Морфологические характеристики клеток цервикального канала у коров для диагностики нормальных и патологических состояний

УДК 576.08
DOI 10.33861/2071-8020-2026-2-10-13

Обзор предметного поля

Метлева А. С.  Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования
«Кузбасский государственный аграрный университет имени В. Н. Полецкова», Кемеровская область,
г. Кемерово

Аннотация. Произведен анализ источников литературы для определения морфологических критериев клеток в цитологических мазках для дифференциальной диагностики стадий полового цикла и эндометритов. Работа проведена с целью интеграции отдельных разрозненных результатов исследования в структурированный материал для дальнейшей работы по диагностике овуляции и эндометритов. Установлено, что половые гормоны имеют прямое влияние на изменение количественно-качественного соотношения эпителиальных клеток в цервикальном канале. Наиболее разнообразная цитологическая картина наблюдается во время фолликулярной фазы, когда концентрация эстрадиола высока, а концентрация прогестерона низкая. Во время овуляции у коров в мазке из цервикального канала низкий процент молодых эпителиальных клеток (базальных клеток), в то время как процент отслаивающихся клеток эпителия матки является самым высоким, особенно промежуточных клеток. В фазе течки поверхностная эпителиальная клетка является наиболее доминирующей по сравнению с метэструсом, диэструсом или даже фазой проэструса. При диагностике эндометритов предложены пороговые проценты полиморфноядерных нейтрофилов: более 8% для коров в периоде 28 и 41 дня после родов, более 10% для коров от 34 до 47 дней после родов, и более 18% для коров с 20 по 33 дней после родов. Удельный вес полиморфноядерных нейтрофилов более 18% через 20-33 дня после родов является плохим прогностическим признаком для последующей репродуктивной активности, с меньшей вероятностью беременности. В результате данные, приведенные разными исследователями объединены в одну таблицу для понимания изменения цитологической картины при нормальных и патологических состояниях репродуктивного тракта у коров.

Ключевые слова: коровы, половой цикл, цитология, охота, фолликулярная фаза, лютеиновая фаза, эндометрит, диагностика.

Рентабельность в отрасли животноводства тесно связана с хорошей воспроизводительной способностью. Проблемы воспроизводства у коров обычно носят многофакторный характер, в отношении вызывающих их причин [1]. Идентификация различных фаз цикла течки у коров создает множество проблем для ветеринаров, занимающихся вопросами воспроизводства. Трудность заключается не в распознавании нормальных циклов и симптомов течки, а во все более распространенных проблемных циклах, при которых признаки очень нечеткие, нетипичные или даже отсутствуют. В наиболее сложных случаях речь идет о коровах, которых безуспешно осеменяли или спаривали несколько раз, после чего ветеринарные врачи пытаются найти причину бесплодия. Большинство из этих причин – простые ошибки, такие как неправильная идентификация течки, оплодотворение в неподходящее время или неспособность провести дополнительные базовые тесты для определения состояния эндометрия.

С момента развития вспомогательных репродуктивных технологий, в том числе и в сфере животноводства, качество ооцита/ эмбриона всегда оставалось в центре внимания врачей-репро-дуктологов при прогнозировании исхода эмбриотрансфера. При этом репродуктологи долгое время пренебрегали фактором влияния качества эндометрия на приживляемость эмбриона, так как материнский эндометрий считался пассивной стороной процесса внедрения бластоцисты [2]. В то же время здоровый эндометрий является фундаментальным условием фертильности коровы и способности забеременеть, а при нарушениях фертильности в молочном стаде в первую очередь следует учитывать состояние эндометрия [3]. Исследования доказывают, что неудачные попытки имплантации эндометриального происхождения зачастую не является патологией или дисфункция эндометрия, а скорее неспособность синхронизировать развивающийся эмбрион с циклом подготовки эндометрия (стадии «окна имплантации»). С внедрением вспомогательных репродуктивных технологий (далее, ВРТ) доминирующее положение в процессе имплантации занимает маточный фактор, а смещение окна имплантации имеет фатальные последствия для реализации программы ВРТ. Нарушения полноценной имплантации эмбриона, в связи с нерецептивным эндометрием, является наиболее значимой причиной репродуктивных неудач ВРТ, занимая в их структуре до 70% [4].

