УДК 619:615.373:658.562
Сусский Е.В., Глушенкова Ю.А. ФКП «Армавирская биофабрика», Новокубанский район, п. Прогресс
Телишевская Л.Я. ФГБУ «ВГНКИ», г. Москва
Ласкавый В.Н. Саратовский научноисследовательский ветеринарный институт -
филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения
«Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии», г. Саратов
Ночевная Т.В. АО «НПО» «Микроген», г. Москва
Введение. Высокая патогенность бактерий рожи свиней для животных и опасность заражения человека определили значимость и актуальность проблемы серийного производства активных антигенов и оптимизации технологических процессов изготовления сыворотки крови против рожи свиней, отвечающей требованиям отечественных и международных стандартов [1, 5, 8].
При реализации этих задач целенаправленно проводится поиск эффективных средств и методов повышения активности бактериальных антигенов. В последние годы установлена высокая потребность бактерий рожи свиней в различных аминокислотах, микроэлементах, в ионах 2-валентного железа с пептидами и ряде других органических солей. Доказана пригодность и перспективность применения полученных антигенов для изготовления иммунобиологических препаратов [11, 12, 13].
В последние годы для повышения качества лечебных и иммунобиологических препаратов широко используют иммуностимулирующие средства различного происхождения, в частности, как для интенсификации процессов синтеза антител, так и повышения иммунного статуса животных-доноров сыворотки крови [2, 4, 6, 7].
Высокая потребность практики в сыворотке крови против рожи свиней определили значимость, а также актуальность проблемы повышения активности лечебного препарата, поскольку используемые в практике технологии производства не отвечают современным требованиям и требуют модернизации.
Цель работы - оценка влияния железосодержащего препарата «Пептофер» на эффективность периодического культивирования бактерий рожи свиней и усовершенствование схемы подготовки волов-продуцентов к эксплуатации с помощью иммуномодулирующего препарата «Иммунофарм» при серийном производстве противорожистой сыворотки.
Материалы и методы исследований. В работе использовали производственные штаммы бактерий рожи свиней - Erysipelathrix rhysiopathiae 1689А (серовара 1а), 1329А (серовара 1в), 1933В (серовара 2а) и контрольный штамм №149, депонированные в ФГУ ВГНКИ. Лиофилизированные штаммы главного (Master seed) и рабочего (Working seed) банков готовили и хранили в течение 2 лет при температуре 6±2°С и использовали в качестве посевного материала при изготовлении рабочих расплодок (Production seed).
Для выращивания бактерий использовали бульон Хоттингера, содержащий не менее 160 мг% аминного азота и максимальное количество пептидных фракций с Mm более 1 000 D.
Штаммы микроорганизмов культивировали раздельно в биореакторе «Торнадо» объемом 200 л при постоянном перемешивании 100150 мин-1, температуре 36±0,5°С, поверхностной аэрации воздухом, поддержании рО2 на уровне 30+50%, рН среды в пределах 7,2-7,6, оптимальных показателях окислительно-восстановительного потенциала (еН) и дробной подачи 40% раствора глюкозы. Реактор на 2/3 заполняли бульоном Хоттингера затем вносили посевной материал из расчета 5+10% к объему (250+300 млн/см3) и выращивали в течение 12-14 ч. Концентрацию микроорганизмов оценивали турбидиметрически на фотоэлектроколориметре КФК-1-ХЛ-42 или по стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, морфологию - микроскопией мазков, окрашенных по Грамму, а также чистоту и ферментативные свойства [3].
В качестве железосодержащего соединения использовали комплексный препарат «Пептофер» производства ООО «А-БИО», содержащий в своем составе 3% двухвалентного железа с пептидами. Автоклавированный препарат вносили в концентрации 1% и оценивали стимулирующий эффект на метаболизм и размножение бактерий рожи свиней в сравнении с контролем [7, 11, 12].
