УДК636.082.4
Глазко Т.Т. ФГБОУ ВО "Российский государственный
аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева", г. Москва
Косовский Г.Ю., Попов Д.В., Бригида А.В. ФГБНУ "Центр экспериментальной
эмбриологии и репродуктивных биотехнологий", г. Москва
Введение. В современном молочном и мясном животноводстве использование трансплантации эмбрионов позволяет сохранять часть уникального племенного генофонда [2], обеспечивать ускоренное выведение животных с высокими показателями продуктивности, что открывает огромные возможности в разведении и воспроизводстве крупного рогатого скота как с целью повышения эффективности племенной работы, так и увеличения средней продуктивности стада в короткие сроки [1]. В настоящее время на базе интенсивного использования генетически ценных быков-произ-водителей с применением искусственного осеменения коров, темпы селекции увеличиваются в 2-3 раза [7]. В некоторых хозяйствах для повышения генетического прогресса проводится интенсивный отбор коров - потенциальных матерей. Таких коров используют в качестве доноров генетически ценных эмбрионов. Применение технологии трансплантации эмбрионов позволяет в короткие сроки получать высокоценные маточные семейства и более точно оценивать качество потомства. Углубленные исследования репродуктивной функции животных, ее возможная регуляция, микрохирургические манипуляции с зародышами показали, что метод трансплантации является основой ускоренного воспроизводства высокопродуктивных коров. Поэтому практическое применение этого метода в молочном и мясном животноводстве может обеспечить интенсивное размножение животных с высокой генетической ценностью, ускоренное получение высокоценного племенного молодняка, матерями которого являются выдающиеся родоначальницы [1].
Традиционные технологии эмбриотрансплантации дают сегодня довольно стабильные результаты [10]. В настоящее время ежегодно проводится более полумиллиона трансплантаций эмбрионов, 40% из них - после заморозки и оттаивания и 18% - выращенных in vitro [8]. Трансплантация эмбрионов ускоряет селекционный прогресс в молочном скотоводстве в 6-7 раз [1] по сравнению с традиционными методами разведения, поскольку, используя искусственное осеменение, от коровы получают одного и, как исключение, два теленка в год. Метод трансплантации позволяет получать зародыши от одного донора 4-5 раз в год, вследствие чего очевидна реальная возможность ежегодного получения от коровы до 10-30 и более телят. Это значительно ускоряет селекционный процесс [1] и одновременно увеличивает влияние коров - доноров эмбрионов - на генетическую структуру стада.
В большом количестве публикаций, посвященных изучению метода эмбриотрансплантаций [1, 5, 6], показаны преимущества метода: это элиминация особей с низким адаптивным потенциалом на уровне эмбрионов, а не среди плодов или новорожденных; возможность прогнозирования пола и хозяйственно полезных признаков; вероятность приобретения врожденного иммунитета к инфекциям, характерным для данной зоогеографической зоны, от суррогатных матерей; биологическая безопасность использования эмбрионов в части распространения инфекций; экономическая эффективность обусловленная, в частности, резким сокращением расходов по транспортировке взрослых животных; относительно быстрое решение повышения продуктивного статуса стада. В тоже время на сегодняшний день отсутствуют исследования о возможных биологических рисках этой технологии, в частности накопления генетического груза в потомстве, получаемом в результате эмбриотрансплантаций [3]. Например, цитогенетические исследования эмбрионов млекопитающих, полученных в результате оплодотворения in vitro, позволили установить, что 18% эмбрионов несут хромосомные аномалии (из них 8% гаплоиды, 2% анеуплоиды. 8% полиплоиды) [4, 9].
Целью работы стали исследования по выявлению связи между частотой встречаемости отдельных цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у коров-доноров и количеством полученных от них эмбрионов.