Рецептивность – это свойство эндометрия, регулируемое экспрессией набора транскриптомных генов, состоящих из 238 генов, оказывающих влияние на качественное состояние эндометрия [5]. В настоящее время разработан микрочип с данным набором генов для исследования уровня экспрессии. Указанные гены отвечают за работу эндокринной и иммунной систем, регулирующих процесс имплантации. Рецептивность эндометрия возможна только при определенном уровне половых стероидных гормонов в организме и необходимом количестве функционально полноценных рецепторов в ткани эндометрия к соответствующим стероидным гормонам: эстрадиол, связываясь с рецептором ?, запускает экспрессию набора генов в предимплантационном эндометрии, управляющими процессом имплантации через метаболизм клеток, секрецию желез эндометрия, дифференцировку клеток, межклеточное взаимодействие, врожденный иммунный ответ, механизмы репарации, адгезии и протеолиза. Процессы, происходящие в эндометрии, регулируются цитокинами и факторами роста – полипептидами и белками, синтезируемыми клетками, способными связываться со специфическими рецепторами клеток и являющимися потенциальными внутриклеточными сигналами, регулирующими функции клеток эндометрия, усиливая рецептивность эндометрия за счет регуляции экспрессии генов проадгезивных и контрадгезивных протеинов [6]. Под воздействием этого многокомпонентного процесса, происходящего в эндометрии у коров во время эстрального цикла, происходит множество физиологических и структурных изменений, в зависимости от преобладающего гормонального профиля. Матка и яичники являются взаимозависимыми органами. Циклически возникающие изменения в яичниках оказывают непосредственное влияние на матку, особенно на эндометрий. Следовательно, цитологическая картина эндометрия должна меняться в зависимости от строения яичников. Этот факт имеет большое значение в ветеринарной практике для подтверждения физиологического состояния эндометрия, а также для распознавания фаз яичникового цикла.

В настоящее время существует крайне мало научных работ, посвящённых изучению цитологических изменений в матке коров во время фолликулярной и лютеиновой фаз овариального цикла и определению различия в клеточной структуре в оба периода, а также их оценки для мониторинга состояния эндометрия без признаков воспаления и с наличием таких признаков. Согласно литературным данным, цитологическое исследование проводится у коров в основном для того, чтобы исключить или подтвердить субклинический эндометрит, а также при мониторинге послеродового периода у коров. Этот метод диагностики оправдывает себя, так как позволяет как можно раньше выявлять и лечить коров с эндометритом [3]. Ранняя и точная диагностика субклинического эндометрита позволяет выявить коров с нарушенной фертильностью и/или с эндометритом для лечения и избежать их осеменения, либо отбора их в качестве реципиента при проведении процедуры эмбриотрансфера.

Цитология эндометрия является общепринятой методикой для оценки состояния здоровья матки, поскольку она является быстрой, специфичной и недорогой, в сравнении с другими методами диагностики (вагинальное обследование, ультразвуковое исследование и биопсия матки), используется для оценки состояния здоровья матки и назначения терапии в случаях обнаружения патологических состояний. Сравнивая цитологический метод исследования с другими общепринятыми методиками можно резюмировать, что у крупного рогатого скота время наблюдения за течкой для определения оптимального времени искусственного осеменения или подсадки эмбрионов ограничено, особенно в случае теплового стресса, в то время как исследование на стероидах относительно неэкономично и имеет более длительное время исполнения. Вагинальная цитология является простой методикой, которая может быть использована практикующими врачами для определения стадии полового цикла, что может быть использовано в качестве предиктора овуляции [7].