Для повышения эффективности процесса гипериммунизации во-лов-продуцентов при получении сыворотки крови против рожи свиней испытывали иммуномодулирующее средство «Иммунофарм», отвечающее требованиям ТУ 9336-231-004941-97. Препарат представляет собой раствор формальдегида - муравьиного альдегида (по ГОСТ 1625-89 марки ФбМ ОКЛ 24 1731-0200) в 0,02% концентрации в физрастворе по ФС 42-2595-99. Препарат относится к 4 классу опасности по ГОСТ 12.0007-76 и полностью выводится из организма животных. Ограничений по использованию продукции сельскохозяйственных живоных (мяса) после применения препарата не установлено. «Иммунофарм» изготавливается из сертификационных компонентов и рекомендуется в качестве лечебного и иммуномодулирующего средства без ограничений. Препарат не токсичен, не вызывает кумулятивного эффекта при длительном применении в дозе 2+5 см3 [4, 6].
Биохимические показатели оценивали общепринятыми методами [5, 11, 12]. Статистическую обработку показателей качества противорожистой сыворотки и накопления бактерий рожи свиней осуществляли с помощью программы «Статистика 6S» фирмы Stat Soft (USA).
Для изготовления гипериммунной сыворотки крови использовались волы-продуценты красной степной породы в возрасте не менее 3 лет и живой массой 450-500 кг. Заготовку, карантинирование животных. диагностические исследования на наличие инфекционных заболеваний (туберкулеза, бруцеллеза, лейкоза) и вакцинацию против лептоспироза, сибирской язвы, ящура и бруцеллеза, а также клиникогематологические исследования проводились в соответствии с требованиями ПР-00482849-012-09 в течение 30 суток.
Для волов-продуцентов использовали смесь антигенов из штаммов 1689, 1329 и 1933 Erysipelathrix insidiosa, выращенных в биореакторах с концентрацией не ниже 600 млн/см3. Аттестованный антиген применялся для гипериммунизации ВП в течение 10 суток при условии хранения препарата при температуре 6±2°С.
В процессе 10-кратной гипериммунизации возрастающие дозы антигена вводили подкожно в области шеи, при переходе на большие дозы - применяли внутримышечное введение в разные места шеи и верхней части туловища, но не ближе 10-15 см от заднего края лопатки. Первое взятие крови и контроль активности сыворотки крови проводили через 8-10 секунд после окончания цикла гипериммунизации. При низкой активности сыворотки крови доноров дополнительно двукратно иммунизировали в дозе 300 мл.
Активность сыворотки крови против рожи свиней контролировали на белых мышах массой 18-20 г. Животным подкожно вводили разведения сыворотки крови от 1:10 до 1:320 в объеме 0,5 см3 в дозах 0,05, 0,025, 0,0125, 0,00625, 0,00312 и 0,0015 см3 На каждую дозу препарата и контроль использовали по 6 белых мышей. Через 24 ч после введения препарата опытных и контрольных животных заражали вирулентным штаммом Erysipelathrix rhysiopathiae № 149 в дозе 100 ЛД50. Серию сывороток крови считали активной при содержании в см3 не менее 40 ЕА/мл и гибели всех контрольных животных в течение 3-5 суток [10].
Результаты исследований и их обсуждение. Предварительные испытания показали, что максимальное накопление бактерий рожи свиней стационарным и периодическим методами регистрируется в бульоне Хоттингера с аминным азотом не ниже 160 мг% и пептидной фракцией с Mm более 1 000 D. Установлено также стимулирующее влияние железосодержащего препарата «Пептофер» на стационарное размножение микрорганизма [9].
В производственных условиях были подтверждены установленные ранее факты и показано, что при оптимальных технологических параметрах и дополнительном внесении в состав бульона Хоттингера препарата «Пептофер» в объеме 1% было достаточно эффективным и обеспечивало достоверное (р < 0,05) увеличение уровня накопления штаммов бактерий рожи свиней периодическим способом от 9,06±0,54 до 9,65±0,40, в контроле - не более 8,56±0,12 млрд/см3 при сохранении микроорганизмами ростовых, морфологических и биохимических показателей (табл. 1). Напротив максимальное накопление штаммов 1329 и ВР-2 стационарным способом не превышало, соответственно, 2,85±0,15 и 2,96±0,24 млрд/см3, в контроле 1,25±0,15 и 0,8±0,04 млрд/см3 (табл. 2).
