УДК 619:618.19-002: 579.8
DOI 10.33861/2071-8020-2023-6-10-12
Исакова М. Н., Ряпосова М. В. Федеральное государственное бюджетное научное учреждение
«Уральский федеральный аграрный научно-исследовательский центр» Уральского отделения
Российской академии наук, г. Екатеринбург
Микробиота сырого молока коров является важным фактором с точки зрения порчи и безопасности пище-вых продуктов [3, 6, 7, 8, 12]. Исследования микробиома молока показали, что он подвержен влиянию различных факторов, существенно изменяющих его состав [1, 9, 10, 12, 13]. Так, на состав микробиоты молока могут оказывать влияние микробные экосистемы, включающие состояние соскового канала, поверхности кожи соска животного и контакт с доильными аппаратами или другим молочным оборудованием, а также различные элементы окружающей среды, такие как подстилка, фекалии, корм, питьевая вода, воздух [2, 8, 11, 12]. Долгое время считалось, что молоко без бактериального роста в культуре стерильно [4, 7, 12]. Однако разработанные методы секвенирования ДНК привели к концепции интрамаммарной микробиоты, состоящей из сложного сообщества разнообразных бактерий.
Микробиота секрета молочной железы высокопродуктивных коров имеет различия в зависимости от региона и периода исследований, поэтому проведение микробиологического мониторинга в конкретных территориальных условиях является актуальным и позволяет подобрать рациональную терапию в борьбе с маститом [5, 9, 1, 6, 13].
В связи с вышеизложенным, цель данной работы заключалась в определении состава микробиоты секрета молочной железы высокопродуктивных коров при мастите.
Материалы и методы исследований. Работа проведена в период 2020-2021 годы в отделе репродуктивных технологий ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН в рамках Государственного задания Минобрнауки России по направлению 160 Программы ФНИ государственных академий наук по теме 0532-2021-0009 «Разработка биологических технологий управления здоровьем животных и прижизненного формирования качества продукции животноводства и птицеводства». Микробиологические исследования проведены на базе лаборатории медицинского центра ООО «Кволити Мед».
Исследования проведены в трех племенных хозяйствах Свердловской области, где были отобраны пробы секрета молочной железы коров для дальнейшего микробиологического исследования. Всего было отобрано 68 проб секрета молочной железы коров (28 проб от животных с клиническим маститом, 40 проб от животных с субклиническим маститом).
При проведении бактериологического и микологического исследования из проб секрета молочной железы коров делали посевы, для этого брали 10 мкл секрета с помощью стерильной калиброванной петли и высевали на питательные среды методом истощающего посева, использовали питательные среды: 5% агар c кровью барана (основа Колумбийский агар, Bio-Rad, пр-во Франция); кровь барана дефибринированная (E&O Laboratories, пр-во Шотландия), желточно-солевой агар (питательный агар для культивирования микроорганизмов ГРМ-агар, ФБУН ГНЦ ПМБ, пр-во Россия), хромогенный агар (UriSelect 4, Bio-Rad, пр-во Франция) и агар Сабуро с 2% глюкозы и хлорамфениколом (SIFIN diagnostics, пр-во Германия). Затем засеянные чашки Петри помещали в термостат с аэробными условиями при температуре 37°± 1°С, затем инкубировали в атмосфере, содержащей 5% CO2. Посевы инкубировали до 72 часов, с оценкой роста через 24, 48, 72 часа. Идентификацию выросших колоний производили методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (время пролетная матрично-ассоциированная лазерная десорбционная ионизационная масс-спектрометрия) на приборе Vitek MS (BioMerieux, пр-во Франция). Для этого бактериальную массу наносили на спот слайда, покрывали 1 мкл матрицы (а-циано-3-гидроксикоричная кислота), высушивали при комнатной температуре, далее считывали прибором масс-спектры рибосомальных белков и сравнивали с базой данных с использованием программного обеспечения Myla. Статистическую обработку данных проводили с использованием платформы AMRcloud, а также пакетов анализа «Microsoft Ехсе1 2007», «Statistics 6.0».