Учитывая диагностическую значимость цитологического метода для установления фазы полового цикла у коров и крайне малое количество доступной методической литературы, непосредственно связанной с вопросом диагностики воспалений и фаз полового цикла у коров по цитологическим мазкам, нами была поставлена цель изучить морфологические клеточные показатели, характерные для определенной стадии полового цикла у коров, а также для диагностики эндометритов, на основе имеющихся литературных данных различных исследователей. При этом имеет значение решение задач по определению особенностей количественного и качественного состава клеток в мазках при эндометритах, а также при различных стадиях полового цикла у коров.

Материалы и методы исследований. Был произведен обзор литературных источников, содержащий в себе графический материал и описание морфологии клеток на каждой стадии полового цикла, а также и при воспалении репродуктивного органов. Для визуализации и обобщения собранных данных разработан табличный и графический материал.

Результаты исследований и их обсуждение. При цитологическом исследовании необходимо обращать внимание на наличие микроорганизмов в препаратах. Физиологически до родов просвет матки стерилен. Большой спектр бактерий обнаруживается в матке коров вскоре после родов. Количество инфекционных агентов в норме со временем снижается. Бактерии, контаминирующие матку, неспецифичны и относятся к большому количеству видов бактерий. Ряд бактерий, а именно Streptococcus spp., Staphylococcus spp. и Bacillus spp. были выделены из матки коров без признаков послеродового метрита, в то время как в матке коров с эндометритом были обнаружены Trueperella pyogenes, Escherichia coli, Fusobacterium necrophorum, Prevotella melaninogenicus, Bacteroides spp. и Clostridium, spp. Обнаружение E. coli, A. pyogenes, F. necrophorum и Prevotella spp. в просвете матки через 7 дней после родов считается нормой. Но, наличие этих микроорганизмов через 14, 21 и 28 дней после родов влияет на рост первого и второго доминантного фолликула, а также на концентрацию эстрадиола, способствует формированию желтого тела меньшего размера после первой послеродовой овуляции, что в свою очередь влияет на снижение концентрации прогестерона [1].

Патологические изменения репродуктивного тракта коров (эндометрит и метрит) влияют на увеличение интервалов между отелами и появления бесплодия. В этом случае цитология является эффективным методом оценки инфицирования матки у коров. При инфицировании матки цитологические мазки могут сопровождаться увеличением количества нейтрофилов, лимфоцитов и макрофагов. Нейтрофилы являются основной линией защиты от инфекционных агентов, в следствии чего происходит накопление этих клеток в эндометрии. При диагностике субклинического эндометрита цитологическим методом установлены пороговые значения полиморфноядерных нейтрофилов (ПМН), равные 8%, 6% и 4% для послеродовых периодов, равных 21-33, 34-47 и 48-62 дням, соответственно [1, 8].

Другие авторы также подтверждают значимость цитологического метода исследования при диагностике субклинического эндометрита на основе доли ПМН в образцах мазка с цервикального канала. Для диагностики эндометрита предложены пороговые проценты ПМН: более 8% ПМН для коров в периоде 28 и 41 дня после родов, более 10% ПМН для коров от 34 до 47 дней после родов, и более 18% для коров с 20 по 33 дней после родов. Уровень ПМН более 18% в мазках эндометриального материала через 20-33 дня после родов является плохим прогностическим признаком для последующей репродуктивной активности, с меньшей вероятностью беременности. У здоровых коров процентное содержание ПМН существенно не изменяется в течение эстрального цикла [9].

Существуют отчетливые различия между цитологическими мазками от коров, взятых в фолликулярную и лютеиновую фазы, выраженные в процентном содержании различных типов клеток. Эти изменения связаны с гормональной активностью17-?-эстра-диола и прогестерона, высвобождаемых из гипоталамо-гипофи-зарно-гонадной оси и соответствуют изменению структур яичника во время овариального цикла. Эстральный цикл у крупного рогатого скота колеблется от 18 до 24 дней, состоящий из длинной лютеиновой фазы (14-18 дней), характеризующейся наличием желтого тела, и более короткой фолликулярной фазы (4-6 дней), вплоть до овуляции.