Таблица 1. Влияние железосодержащего препарата «Пептофер» на размножение бактерий рожи свиней периодическим способом
| Характеристика БХ | Концентрация препарата «Пептофер» | Концентрация БР (млрд/см3) | |||
|---|---|---|---|---|---|
| Аминный азот мг% | Содержание пептидов с Mm более 1000 D % от X | Наименование штаммов | |||
| 1329 | 1689 | 1933 | |||
| 160-195 | 5,5 | 1,0 | 9,45±0,30 | 9,65±0,40 | 9,06±0,54 |
| Контроль | 8,56±0,42 | 8,50±0,37 | 8,40±0,80 | ||
Таблица 2. Влияние железосодержащего препарата «Пептофер» на размножение бактерий рожи свиней стационарным способом
| Характеристика БХ | Концентрация препарата «Пептофер» | Концентрация БР (млрд/см3) | ||
|---|---|---|---|---|
| Аминный азот мг% | Содержание пептидов с Mm более 1000 D % от X | Наименование штаммов | ||
| 1329 | ВР-2 | |||
| 160-195 | 5,5 | 1,0 | 2,85±0,0,15 | 2,96±0,24 |
| Контроль | 1,25±0,15 | 0,80±0,04 | ||
Представленные данные свидетельствуют о высокой потребности штаммов бактерий рожи свиней в ионах двухвалентного железа и его возможного участия в интенсификации дыхательных процессов, в частности в составе дегидрогеназ, гемсодержащих ферментов или железосеропротеидов, цитохромов или ферредоксинов [7, 12]. Полученные результаты служат основанием рекомендовать железосодержащий препарат «Пептофер» в качестве достаточно эффективного средства для серийного производства бактериальных антигенов в биореакторах с сохранением морфологических, биохимических и антигенных свойств штаммов микроорганизмов с минимальными затратами труда, средств и времени, что экономически оправдано и достаточно перспективно, особенно в условиях серийного производства лечебных и иммунобиологических препаратов.
Вопрос о практическом применении препарата «Иммунофарм» для повышения гуморального и клеточного иммунитета и эффективной стимуляции синтеза специфических антител чрезвычайно актуален, особенно, при серийном производстве сыворотки крови против рожи свиней. При решении данной проблемы в предварительных опытах оценивали возможность и перспективность различных схем применения «Иммунофарма» в процессе гипериммунизации волов-продуцентов. В предварительных исследованиях на мышах было показано, что иммуномодулирующий потенциал препарата позволяет достаточно эффективно использовать его на практике однократно или трехкратно с интервалом 2-4 ч после введения антигена или 3-кратно перед каждым введением антигена [9]. Было показано, что однократное применение «Иммунофарма» сопровождается увеличением относительного содержания АОК в селезенке мыши с 296,4±8,4 до 444,3±23,8, абсолютного уровня антителопродуцентов с 31,3±3,4 до 52,4±4,3 и прироста ГА в СК на 33 %. При трехкратном воздействии иммуностимулирующего средства обеспечивается дополнительный прирост указанных показателей, соответственно, на 137,0, 126,2 и 85,2%. Введение препарата «Иммунофарм» перед использованием антигена было менее эффективным [4, 6].
С учетом полученных результатов в эксперименте оценивали пригодность и эффективность «Иммунофарма» для гипериммунизации волов-продуцентов. Препарат применяли подкожно в дозе 5 мл через 2+4 ч после 1, 2, 3, затем 6 и 9 инъекциями антигена. Результаты гипериммунизации опытной и контрольной группы животных-доноров представлены в таблице 3.
