Ельников Василий Викторович, кандидат биологических наук, главный технолог ФКП "Щелковский биокомбинат"; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8(983)948035; e-mail: velnikov@yandex.ru.

Красуткин Сергей Николаевич, кандидат биологических наук, советник противовирусного производства ФКП "Щелковский биокомбинат"; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8(985)3948031; e-mail: krasotkin@biocombinat.ru.

Литенкова Ирина Юрьевна, кандидат ветеринарных наук, главный технолог научно-исследовательской работы ФКП "Щелковский биокомбинат"; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8(985)3948034; e-mail: litenkova2012@mail.ru.

Боровой Владимир Николаевич, кандидат ветеринарных наук, заместитель директора Департамента ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации; 107139, г. Москва, ул. Садово-Спасская, д. 11/1; тел.: 8(916)2369350; e-mail: borovoi-vn@mail.ru.

Мельник Николай Васильевич, доктор ветеринарных наук, профессор, президент Национальной Ассоциации ветеринарно-биологической промышленности (Ассоциация "Ветбиопром"); 107139, г. Москва, ул. Садово-Спасская, д. 11/1; тел.: 8(905)5450346; e-mail: a-vbp@mail.ru.

Дресвянникова Светлана Георгиевна, кандидат ветеринарных наук, начальник ГКУ КСББЖ "Краснодарская"; 350004, г. Краснодар, ул. Калинина. 15/1; тел.: 8 (861) 221-63-60; e-mail: kraivet.dsg@mail.ru.

Ответственный за переписку с редакцией: Мельник Роман Николаевич, кандидат биологических наук, заведующий отделом ФГБНУ "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности"; 141142, Московская область, Щелковский район, пос. Биокомбината; тел.: 8(926)8510696; e-mail: romanos@mail.ru.