Результаты исследований и их обсуждение. Согласно результатам проведенных исследований из 68 проб секрета молочной железы от больных маститом коров были изолированы 153 культуры микроорганизмов, относящиеся к 25 родам, из них: Acinetobacter (18,3%), Staphylococcus (9,8%), Pseudomonas (8,5%), Klebsiella (6,5%), Aerococcus (6,5%), Kocuria (5,9%), Stenotrophomonas (5,2%), Escherichia (3,9%), Streptococcus (3,9%), Candida (3,9%), Trueperella (3,9%), Microbacterium (3,3%), Rhizobium (2,6%), Chryseobacterium (2,0%), Sphingobacterium (2,0%), Corynebacterium (2,0%), Bacillus (2,0%), Exiguobacterium (2,0%), Citrobacter (2,0%), Enterobacter (2,0%), Serratia (1,3%), Aspergillus (0,7%), Xanthomonas (0,7%), Psychrobacter (0,7%), Empedobacter (0,7%).
Выделенные микроорганизмы относились к 57 видам, наиболее многочисленным видовым составом представлен род Acinetobacter, который включал восемь видов: A. pittii (8,5%), A. johnsonii (3,3%), A. ursingii (2,0%), A. iwoffii (2,0%), A. gyllenbergii (0,7%), A. junii (0,7%), A. seifertii (0,7%), A. baumannii (0,7%). Род Staphylococcus представлен семью видами микроорганизмов: S. haemolyticus (2,6 %), S. aureus (2,6%), S. chromogenes (2,0%), S. epidermidis (0,7%), S. hyicus (0,7%), S. cohnii ssp. urealyticus (0,7%), S. cohnii ssp. cohnii (0,7%). Из дрожжеподобных грибов рода Candida в равном количестве (0,7%) были выделены представители следующих шести видов: C. lusitaniae, C. kefir, C. krusei, C. rugose, C. catenulata, C. parapsilosis. Род Pseudomonas включал в себя пять видов микроорганизмов P. aeruginosa (2,6%), P. oryzihabitans (2,6%), P. putida (2,0%), P. alcaligenes (0,7%), P. fluorescens (0,7%).
По результатам микробиологических исследований установлено, что чаще всего, в 61,8 % случаев, маститы протекают как коинфекция, из них 26,5% случаев вызваны двумя возбудителями, в 11,8% и 13,2% высеивались три и четыре патогена. Сложный микробиом, состоящий из пяти и шести микроорганизмов выделялся в 4,4% и 5,9% проб, соответственно. При этом все выделенные из секрета молочной железы ассоциации микроорганизмов имели неповторяющиеся между собой видовые сочетания.
В 38,2% случаев, маститы регистрировали в виде моноинфекции, вызванной 18 видами микроорганизмов. Наиболее часто высеивался патогеный возбудитель мастита Trueperella pyogenes (19,2%). Из высококонтагиозных возбудителей воспалительных заболеваний молочной железы в 7,7% обнаружен Streptococcus uberis. В 11,5% и 7,7% проб выделены Aerococcus viridans и Acinetobacter johnsonii, соответственно, относящиеся к условным патогенам, способным вызывать оппортунистические инфекции. В 53,9% пробах секрета вымени микроорганизмы были обнаружены единожды, на их долю приходилось по 3,8%. При этом наиболее значимы в патофизиологии мастита у животных являются Staphylococcus hyicus, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus aureus, Streptococcus dysgalactiae так же вызывающие вспышки контагиозного мастита. Из возбудителей, способных вызывать неконтагиозный мастит, в исследуемых пробах выделены Citrobacter koseri, Citrobacter youngae, Candida lusitaniae, Candida kefir (рисунок 1).
Рис. 1. Бактериальный спектр возбудителей мастита при моноинфекции, %
Возбудители контагиозного мастита чаще всего способны вызывать субклиническую форму мастита, характеризующуюся резким увеличением количества соматических клеток в секрете молочной железы. При изучении микробиома, способного вызывать скрытое течение воспалительной реакции в молочной железе, из 40 проб секрета молочной железы выделено 67 изо-лятов, принадлежащих к 38 видам. Субклинический мастит у животных был вызван монокультурой и ассоциациями возбудителей в 25,0% и 15,0%, соответственно. Наиболее часто в 10,5% выделены патогены Trueperella pyogenes, Aerococcus viridans и Acinetobacter pittii обнаружены в одинаковом количестве (9,0%). Klebsiella pneumoniae как возбудитель скрытой формы мастита высеян в 6,0% проб. На долю Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus aureus, Streptococcus uberis, Acinetobacter iwoffii, Acinetobacter johnsonii пришлось по 4,5% случаев субклинического мастита. На долю остальных микроорганизмов, которые были выделены в пробах секрета вымени единожды, приходилось по 1,5%, хочется отметить, что животные в этом случае имели легкое и среднее поражение молочной железы субклиническим маститом (рисунок 2).
