Патогенный потенциал энтеробактерий, выделенных от новорожденных телят при острых кишечных заболеваниях

УДК 579.62:636.2.053

Терехов В.И. ГБПОУ КК «Пашковский сельскохозяйственный колледж», г. Краснодар
Малышева Т.В. ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Краснодар
Тищенко А.С, Мусатова Н.С. ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет
имени И.Т. Трубилина», г. Краснодар

Введение. Острые кишечные заболевания новорожденных телят являются доминирующей единицей в нозологии болезней данных животных. Они распространены не только в Российской Федерации, но и за рубежом, при этом нанося значительный экономический ущерб [12, 13, 14, 16]. В подавляющем большинстве случаев причиной диарей является развитие дисбактериоза с преобладанием в составе кишечной микрофлоры бактерий из семейства Enterobacteriaceae [5, 7, 10, 11]. В этом случае заболевание приобретает характер смешанной кишечной инфекции, которой свойственно быстрое распространение, высокая заболеваемость, тяжёлое течение и сложность лечения [11, 12]. Тем не менее, при расшифровке этиологии диарей, по-прежнему основное внимание уделяется исключительно Escherichia coli, даже если одновременно с ней из патологического материала выделяются другие энтеробактерии, такие как энтеробактеры, цитробактеры, клебсиеллы, протеи, провиденсии, которые могут обладать сразу несколькими генетическими маркерами патогенности [1, 7]. И не смотря на это вопрос об этиологической значимости условно патогенныхэнтеробактерий остаётся открытым. В литературе, например, можно встретить, как утверждение о не способности клебсиелл обуславливать диарею [5], так и, напротив, о большом патогенном потенциале этих и других энтеробактерий, обеспечивающем их участие в развитии инфекционного процесса [1, 10].

Цель работы состояла в выявлении у наиболее часто выделяемых от телят при острых кишечных заболеваниях энтеробактерий некоторых факторов патогенности, способствующих развитию диареи.

Материалы и методы исследований. В представленной работе были использованы эпизоотические штаммы из числа наиболее часто выделяемых от телят на территории Краснодарского края при острых кишечных заболеваниях видов энтеробактерий, а именно Escherichia coli (89), Enterobacter cloacae (55), Klebsiella pneumoniae (46) и Citrobacter freundii (30). Наличие гемолитической активности (ГА) определяли на агаре Хоттингера с добавлением 7% крови барана, но без добавления глюкозы. Адгезивную активность микроорганизмов определяли по В.И. Брилис с соавт. [2] с использованием нативных эритроцитов кроликов. Величину адгезивной активности оценивали по индексу адгезии микроорганизмов (ИАМ). Обнаружение фимбрий общего типа (I тип, F1, MS пили) проводили с помощью манозочувс-твительной реакции гемагглютинации с эритроцитами морской свинки, для чего на предметном стекле смешивали равные объемы (по одной капле) 0,85% раствора NaCl, 5% взвеси эритроцитов и 1 миллиардной суспензии испытуемых клеток энтеробактерий. Параллельно ставили реакцию с аналогичными компонентами, но вместо 0,85% раствора NaCl использовали 1,5% раствор D-маннозы [6]. Антилизо-цимную активность (АЛА) выявляли на твёрдой питательной среде по А.В. Бухарину с соавт. [3]. Способность продуцировать экзотоксины выявляли в тесте отека лапы мыши используя 48 ч бульонные культуры, которые предварительно стерилизовали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 60 мин [4]. Биометрическую обработку полученных результатов проводили, используя возможности программы MicrosoftExcel 2010.

Результаты и их обсуждение. Как показали собственные исследования и сообщения других авторов [9, 11, 12] на E. coli, E. cloacae, K. pneumoniae и C. freundii приходится более половины всех случаев выделения энтеробактерий из патологического материала от телят при диареях. Данное обстоятельство может косвенно свидетельствовать о наличии у E. coli, E. cloacae, K. pneumoniae и C. freundii определённого патогенного потенциала и антагонистических свойств, обеспечивающих им преимущество не только в отношениях с другой кишечной микробиотой, но и макроорганизмом.

В патогенезе развития микробной диареи лежат сложные взаимоотношения между микро- и макроорганизмом, реализация которых осуществляется в основном за счёт наличия у возбудителя способности к адгезии, мембраноатакующему и цитолитическому эффекту, а также способности противостоять факторам защиты хозяина [1].

Исследования, проведенные нами с эпизоотическими штаммами E. coli, E. cloacae, K. pneumoniae и C. freundii показали (табл. 1), что все они в той или иной степени обладают факторами патогенности, обеспечивающими им диареегенные свойства.