Таблица 3. Влияние иммуномодулирующего препарата «Иммунофарма» на эффективность производства и активность гипериммунной СК против рожи свиней на волах-продуцентах
| № | Интервал между | Дозы антигена, | Опытная группа волов- продуцентов | Контрольная группа | |||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Схема применение «Иммунофарма», | X Li | Активность СК, ЕА/мл | X Li | Активность СК, ЕА/мл | |||
| 1 | 4-5 | 10 | 5,0 | - | - | - | - |
| 2 | 20 | 5,0 | - | - | - | - | |
| 3 | 40 | 5,0 | - | - | - | - | |
| 4 | 60 |
| 1,00 | 28 | - | - | |
| 5 | 80 |
| 1,33 | 35 | - | - | |
| 6 | 100 | 5,0 | 1,83 | 50 | - | - | |
| 7 | 120 |
| 2,33 | 71 | 1,33 | 35 | |
| 8 | 150 |
| 2,83 | 100 | 1,80 | 50 | |
| 9 | 200 | 5,0 | 3,00 | 111 | 2,00 | 56 | |
| 10 | 250 |
| 3,33 | 143 | 2,5 | 83 | |
| Через 8-10 с |
| 3,33 | 143 | 2,67 | 91 | ||
| 11 | 4-5 | 300 |
| 3,50 | 167 | 3,17 | 125 |
| 12 | 300 |
| 3,67 | 189 | 3,33 | 143 | |
| Итого | 56-70 | 1630 |
| 3,83 | 200 | 3,40 | 145 |
Примечание: X Li - сумма отношения выживших к числу БМ, взятых в опыт на каждую дозу СК; ЕА/мл - активность сыворотки крови; СК - считают активной при содержании в 1 см3 не менее 40 ЕА; профилактическая доза - 80 ЕА/ кг; лечебная доза СК - 160 АЕ/кг.
Анализ полученных данных показывает, что десятикратный цикл гипериммунизации волов-продуцентов возрастающими дозами рожистого антигена в комбинации с иммуностимулирующим средством по оптимальной схеме обеспечивает устойчивый рост и максимальное накопление специфических антител в СК не ниже 160 ЕА/мл, в контроле же более 140 ЕА/мл. Полученный эффект подтвержден в опытах на мышах. Было показано, что «Иммунофарм» активизирует ферменты, метаболические и энергетические обмены, процессы лим-фопоэза, эритропоэза и фагоцитарной реакции макрофагов, а также стимулирует пролиферацию клеток крови (эритроцитов, лейкоцитов, СОЭ) и синтез гемоглобина на 25-32%. Следует также отметить, что содержание антителопродуцентов в селезенке мышей возрастает по сравнению с контролем практически в 2 раза, а относительное и абсолютное количество АОК достигает максимальных значений 101,5±52,4 и 103,6±6,9 кл/мышь 160 ЕА/мл [4].
На заключительном этапе работы в эксперименте оценивали эффективность разработанных инноваций при изготовлении сыворотки против рожи свиней. Применение на практике железосодержащего препарата «Пептофер» и более активных антигенов, оптимизированной схемы подготовки, гипериммунизации и эксплуатации волов-продуцентов с использованием иммуномодулирующего препарата «Иммунофарма» позволило изготовить и реализовать по две экспериментальные серии сыворотки крови с активностью 167 + 230, в контроле 125+147 ЕА/мл. Полученный результат достигнут за счет повышения (до 400 т мг/мл) активности антигена и коррекции иммунного статуса при помощи иммуностимулирующего средства «Иммунофарма». Указанные мероприятия были достаточно эффективными, экономически оправданными, позволили стабилизировать технологические процессы и повысить активность экспериментальных серий сыворотки против РС до максимальных значений.
Оценка стабильности технологических процессов производства гипериммунной сыворотки против рожи свиней была подтверждена при помощи контрольных карт Шухарта типа. Анализ представленных данных свидетельствует о том, что уровень накопления антител в сыворотке крови опытных партий был достоверно выше, чем в контроле, а показатели активности сыворотки находятся в пределах ±36 от средних значений активности исследуемых образцов.
Выводы. Таким образом, в результате выполненных исследований определена концентрация и доказано стимулирующее влияние железосодержащего препарата «Пептофер» на размножение бактерий рожи свиней. Определены технологические параметры периодического культивирования бактерий рожи свиней в биореакторе с добавлением в состав бульона Хоттингера «Пептофера», который стимулирует дыхательные процессы микроорганизма и обеспечивает максимальное накопление антигена.