Рис. 2. Возбудители субклинической формы мастита у высокопродуктивных коров, %
Выделенные при исследовании микроорганизмы, относящиеся к возбудителям неконтагиозного мастита, вызывали у животных клиническую форму мастита, протекающую в легкой, средней и тяжелой форме, с изменением внешних свойств молока, покраснением, отечностью, болью и повышением температуры вымени, уменьшением надоя молока. При изучении микробиома, способного вызывать клиническую форму мастита, из 28 проб секрета молочной железы выделено 93 изолята, принадлежащих к 41 виду, при этом в 96,4% случаев мастит был вызван ассоциациями возбудителей, а монокультура в 3,6%, представленная Klebsiella pneumoniae. В структуре ассоциаций возбудителей обнаружены: в 8,6% Stenotrophomonas maltophilia, в 7,5% - Acinetobacter pittii, в 6,5% - Kocuria rhizophila, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae. На долю Aerococcus viridans, Microbacterium liquefaciens, Rhizobium radiobacter приходилось по 4,3%. Staphylococcus chromogenes, Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Chryseobacterium indologenes выделен в 3,3%. Sphingobacterium multivorum, Enterobacter cloacae, Pantoea agglomerans, Acinetobacter ursingii, Macrococcus caseolyticus, Exiguobacterium acetylicum, Acinetobacter johnsonii - 2,2%. Остальные микроорганизмы в структуре ассоциаций представлены в 1,1% и являются представителями следующих видов: Candida kefir, Candida krusei, Candida rugose, Candida catenulate, Candida parapsilosis, Enterobacter hormaechei, Bacillus licheniformis, Esherichia vulneris, Kocuria carniphila, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas fluorescens, Citrobacter koseri, Pseudomonas alcaligenes, Microbacterium paraoxydans, Acinetobacter baumannii, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus cohnii, Acinetobacter lwoffii, Corynebacterium amycolatum, Psychrobacter phenylpyruvicus, Staphylococcus haemolyticus.
Заключение. В результате исследований установлено, что воспалительные заболевания молочной железы у высокопродуктивных коров вызваны широким спектром возбудителей. В большинстве случаев субклинический мастит у животных был вызван патогенными микроорганизмами Trueperella pyogenes (10,5%), Aerococcus viridans (9,0%), Acinetobacter pittii (9,0%). Клиническую форму мастита в структуре ассоциаций возбудителей наиболее часто вызывали Stenotrophomonas maltophilia (8,6%), Acinetobacter pittii (7,5%), Kocuria rhizophila (6,5%), Escherichia coli (6,5%), Klebsiella pneumoniae (6,5%). Нами установлено, что все выделенные из секрета молочной железы ассоциации микроорганизмов имели неповторяющиеся между собой видовые сочетания, что является проблемой в выборе эффективного препарата в качестве лечения мастита, который мог бы воздействовать на большое количество возбудителей, относящихся к разным видам одновременно.
Список литературы:
1. Антибиотикорезистентность микробиоты молочной железы и репродуктивного тракта коров / О. В. Соколова, И. А. Шкуратова, Н. А. Безбородова [и др.] // Ветеринария. 2021. № 9. С. 10-15.
2. Воспроизводство стада - основа эффективного производства молока / И. А. Шкуратова, М. В. Ряпосова, Е. Н. Шилова [и др.] // 2020. 110 с.
3. Донник, И. М. Повышение качества молочных продуктов при использовании природных кормовых добавок / И. М. Донник, О. П. Неверова, О. В. Горелик // Труды Кубанского государственного аграрного университета. 2015. № 56. С. 176-179.
4. Изменение микробиома молока коров при заболевании маститом / К. К. Фурсова, С. Л. Соколов, М. П. Щанникова [и др.] // Науки о жизни. 2021. Т. 497. № 1. С. 169-174.
5. Конопельцев, И. Г. Заболеваемость коров маститом в условиях сельхозпредприятий Кировской области / Конопельцев И. Г. // Инновации и достижения в сельском хозяйстве. 2020. С. 30-36.
6. Ларионов, Г. А. Профилактика и лечение субклинического мастита коров / Г. А. Ларионов, Л. М. Вязова, И. В. Царевский // Новое Время. 2016. 132 с.