Таблица 1. аличие факторов патогенности у энтеробактерий, изолированных от телят при острых кишечных заболеваниях

Как оказалось, способностью прикрепляться к биологическим поверхностям обладало подавляющее большинство (65,5-83,1%) выделенных кишечных палочек, энтеробактеров, клебсиелл и цитро-бактеров, но активность прикрепления в среднем не превышала 4-х бактериальных клеток на одном эритроците, что характеризует изучаемые энтеробактерии как среднеадгезивные [2]. Большинство адге-зинактивных штаммов было среди E. ooli и K. pneumoniae, у которых показатель адгезивности и ИАМ составили, соответственно, 83,1% и 3,98±0,31, 78,3% и 3,33±0,34.

Известно, что прикрепление энтеробактерий к клеткам-хозяина обеспечивается как за счёт фимбриальныхтак и нефимбриальных факторов адгезии. Среди фимбриальных факторов различают общие фимбрии или MS пили и специфические фимбрии или MR пили [1, 15]. Несмотря на то, что к разряду патогенных эшерихий принято относить только те изоляты, которые обладают специфическими пилями (К88, К99, 987Р, F41 и другие), тем не менее, как установлено, варианты, Как оказалось, способностью прикрепляться к биологическим поверхностям обладало подавляющее большинство (65,5-83,1%) выделенных кишечных палочек, энтеробактеров, клебсиелл и цитробактеров, но активность прикрепления в среднем не превышала 4-х бактериальных клеток на одном эритроците, что характеризует изучаемые энтеробактерии как среднеадгезивные [2]. Большинство адгезинактивных штаммов было среди E. соП и K. pneumoniae, у которых показатель адгезивности и ИАМ составили, соответственно, 83,1% и 3,98±0,31, 78,3% и 3,33±0,34.

Известно, что прикрепление энтеробактерий к клеткам-хозяина обеспечивается как за счёт фимбриальныхтак и нефимбриальных факторов адгезии. Среди фимбриальных факторов различают общие фимбрии или MS пили и специфические фимбрии или MR пили [1, 15]. Несмотря на то, что к разряду патогенных эшерихий принято относить только те изоляты, которые обладают специфическими пилями (К88, К99, 987Р, F41 и другие), тем не менее, как установлено, варианты, обладающие MS пилями также могут быть патогенными для животных [7].

Результаты исследований показали, что MS пилями обладало 31,5% изолятов эшерихий, 25,5% энтеробактеров, 23,3% цитробактеров и 13% клебсиелл. Данное обстоятельство может свидетельствовать о том, что в процессе прикрепления изучаемых энтеробактерий к эукариотической клетке, доминирующую роль могут играть не MS пили, а другие факторы адгезии, в том числе нефимбриального происхождения.

Антилизоцимной активностью обладали практически все тестируемые штаммы энтеробактерий, однако у большинства из них АЛА находилась в пределах от 1 до 3 мкг/мл инактивированного лизоцима, что характеризовало их как низко- и среднеактивные [3]. Однако у 25-45% штаммов энтеробактерий АЛА была высокой и составляла 4-5 мкг/мл.Наибольшей способностью нейтрализовыватьлизоцим обладали эшерихии и клебсиеллы, АЛА которых была примерно одинаковой - 3,38 и 3,26 мкг/мл.Несмотря на то, что лизоцим активен в отношении грамположительных, а не грамотрицательных бактерий, последние,по всей видимости, инактивируя его, создают безопасную среду в кишечном тракте, органах и тканях для своих частых ассо-циантов - энтерококков и стрептококков [11, 12]. Кроме того, сам факт наличия способности у энтеробактерий разрушать гуморальные механизмы защиты макроорганизма свидетельствует об их болезне-творности.

К одним из патогенетических элементов развития кишечной инфекции, обусловленной энтеробактериями,относится продуцирование ими гемолизинов, оказывающих мембраноатакующее действие на клетки крови. Гемолизины представляют собой вещества белковой природы, которые при взаимодействии с эритроцитами формируют на их мембранной поверхности каналы благодаря которым в клетке нарушается ионное равновесие и прежде всего образуется переизбыток внутриклеточного Са2+, приводящего в конечном итоге к гибели клетки [1]. Считается, что продукция гемолизинов может так же рассматриваться как альтернативный механизм захвата Fe2+ из лизированных эритроцитов. Кроме того установлено, что при взаимодействии гемолизинпозитивныхэшерихий с полиморфноядерными лейкоцитами сопровождается выделением медиаторов воспаления, которые обуславливают увеличение сосудистой проницаемости [7].

Нами установлено, что наиболее выряженные гемолитические свойства были у E. соП и K. pneumoniae, штаммы которых в 42,7% и 34,8% случаях были гемолитически активны. Количество штаммов E. cloacae и C. freundii, дающих гемолиз на кровяномагаре, было практически в 2 раза меньше. В подавляющем большинстве случаев выделенные от телят тестируемые энтеробактерии давали а-гемолиз.