Материалы и методы. Практические и научные исследования проводили в ФГБНУ "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий" на базе отдела экспериментальной трансплантологии. Работы проведены на поголовье здоровых коров чёрно-пёстрой голштинизированной породы в возрасте 4-5 лет, в условиях промышленной молочной фермы ЗАО "Можайский" с участием специалистов хозяйства. Опытные группы животных формировали по принципу пар-аналогов, исходя из физиологического состояния, возраста, продуктивности, живой массы и стадии полового цикла. Для исследований подбирали здоровых животных в возрасте 4-5 лет, которые после отела в течение сервис-периода (3 месяца) проявляли полноценную половую цикличность (наличие всех феноменов полового цикла).
С целью индуцирования суперовуляции отобранным коровам-до-норам применяли стандартную схему, включающую внутримышечное введение препарата ФСГ-супер на 9-, 10-, 11-, 12-е сутки спонтанного эстрального цикла в дозах 12, 8, 4, 4 мг/гол/ в сутки и простагландина магэстрофана - 4 мл/гол внутримышечно однократно, на 12-е сутки. Через 48 часов после введения простагландина проводили процедуру искусственного осеменения трехкратно по схеме утро-вечер-утро, и на 7-8 сутки проводили извлечение эмбрионов. Оценку количественно-качественных показателей полученных эмбрионов проводили по общепринятой методике.
Для того чтобы оценить возможный вклад генетических дефектов коров-доноров в группы животных, получаемых в результате эмбриотрансплантаций, был проведен сравнительный анализ между рядом характеристик нестабильности генетического аппарата коров и количеством вымываемых у них эмбрионов.
Для проведения цитогенетических исследований перед индукцией суперовуляции у тестируемых животных брали кровь в стерильные гепаринизированные пробирки. Краткосрочную культуру клеток крови готовили обычным способом на среде Хенкса-199 с добавлением антибиотиков (стрептомицин и пенициллин) и фитогемагглютенина. Чтобы не вызвать разрушение межхромосомных ассоциаций по типу робертсоновских транслокаций, в культуру не добавляли митогены. Затем проводили культивирование клеток на протяжении 72 часов в термостате при температуре 37°С. В дальнейшем суспензию центрифугировали (1000 об/мин, 10 минут), инкубировали в гипотоническом растворе KCl (0,54%) на протяжении 50 минут, фиксировали смесью метилового спирта с уксусной кислотой в соотношении 3:1 в следующей последовательности: добавляли (наслаивали) фиксатор к клеточной суспензии, освобожденной от гипотонического раствора и полтора часа инкубировали клетки при температуре +4°С. Затем центрифугировали при 1 тыс. об/мин в течение 7 мин, сливали супернатант, добавляли фиксатор, клетки суспензировали и центрифугировали в тех же условиях. Последнюю процедуру повторяли дважды. После последнего центрифугирования сливали супернатант и добавляли к клеткам свежий фиксатор. Следующим этапом оставляли в холодных условиях (+4°С) на сутки. Суспензию клеток наносили на чистые, охлажденные предметные стекла. Для получения хороших препаратов метафазных хромосом некоторые стекла "отжигали", остальные высушивали в комнатных условиях. После высушивания препараты окрашивали красителем Гимза (Gimza Merk).
В клетках периферической крови крупного рогатого скота оценивали следующие цитогенетические характеристики: частоты встречаемости метафаз с ассоциациями хромосом по центромерным ^ районам по типу робертсоновских транслокаций; хромосомными аберрациями (хромосомные, хроматидные разрывы; кольцевые хромосомы, фрагменты); асинхронным расщеплением центромерных районов хромосом; доли полиплоидных и анеуплоидных клеток. Для этой цели рассчитывали два типа анеуплоидии. Первый тип обозначали как А! - доля клеток с анеуплоидией общего типа среди всех встречающихся метафаз. Как правило, число хромосом в них колебалось у крупного рогатого скота от 53 до 67. Очевидно, что в изменчивость данной характеристики существенный вклад могут вносить особенности гипотонической обработки клеток и изменчивость стабильности их плазматических мембран. Ко второму типу анеуплоидии (АН) мы относили метафазы, в которых число хромосом было, в частности, у крупного рогатого скота или 59, или 61 (то есть 2n±1). Предположительно этот тип анеуплоидии, приобретение либо утрата одной хромосомы, с относительно большей вероятностью может быть связан с нарушениями расхождения хромосом в митозе, чем при первом варианте анеуплоидии.