Уровень прогестерона в лютеиновую фазу в 8 раз выше, чем в фолликулярную фазу цикла. Уровень 17-?-эстрадиола в сыворотке крови более чем в 5 раз выше в фолликулярную фазу, чем в лютеиновую фазу. Лютеинизирующий гормон действует на фолликул, вызывая овуляцию, тем самым завершая фолликулярную фазу. Участок овулированного фолликула развивается в желтое тело на яичнике, наличие которой определяет длину лютеиновой фазы. После того, как желтое тело регрессирует, начинается фолликулярная фаза и фолликул полностью созревает в готовности к овуляции, после чего цикл повторяется [10].

Гормоны косвенно воздействуют на кровоснабжение матки, влияют на пролиферацию, отшелушивание или регенерацию эпителия эндометрия. Эстрогены улучшают кровоснабжение матки и, как гормоны, стимулирующие деление клеток, способствуют пролиферации клеток эндометрия. Это приводит к отшелушиванию и некрозу существующих эпителиальных клеток и появлению молодых клеток в просвете матки. Наиболее разнообразная цитологическая картина наблюдается во время фолликулярной фазы, когда концентрация эстрадиола высока, а концентрация прогестерона низкая. У коров во время течки высокая концентрация эстрогена действует всего несколько дней, но изменения, происходящие в эндометрии во время фолликулярной фазы, отчетливо видны. По мере того, как желтое тело постепенно развивается после овуляции, вырабатывая все большее количество прогестерона, процессы пролиферации в эндометрии постепенно подходят к концу. Прогестерон, в отличие от эстрогенов, уменьшает кровоснабжение матки, что существенно снижает пролиферацию эпителия эндометрия [3].

Лютеиновая фаза, продолжительность которой составляет от 14 до 18 суток, начинается после овуляции и характеризуется образованием жёлтого тела. Данный процесс приводит к регрессии эструса у коров. Пик концентрации прогестерона достигается через шесть дней после овуляции. Лизис жёлтого тела происходит в период между 13 и 16 днями постовуляторного интервала. В этот период процент клеток II типа (промежуточные клетки) (рисунок 1) значимо выше в лютеиновой фазе, чем в фолликулярной фазе [11, 12].

 

Рис. 1. Промежуточные клетки [3]

Лютеиновая фаза в свою очередь делится на метэструс и ди-эструс.

Метэструс длится от 4-х до 5-ти дней. В этот период формируется жёлтое тело. Количество поверхностных клеток снижается, их вытесняют промежуточные. На фоне снижения уровня эстрогенов и начала секреции прогестерона в мазках становится выраженной популяция лейкоцитов – это так называемый «физиологический лейкоцитоз», который связан с процессами очищения матки и инволюции эпителия. В некоторых случаях он может составлять 40-50% и более. Также могут присутствовать эритроциты, образующиеся при овуляции, и большое количество слизи, которая придает пятнам мутный фон [13].

Диэструс – п оследняя фаза цикла, которая длится от 12-ти до 14-ти дней. Она характеризуется стабилизацией клеточного состава. На цитограмме видно преобладание промежуточных клеток. Они имеют округлую форму, везикулярное ядро среднего размера и умеренное количество цитоплазмы. Поверхностные клетки отсутствуют или появляются единично. Уровень ороговевания очень низкий, процент ороговевающих клеток обычно составляет менее 10-20%. Воспалительные клетки, такие как нейтрофильные лейкоциты, обычно немногочисленны или отсутствуют. В этот период фон мазка чистый, с минимальным количеством слизи или клеточного детрита, что соответствует гормональному спокойствию эндометрия. Всё это указывает на завершение гормональной перестройки и подготовку организма к возможному оплодотворению или новому эстральному циклу [13, 14].