7. Микробиология молока и молочных продуктов / Г. М. Фирсов, С. А. Фоменко, Е. А. Резяпкина [и др.] // News of Science and Education. 2018. Т. 10. № 2. С. 103-105.
8. Соколова, О. В. Антибиотикочувствительность и резистентность микробиоты репродуктивных органов и молочной железы коров при воспалительном процессе / О. В. Соколова, Н. А. Безбородова // В кн.: Генетика, селекция и биотехнология животных: на пути к совершенству. Материалы научно-практической конференции с международным участием. 2020. С. 265-266.
9. Соколова, О. В. Сравнение микробиоты репродуктивного тракта и молочной железы коров по данным секвенирования гена 16S РРНК / О. В. Соколова, В. Д. Зубарева // В кн.: Материалы международной научной конференции «Наука, техника и инновационные технологии в период возрождения новой эпохи могущественного государств». Ашхабад, 2022. С. 280-282.
10. Lima S. F., Bicalho M. L., Bicalho R. C. Evaluation of milk sample fractions for characterization of milk microbiota from healthy and clinical mastitis cows // PLoS One. 2018. No. 3 (3).
11. Pascal R. Mammary microbiota of dairy ruminants: fact or fiction? // Vet Res. 2017. No. 48. Pp. 25.
12. Raw milk and fecal microbiota of commercial Alpine dairy cows varies with herd, fat content and diet / F. Albonico, C. Barelli, D. Albanese et al. // PLoS One. 2020. Vol. 6. No. 15 (8).
13. Understanding the Milk / Metzger S.A., Hernandez L.L., Suen G. et al. // Vet Clin. North. Am. Food. Anim. Pract. 2018. No. 34 (3). Pp. 427-438.
Резюме. В статье представлены данные о составе микробиоты секрета молочной железы высокопродуктивных коров при мастите. Исследования проведены в трех сельскохозяйственных организациях, расположенных на территории Свердловской области, всего было отобрано 68 проб секрета молочной железы коров с клинической (n=28) и субклинической (n=40) формой мастита. Микробиота секрета молочной железы высокопродуктивных коров при мастите была представлена 153 культурами микроорганизмов, относящимися к 25 родам, из них наиболее часто из проб были изолированы Acinetobacter (18,3%), Staphylococcus (9,8%), Pseudomonas (8,5%), Klebsiella (6,54%), Aerococcus (6,5%), Kocuria (5,9%), Stenotrophomonas (5,2%). Наиболее многочисленным видовым составом представлен род Acinetobacter: A.pittii (8,5%), A. johnsonii (3,3%), A. ursingii (2,0%), A. iwoffii (2,0%), A. gyllenbergii (0,7%), A. junii (0,7%), A. seifertii (0,7%), A. baumannii (0,7%). Род Staphylococcus представлен следующими видами микроорганизмов: S. haemolyticus (2,6%), S. aureus (2,6%), S. chromogenes (2,0%), S. epidermidis (0,7%), S. hyicus (0,7%), S. cohnii ssp. urealyticus (0,7%), S. cohnii ssp. cohnii (0,7%). Установлено, что в 61,8% случаев маститы протекают как коинфекция, из них 26,5% случаев вызваны двумя возбудителями, в 11,8% и 13,2% обнаружены три и четыре патогена, сложный микробиом, состоящий из пяти и шести микроорганизмов выделялся в 4,4% и 5,9% проб соответственно. В 38,2% случаев маститы регистрируют в виде моноинфекции, наиболее часто был обнаружен патогенный возбудитель мастита Trueperella pyogenes (19,2%).
Ключевые слова: высокопродуктивные коровы, молочная железа, микробиота, мастит, клиническая форма мастита, субклиническая форма мастита, контагиозные возбудители, неконтагиозные возбудители, моно-12 инфекция, ассоциации возбудителей.
Сведения об авторах:
Исакова Мария Николаевна, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник отдела репродуктивных технологий ФГБНУ Ур-ФАНИЦ УрО РАН; 620145, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-912-2126025; e-mail: tmarya105@yandex.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Ряпосова Марина Витальевна, доктор биологических наук, доцент, ведущий научный сотрудник отдела репродуктивных технологий ФГБНУ УрФАНИЦ УрО РАН; 620145, г. Екатеринбург, ул. Белинского, 112 а; тел.: 8-908-9073837; e-mail: riaposova76@mail.ru.
http://vetkuban.com/num6_202303.html