Если диареегенные механизмы гемолизинов энтеробактерий-до конца еще не ясны, то диареегенное действие их экзотоксинов не вызывает сомнения. Экзотоксины энтеробактерий по характеру специфического действия на клеточные структуры кишечника хозяина подразделяют на цитотонины и цитотоксины. Цитотонины не изменяют клеточные структуры, к ним относят термостабильный (ST) и термолабильный (LT) токсины, продуцируемые эшерихиями и другими энтеробактериями. Цитотоксины полностью разрушают энтероциты, к этому типу токсинов относят цитотоксический некротизирующий фактор (CNFI, II) и шигатоксин (STXI, II) [1, 8, 10].

Для индикации экзотоксинов в своих исследованиях мы использовали классический метод — модель отёка мышиной лапы, хотя изначально онбыл ориентирован на выявление только ST [4]. Однако в работе Н.В.Котковой [8] при сравнительном изучении ряда биотес-тов показано, что в тесте отёка мышиной лапы можно выявлять и другие экзотоксины E. ^li, в частности STX. В связи с чем, мы рассматривали данный метод как универсальный для выявления в целом способности продуцировать экзотоксины без их идентификации.

Результаты исследований показали, что количество токсинообразующих штаммов из числа тестируемых E. ^li, E. cloacae и K. pneumoniae было достаточно большим и находилось в пределах 30,443,8%, исключение составил C. freundii, среди данного вида только 13,3% штаммов продуцировали экзотоксины.

Таким образом, полученные данные позволяют констатировать о наличии выражен-ного патогенного потенциала у энтеробактерий циркулирующих на фермах крупного рогатого скота в Краснодарском крае. Доминирование среди значительного количества видов энтеробактерий, изолированных от телят при острых кишечных заболеваниях, именно E. той, E. cloacae, K. pneumoniae и C. freundii, по всей видимости, связано с их повышенной агрессивностью к эпителиальным клеткам хозяина и способностью противостоять его защитным механизмам. Наибольшее количество штаммов, обладающих различными патогенными свойствами, выявлено у эшерихий, что даёт основание считать их основной этиологической структурой в развитии кишечной инфекции у новорожденных телят. В тоже время распространенность среди энтеробактеров, клебсиелл и цитробактеров токсинообразующих вариантов даёт основание относить эти микроорганизмы к разряду этиологически значимых, и факт их присутствия в патологическом материале следует учитывать при разработке мероприятий при острых кишечных заболеваниях.

Список литературы:

1. Бондаренко В.М. Проблема патогенности клебсиелл /В.М.Бондаренко, B. Г.Петровская, Н.И.Потатуркина-Нестерова. Ульяновск: УлГУ, 1996. 131с.
2. Брилис В.И. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов / В.И. Брилис, Т.А. Брилинс, Х.П. Ленцнер, А.А. Ленцнер//Лаб. дело, 1986. №4. С.210-212.
3. Бухарин А.В., Усвяцов Б.Я., Манышкин А.П., Немцова Н.В. Метод определения антили-зоцимной активности микроорганизмов//Журн. Микробиол. 1984. №2. С.27-28.
4. Вартанян Ю.П. Отек лап белых мышей-тест для оценки активности энте-ротоксиновБ. coli / Ю.П. Вартанян // Бюлл. экспер. биологии и медицины, 1978. №2. С. 150-152.
5. Егорова С.А. Этиологическая значимость условно патогенных энтеробактерий при острых кишечных заболеваниях и дисбиотических состояниях /C. А.Егорова, М.А.Макарова, Л.А.Кафтырева//Инфекция и иммунитет, 2011. Т.1. №2. С.181-184.
6. Зароза В.Г Лабораторные методы выявления антигенов адгезии у E.coli - возбудителей колибактериоза новорожденных животных /В.Г.Зароза// Сельскохозяйственная наука и производство: Серия 2. Экономика, кормопроизводство, животноводство. М.,1987. №5. С.38-49.
7. Жеребцова Н.Ю. Генетические маркеры патогенности условно патогенных энтеробактерий, выделенных у детей и подростков при острых кишечных инфекциях /Н.Ю.Жеребцова, А.Х.Баймиев, Д.И.Валишин, А.Р Мавзютов//Журн микробиол.эпидемиол. и иммунобиол., 2007. №2. С.3-8.
8. Коткова Н.В. Экспериментальная колиэнтеротоксемия, обусловленная шигаподобным токсином Escherichiacoli /Н.В.Коткова. Дисс.канд.наук. Краснодар, 2007. С.59-61.
9. Моисеева Н.В. Роль бактерий рода Enterobacterspp. в этиологии острых кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных / Н.В.Моисеева, Э.А.Якимова // Биотика, 2015. №6(7). С.13-28.
10. Савилов Е.Д. Фенотипические маркеры патогенности у представителей семейства Enterobacteriaceae, выделенных от детей при острых кишечных инфекциях /Е.В.Савилов, Е.В.Анганова, А.В.Духанина, Н.Н.Чемезова//Сибирс-кий медицинский журнал, 2012. №6. С.93-95.
11. Тамбиев Т.С. Характеристика эпизоотического процесса при смешанных желудочно-кишечных инфекциях бактериальной этиологии в Ростовской области /Т.С.Тамбиев, А.Н.Татазян, В.П.Бывайлов, В.В.Кошляк// Ветеринарная патология, 2015. №3. С.5-10.
12. Терехов В.И. Проблемы острых кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных и пути их решения /В.И.Терехов //Матер.межд. научно-практич. конф. «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях». Воронеж: Воронежский государственный университет, 2002.С.48-51.
13. Cho Yongil, Yoon Kyoung-Jin An overview of calf diarrhea — infectious etiology, diagnosis, and intervention / Journal Veterinary Science, 2014. Vol.15(1). P.1-17: http://dx.doi.org/10.4142/jvs.2014.15.1.1
14. Lorenz I., Fagan J. and More S. J. Calf health from birth to weaning. II. Management of diarrhea in preweaned calves / Irish Veterinary Journal, 2011. Vol.64:9: http://www.irishvetjournal.org/content/64/1/9.
15. McWilliams B. D. and Torres A. G. EHEC Adhesins//Microbiol. Spectr. 2014; 2(2): EHEC-0003-2013-. Doi:10.1128/microbiolspec.EHEC-0003-2013.
16. Windeyer M.C., Leslie K.E., Godden S.M., Hodgins D.C. et al. Factors associated with mor-bidity, mortality, and growth of dairy heifer calves up to 3 months of age / Preventive Veterinary Medicine, 2014. Vol. 113, Issue 2. P.231240: http://dx.doi.org/10.1016/j.prevetmed.2013.10.019.