Фолликулярная фаза длится от 4-х до 6-ти дней. Это период от лютеолиза до овуляции. Во время фолликулярной фазы происходит окончательное созревание фолликула, в результате которой ооцита (женская гамета) выходит в маточную трубу. Также для этой фазы характерен рост фолликула и выработка эстрогена, что приводит к наступлению эструса (течки). Процесс созревания начинается в нескольких фолликулах, но обычно только один из них становится доминирующим и овулирует. Рост фолликулов обычно происходит в одну или две основные волны в течение эстрального цикла, пока не произойдет овуляция или регрессия [11, 12]. В фолликулярной фазе преобладает количество клеток I типа (па-рабазальные клетки) или клетки с атрофической цитоплазмой и круглыми или овальными ядрами, сильно вакуолизированными и с признаками атрофии – поверхностные клетки (рисунок 2).

 

Рис. 2. Парабазальные клетки и базальные клетки [3]

В фолликулярную фазу количество клеток III типа (базальные клетки) с отчетливой цитоплазмой и большими или маленькими круглыми ядрами (рисунок 2, 3) значимо выше, чем в лютеиновую фазу. В фолликулярной фазе может присутствовать больше лейкоцитов, чем в лютеиновой фазе, так же как процент ПМН во время фолликулярной фазы заметно выше, чем в лютеиновой фазе.

 

Рис. 3. Базальные клетки, полиморфноядерные нейтрофилы (PMN), лимфоциты (L) [3]

Фолликулярная фаза подразделяется на проэструс и эструс.

Проэструс длится от 2-х до 3-х дней и является начальной фазой цикла. Именно в этот период начинается первая подготовка репродуктивной системы. Происходит резкий гормональный сдвиг в сторону преобладания эстрогенов, что отражается на цитологической картине. В мазках начинает появляться большое количество ороговевших клеток. Они становятся более плоскими, теряют ядра или приобретают морщинистые (пикнотичные) или сморщенные ядра, что свидетельствует об усилении эстрогенного эффекта, а промежуточные клетки практически исчезают. Лейкоциты становятся крайне редкими. Количество слизи в мазке может несколько увеличиваться, а фон становится умеренно зернистым [12, 13, 14].

Эструс (охота) – это пик половой активности самки. Это самая короткая фаза цикла и в основном длится от 17-ти до 20-ти часов. Она характеризуется максимальным изменением клеточной структуры. Из-за овуляции и пика уровня эстрогена, мазок представляет собой почти однородное скопление плоских или пикнотичных поверхностных клеток. Эпителиальные клетки влагалища крупного рогатого скота во время течки состоят из парабазальных, промежуточных и поверхностных клеток. Они располагаются слоями, напоминающими «чешуйки». Присутствие других типов клеток минимально. Лейкоциты отсутствуют или единичны, а фон мазка может быть «грязным» из-за наличия большого количества слизи, слущенного эпителия и небольшого количества микрофлоры. Визуально большинство мазков богаты эпителиальными элементами, что характерно для периода и благоприятного для осеменения [11, 14]. Таким образом, у коров во время течки видимым результатом цитологического исследования является низкий процент молодых эпителиальных клеток (III типа), в то время как процент отслаивающихся клеток эпителия матки является самым высоким, особенно клеток II типа, характерных для этого периода. В фазе течки поверхностная эпителиальная клетка является наиболее доминирующей по сравнению с метэструсом, диэструсом или даже фазой проэструса [7] (рисунок 4).

 

Рис. 4 Цитологическая картина мазка из цервикального канала, в зависимости от стадий полового цикла

Сводные данные по приведенному обзору представлены в таблице 1.