Рассматривались три варианта микроядерного теста: подсчет эритроцитов с микроядрами, подсчет одноядерных лимфоцитов с микроядрами и подсчет двуядерных лимфоцитов с микроядрами.
Для анализа частоты встречаемости микроядер в эритроцитах каплю периферической крови разводили физиологическим раствором (1:1) и готовили мазки. Мазки фиксировали метиловым спиртом и высушивали при комнатной температуре. Подсчет микроядер в эритроцитах проводился суммарно в поли- и нормохроматофильных эритроцитах после окраски красителем Гимза. Во всех случаях подсчета микроядер в различных клеточных популяциях количество микроядер на клетку не учитывали. У крупного рогатого скота выполнены сравнения частот встречаемости эритроцитов с микроядрами в свежих мазках и после краткосрочного культивирования цельной крови в течение 72 часов, а также после центрифугирования для формирования лейкоцитарного слоя клеток в целях увеличения популяции лимфоцитов для культивирования. Обнаружено, что частота встречаемости эритроцитов с микроядрами существенно (в 2-3 раза) возрастала после культивирования и после центрифугирования (от 3-4 эритроцитов с микроядрами на 1000 эритроцитов до 6-8 эритроцитов на тысячу, эксперименты были выполнены в 10-ти повторностях). Очевидно, что в процессе центрифугирования, так же как и при краткосрочном культивировании клеток периферической крови, наиболее легко должны разрушаться "старые" эритроциты. Двукратное увеличение частоты встречаемости эритроцитов с микроядрами при использовании этих процедур позволило нам прийти к выводу о том, что присутствие микроядер маркирует относительно более "юную" популяцию нормохроматофильных эритроцитов.
Анализ частот встречаемости делящихся клеток (митотический индекс-МИ) и двуядерных лимфоцитов (ДЛ) выполняли на препаратах клеток, приготовленных после краткосрочного культивирования клеток периферической крови крупного рогатого скота. Предполагалось, что количество двуядерных лимфоцитов (ДЛ), в основном, обусловлено незаконченностью цитокинеза и отношение двуядерных лимфоцитов к митотическому индексу (МИ) может объективно отражать изменчивость продолжительности конечных стадий клеточного деления.
В анализ по метафазным пластинкам включали следующие цитогенетические характеристики: анеуплоидия (А); полиплоидия (ПП); частота встречаемости метафаз с хромосомными аберрациями (хромосомные, хроматидные разрывы; фрагменты; кольцевые хромосомы) (ХА); с межхромосомными ассоциациями по типу робертсоновских транслокаций (МАРБ) и с асинхронностью расщепления центромерных районов хроматид (АРЦРХ). Их частоты встречаемости рассчитывали относительно всей выборки просмотренных метафаз. Частота встречаемости анеуплоидных клеток рассчитывалась в двух вариантах: доля всех вариантов анеуплоидных клеток (А1) среди исследованных и с учетом только анеуплоидных клеток с числом хромосом 2 n+1 (А11).
Статистическую обработку полученных данных проводили стандартными методами. Рассчитывали среднее значение частоты встречаемости клеток с цитогенетическими аномалиями на одно животное в исследованной группе (М) и стандартную ошибку среднего (±m). Межгрупповые отличия оценивали по критерию Стьюдента. Коэффициенты корреляции и их достоверность оценивали при использовании стандартной компьютерной программы (CSS/PC).
Для того, чтобы оценить возможный вклад животных с относительно повышенной частотой встречаемости цитогенетических аномалий в клетках крови в следующее поколение, получаемое с использованием эмбриотрансплантаций, выполнено сравнение соматического мутагенеза у коров-доноров и количества вымываемых у них эмбрионов (табл. 1, 2).