Резюме. Острые кишечные заболевания телят широко распространены на фермах различных стран мира. Часто в развитии диарей принимают участие ассоциации таких энтеробактерий, как эшерихий, энтеробактеров, клебсиелл и цитробактеров. При этом инфекционный процесс приобретает характер смешанной кишечной инфекции, для которой характерно быстрое распространение, высокая заболеваемость, тяжёлое течение и сложность лечения. Однако, если в отношении эшерихий этиологическое значение в развитии диарей не вызывает сомнений, то в отношении других энтеробактерий мнения не однозначные. В связи с этим целью исследований было выявление у эпизоотических штаммов Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae и Citrobacter freundii, выделенных от телят при острых кишечных заболеваниях на фермах Краснодарского края, некоторых факторов патогенности, способствующих развитию диареи. Было установлено, что среди Escherichia coli 83,1% штаммов обладали адгезивными свойствами, при этом у 31,5% адгезиныпред-ставлены общими пилями, количество гемолитических штаммов составило 42,7%, а экзотоксинпродуцирующих - 43,8%. Среди Enterobactercloacae количество штаммов, обладающих подобными свойствами, было - 65,5, 25,5, 23,6 и 41,8%; Klebsiellapneumoniae - 78,3, 13,0, 34,8 и 30,4%; Citrobacter freundii - 66,7, 23,3, 16,7 и 13,3%. Распространенность среди энтеробактеров, клеб-сиелл и цитробактеров вариантов, обладающих патогенными свойствами, даёт основание относить эти микроорганизмы к разряду этиологически значимых и факт их присутствия в патологическом материале следует учитывать при разработке мероприятий при острых кишечных заболеваниях.

Ключевые слова: телята, острые кишечные заболевания, диарея, энтеробактерии, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae, Citrobacter freundii, штамм, патогенность.

Сведения об авторах:

Малышева Татьяна Вячеславовна, кандидат медицинских наук, доцент кафедры микробиологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; 350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4; тел.: 8-918-2422225; e-mail: mvn-46@mail.ru.

Тищенко Александр Сергеевич, кандидат ветеринарных наук, старший преподаватель кафедры микробиологии, эпизоотологии и вирусологии ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Труби-лина»; 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13; тел.:8-928-4692399; e-mail: mephisto83@inbox.ru.

Мусатова Надежда Сергеевна, студентка факультета ветеринарной медицины, ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина»; 350011,г. Краснодар, ул. 1-й Восточный проезд, 10; тел.: 8-9649045989; e-mail: starname7@gmail.com.

Ответственный за переписку с редакцией: Терехов Владимир Иванович, доктор биологических наук, профессор, ГБПОУ КК «Пашковский сельскохозяйственный колледж»; 350910, г. Краснодар, пос. Пашковский, ул. Е. Бершанской, 220; тел.:8-988-4742115; e-mail: vterekhov@list.ru.