Таблица 1 Тип клеток, преобладающий в мазках из цервикального канала, при нормальных и патологических состояниях (окраска по Папаниколау)

 

Заключение. Результаты исследования представляют собой данные, облегчающие идентификацию фаз овариального цикла, что позволит избежать ошибок при процессе воспроизводства в животноводстве. В клинической практике, когда речь идет о воспроизводстве крупного рогатого скота, подтверждение нормального и/или патологического состояний матки является основой для диагностики причин бесплодия, что сокращает временные и экономические потери, связанные с ненужным лечением при подозрении на эндометрит. Результаты исследования показывают, что фазы овариального цикла у коров можно идентифицировать на основе изменений качества и процентного содержания различных типов эндометриальных клеток при цитологическом исследовании. При диагностике эндометритов у коров всегда следует проводить цитологическое исследование в качестве дополнительного метода к ультразвуковому исследованию, которое не дает адекватного изображения эндометрия. Ультразвуковое исследование выявляет наличие структуры на оболочке яичника, соответствующей данной фазе овариального цикла, в то время как цитология используется для определения того, имеются ли изменения эндометрия, характерные для этого периода. Также можно подтвердить отсутствие воспаления в матке.

Список литературы:

1. Casarin J. B. S. et al. Bacteriological, cytological and histopathological evaluation of the reproductive tract of slaughtered cows. Pesquisa Veterinaria Brasileira. 2018; (38 (01): 53-58.

2. Ruiz-Alonso M. et al. Endometrial Receptivity Analysis (ERA): data versus opinions. Hum Reprod Open. 2021; (14 (2).

3. Brodzki P. et al. Endometrial cytology at luteal and follicular phases of the ovarian cycle in cows. Annals of Animal Science. 2015; (15 (1): 107.

4. Подзолкова Н. М., Шамугия Н. Л., Варлакова П. М. Роль фактора эндометрия в повторных неудачах имплантации (обзор литературы). Медицинский алфавит. 2023; (3): 30-36.

5. Бурменская О. В., Боженко В. К., Смольникова В. Ю. [и др.] Поиск маркеров персонального «окна имплантации» у женщин в программе экстракорпорального оплодотворения с помощью определения транскрипционного профиля генов. Акушерство и гинекология. 2017; (5): 72-80.

6. Мелкозерова О. А., Башмакова Н. В., Есарева А. В. Проблемы коммуникации эмбриона и эндометрия: маркеры нарушений и механизмы влияния. Российский вестник акушера-гинеколога. 2016; (16 (5): 29-36.

7. Siregar T. N. et al. Determining proportion of exfoliative vaginal cell during various stages of estrus cycle using vaginal cytology techniques in aceh cattle. Veterinary Medicine International. 2016; (1): 3976125.

8. Madoz L. V. et al. The relationship between endometrial cytology during estrous cycle and cutoff points for the diagnosis of subclinical endometritis in grazing dairy cows. Journal of dairy science. 2013; (96 (7): 4333-4339.

9. McDougall S. et al. Relationships between cytology, bacteriology and vaginal discharge scores and reproductive performance in dairy cattle. Theriogenology. 011. Т. 76. №. 2. С. 229-240.

10. Tinning H. et al. Endometrial function in pregnancy establishment in cattle. 2023; (17): 100751.

11. Mark A. Crowe. Reproduction, Events and Management: Estrous Cycles: Characteristics. Reference Module in Food Science. Elsevier. 2016.

12. Terry L. et al. Reproductive Physiology of the Nonpregnant Mare. Manual of Equine Reproduction (Second Edition). 2003; (2): 9-15.

13. Tim J. Evans. Reproductive toxicity and endocrine disruption. Veterinary Toxicology (Second Edition). Academic Press. 2012; (19): 278-318.

14. Susan E. Aiello, Michael A. Moses. Merck veterinary manual. Summary circulatory system. 2016: 208-226.

15. Полонская Н. Ю., Юрасова И. В. Цитологическое исследование цервикальных мазков. Пап-тест. 2018: 168 с.

Сведения об авторе: Метлева Анастасия Сергеевна, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры ветеринарной медицины и биотехнологий ФГБОУ вО «Кузбасский государственный аграрный университет имени В.Н. Полецкова»; 650056, г. Кемерово, ул. Марковцева, 5; тел.: 8-951-5924957; e-mail: zveryski@mail.ru – ответственный за переписку с редакцией.