Таблица 1. Количественно-качественные показатели полученных эмбрионов от тестируемых животных
| Показатели | Коровы-доноры без цитогенетических | Коровы-доноры с цитогенетическими |
|---|---|---|
| Обработано животных. | 12 | 10 |
| Реагировало суперовуляцией, n-%. | 8-66,6 | 9-90 |
| Число овуляций всего (в среднем на донора) | 81 (9) | 126 (14) |
| Получено эмбрионов всего (в среднем на донора) | 73 (9,1) | 105 (11,6) |
| Пригодных к пересадке всего (в среднем на донора) | 53 (6,6) | 67 (7,4) |
| % от общего числа извлеченных эмбрионов | 72,6 | 63,8 |
| Дегенерированных всего (в среднем на донора) | 7 (0,8) | 20 (2,2) |
| % от общего числа | 9,6 | 19,0 |
| Яйцеклеток всего (в среднем донора) | 13 (1,6) | 18 (2,0) |
| % от общего числа | 17,8 | 17,1 |
| Оплодотворяемость яйцеклеток, % | 82,2 | 82,8 |
В таблице 1 представлены две группы животных, где в 1-ой группе коровы-доноры в количестве 12 голов без цитогенетических аномалий в клетках периферической крови, а во 2-ой группе коровы-доноры в количестве 10 голов с цитогенетическими аномалиями в клетках периферической крови. Как видно из представленных данных, в группе 1, реакция суперовуляции была положительной у 8 животных из 12, что составило 66,6% от обработанных животных, а в группе 2 у 9 голов коров из 10 или 90% от обработанных коров-доно-ров. Анализ результатов уровней суперовуляций показал, что в группе без цитогенетических аномалий общее число овуляций составило 81 или 9 в среднем на донора, а в группе, где были определены цитогенетические аномалии, число овуляции было равно 126 или 14 на донора. Количество полученных эмбрионов в первой группе составило 73, или 9,1 в среднем на донора, от второй группе доноров было получено 105 эмбрионов, что составило 7,4 на донора в среднем.
При оценке качества полученных эмбрионов в первой группе было определено 53 эмбриона, пригодных к трансплантации, или 6,6 эмбриона на донора, в группе с цитогенетическими аномалиями количество пригодных к трансплантации эмбрионов было равным 67, что составило 7,4 на донора в среднем. В процентном отношении количество пригодных к трансплантации эмбрионов в первой группе было выше, чем во второй, и равнялось 72,2% против 63,8%. Кроме того были определены дегенерированные формы эмбрионов в первой группе их количество было равным 7 или 0,8 эмбриона на донора, а во второй группе 20 или 2,2 эмбриона на донора, соответственно процент дегенерированных эмбрионов от общего числа полученных во второй группе был выше, чем в первой, и составил 19%, против 9,6% в первой группе коров. Общее количество неоплодотворенных яйцеклеток в первой группе было равным 13, или 17,8% от общего количества полученных эмбрионов, а во второй 18, или 17,1%. Оплодот-воряемость яйцеклеток была примерно равной и составила в первой группе 82,2%, а во второй группе 82,8%.
Таблица 2. Корреляционные взаимоотношения между разными характеристиками дестабилизации кариотипа в периферической крови коров-доноров эмбрионов и количеством эмбрионов
| Характеистики | Анеуплоидия I типа | Анеуплоидия II типа | Полиплоидия | Межхромосомные ассоциации | Хромосомные аберрации | Асинхронность раcщепления | Эмбрионы |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Анеуплоидия I типа | 1.00 |
|
|
|
|
|
|
| Анеуплоидия II типа | -.39 | 1.00 |
|
|
|
|
|
| Полиплоидия | -.23 | .34 | 1.00 |
|
|
|
|
| Межхромосомные ассоциации | -.43 | .45 | .61 | 1.00 |
|
|
|
| Хромосомные аберрации | .37 | -.29 | -.38 | -.58 | 1.00 |
|
|
| Асинхронность расщепления | -.07 | .09 | .01 | -.09 | -.40 | 1.00 |
|
| Эмбрионы | -.15 | -.24 | -.43 | -.31 | .58 | -.45 | 1.00 |
В таблице 2 показана частота встречаемости цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у коров и количество получаемых от них эмбрионов, рассчитаны корреляционные взаимоотношения между разными характеристиками дестабилизации кариотипа в периферической крови коров-доноров и количеством эмбрионов. Оказалось, что между количеством эмбрионов и такой цитогенетической характеристикой, как частота встречаемости метафаз с хромосомными аберрациями, существует статистически достоверная положительная корреляция (Р<0,05). То есть, в популяцию вымытых эмбрионов наибольший вклад вносили эмбрионы, получаемые от коров-доноров, для которых была характерна повышенная частота встречаемости цитогенетических аномалий в метафазных пластинках клеток периферической крови.