Показано также, что естественный метаболит - «Иммунофарм» - оказывает выраженный иммуномодулирующий эффект как на клеточный, так и гуморальный иммунитет, что выражается в достоверном увеличении числа АОК в селезенке мышей и активности специфических антител в сыворотке крови волов-продуцентов. Постоянное использование на практике железосодержащего препарата «Пептофер» и иммуномодулирующего средства «Иммунофарм» позволило не только существенно повысить активность антигена и сыворотки против рожи свиней, но и сократить затраты труда, средств и времени на производство конечного продукта. Пригодность и перспективность разработанных нами технологических решений при изготовлении сыворотки против рожи свиней подтверждены, востребованы практикой и экономически оправданы.
Список литературы:
Резюме. Высокая патогенность бактерий рожи свиней для животных и опасность заражения человека определили значимость и актуальность проблемы серийного производства активных антигенов и оптимизации технологических процессов изготовления сыворотки крови против рожи свиней, отвечающей требованиям отечественных и международных стандартов. При реализации этих задач целенаправленно проводится поиск эффективных средств и методов повышения активности бактериальных антигенов. В последние годы установлена высокая потребность бактерий рожи свиней в различных аминокислотах, микроэлементах, в ионах 2-валентного железа с пептидами и ряде других органических солей. Доказана пригодность и перспективность применения полученных антигенов для изготовления иммунобиологических препаратов. В статье представлены материалы о потребности бактерий рожи свиней в ионах 2-валентного железа и его участии в стимуляции процесса размножения микроорганизма. Авторами определена оптимальная концентрация органической формы железосодержащего препарата «Пептофер», технологические параметры периодического культивирования и механизм стимулирующего влияния препарата на накопление бактерий рожи свиней в биореакторе с добавлением его с бульон Хоттингера. В качестве иммунномодулирующего средства для гипериммунизации волов-продуцентов предложен препарат «Иммунофарм», который обеспечивает устойчивый рост и максимальное накопление антител против рожи свиней в сыворотке крови волов-продуцентов. Разработана схема применения и изучен механизм стимулирующего влияния препарата на синтез специфических антител в организме волов-продуцентов. Постоянное использование на практике железосодержащего препарата «Пептофер» и иммуномодулирующего средства «Иммунофарм» позволило не только существенно повысить активность антигена и сыворотки против рожи свиней, но и сократить затраты труда, средств и времени на производство конечного продукта. Пригодность и перспективность разработанных нами технологических решений при изготовлении сыворотки против рожи свиней подтверждены, востребованы практикой и экономически оправданы.
Ключевые слова: свиноводство, рожа свиней, микроорганизмы, органические соединения железа, технологические процессы, параметры культивирования бактерий, иммуномодулирующие препараты, гипериммунизация, сыворотка крови, волы-продуценты.
Сведения об авторах:
Сусский Евгений Владимирович, доктор биологических наук, директор ФКП «Армавирская биофабрика»; 352212, Новокубанский район, п. Прогресс, ул. Мечникова, д. 11; тел.: 8-86195-21211; e-mail: abf_dir@armbio.info.
Глушенкова Юлия Александровна, микробиолог ФКП «Армавирская биофабрика»; 352212, Новокубанский район, п. Прогресс, ул. Мечникова, д. 11; тел.: 10 8-86195-21211; e-mail: arm_bio@mail.kuban.ru.
Телишевская Любовь Яковлевна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» ФГБУ «ВГНКИ»; 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5; тел.: 8-495-9825084.
Ласкавый Владислав Николаевич, доктор ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник Саратовского научно-исследовательского ветеринарного института - филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии»; 410028, г. Саратов, ул. 53 Стрелковой дивизии, д. 6; e-mail: saratov@vniivvim.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Ночевная Татьяна Владимировна, кандидат биологических наук, главный специалист отдела регистрации АО «НПО» «Микроген»; 127473, г. Москва, 2-й Волконский переулок, д. 10; e-mail: tatu.noch@yandex. ru.
http://vetkuban.com/num6_201802.html