Таким образом, выявлена статистически достоверная корреляция между частотой встречаемости отдельных цитогенетических аномалий в клетках периферической крови у коров-доноров эмбрионов и количеством полученных от них эмбрионов.
Заключение. По результатам проведенных исследований можно сделать заключение, что у коров-доноров с цитогенетическими аномалиями отмечается более высокий уровень ответной реакции на введение гонадотропинов, выражающийся увеличением количества эмбрионов, которые в случае успешной эмбриотрансплантации приведут к накоплению генетического груза в ряду последующих поколений. Из этого следует, что для предупреждения накопления генетических дефектов в стадах крупного рогатого скота при применении биотехнологических приемов и ведении работы по воспроизводству и селекции необходимо кроме классических приемов и методик при подборе родительских пар проводить генетический контроль коров-доноров эмбрионов.
Список литературы:
Резюме. В современном сельскохозяйственном животноводстве наряду с традиционными методами воспроизводства все более широко и повседневно применяют современные репродуктивные биотехнологии, в частности технологии трансплантации эмбрионов полученных методами in vivo или in vitro. В научной и периодической литературе довольно широко представлены преимущества и положительные стороны этих приемов для использования их в программах по воспроизводству и селекционных процессах. Однако практически отсутствуют исследования, которые бы раскрывали негативные точки этих технологий. Так как суть технологии трансплантации эмбрионов заключается в получении генетического материала и тиражировании потомства от конкретных коров-доноров и использования его практически по всему миру, то биологическое влияние на генетические ресурсы отдельных регионов этих коров-доноров очевидно. В данной работе исследуется эмбриопродуктивность коров-доноров с различными цитогенетическими аномалиями в клетках периферической крови и изучается возможность их негативного биологического влияния на будущее потомство.
Практические и научные исследования проводили на поголовье здоровых коров чёрно-пёстрой голштинизированной породы в возрасте 4-5 лет, в условиях промышленной молочной фермы. По результатам проведенных исследований можно сделать заключение, что у коров-доноров с цитогенетическими аномалиями отмечается более высокий уровень ответной реакции на введение гонадотропинов, выражающийся увеличением количества эмбрионов, которые в случае успешной эмбриотрансплантации приведут к накоплению генетического груза в ряду последующих поколений. Из этого следует, что для предупреждения накопления генетических дефектов в стадах крупного рогатого скота при применении биотехнологических приемов и ведении работы по воспроизводству и селекции необходимо кроме классических приемов и методик при подборе родительских пар проводить генетический контроль коров-доноров эмбрионов.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, коровы-доноры, суперовуляция, трансплантация, эмбрионы, цитогенетика, геномная нестабильность, хромосомы, генетический дефект, цитогенетическая аномалия.
Сведения об авторах:
Глазко Татьяна Теодоровна доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры кормления и разведения животных ФГБОУ ВО "Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева"; 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49; e-mail: tglazko@rambler.ru.
Попов Дмитрий Владимирович, научный сотрудник ФГБНУ "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий"; 125480, г. Москва, ул. Костякова, 12, стр. 4; e-mail: info-ceerb@mail.ru.
Бригида Артём Владимирович, научный сотрудник ФГБНУ "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий"; 125480, г. Москва, ул. Костякова, 12, стр. 4; e-mail: info-ceerb@mail.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Косовский Глеб Юрьевич, доктор биологических наук, директор ФГБНУ "Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий"; 125480, г. Москва, ул. Костякова, 12, стр. 4; тел.: 8-495-610-21-31; e-mail: info-ceerb@mail.ru.
http://vetkuban.com/num6_201504.html