Люминесцентный спектральный анализ клеток железистого желудка цыплят при кишечных инфекциях

Акчурин С.В. Саратовский госагроунивврситет

В последние годы для диагностики патологических про-цессов в медицине и ветеринарии все чаще стали применяться люминесцентномикроскопические методы исследования [2, 3, 4, 5]. Однако, они имеют ряд недостатков, заключающихся, главным образом, в субъективной оценке обнаруживаемой флуоресценции.

Для повышения достоверности интерпретации результатов был разработан метод микроспектрального анализа, который с помощью люминесцентного метахроматического красителя "Steins all" позволяет выявлять соотношение нуклеиновых кислот (НК) и белков в клетках железистого желудка цыплят [1]. Соотношение этих веществ определяется по изменению их спектральных характеристик, что обеспечивает объективную регистрацию и, соответственно, оценку полученных результатов. Высокая чувствительность разработанного метода позволяет выявлять ранние биохимические сдвиги, развивающиеся в клетках до появления характерной клинической и патоморфологической картины воспалительного процесса. Это обстоятельство является крайне важным для дальнейшего раскрытия механизма патогенеза желудочно-кишечных инфекций бактериальной этиологии - колибактериоза, сальмонел-леза и клебсиеллеза, которые до настоящего времени остаются одной из основных причин массовой гибели птиц в птицеводческих хозяйствах. В связи с тем, что железистый желудок является первой "мишенью" на пути проникновения возбудителей указанных кишечных инфекций в организм птиц, была поставлена цель - провести оценку функционального состояния клеток слизистой и серозной оболочек железистого желудка при указанных заболеваниях с помощью метода люминесцентного спектрального анализа.

Исследования проводили на 750 цыплятах породы хайсекс коричневый, взятых из благополучного по инфекционным заболеваниям хозяйства. Цыплята по принципу аналогов были разделены на 4 группы: 3 опытные (по 200 цыплят) и 1 контрольная (150 цыплят). Заражение цыплят опытных групп проводили в двухдневном возрасте пероральным путем с помощью однограммового шприца и иглы с булавовидной напайкой на конце. Цыплят 1-ой опытной группы инфицировали бактериями Escherichia coli в разведении 200 млн бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,2 мл/голову. Цыплят 2-ой опытной группы - бактериями Salmonella enteritidis в разведении 200 млн бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,2 мл/голову. Цыплят 3-ей опытной группы -бактериями Klebsiella pneumoniae в разведении 2,5 млрд бактериальных клеток в 1 мл в заражающей дозе 0,4 мл/голову. Цыплятам контрольной группы вводили физиологический раствор в объеме 0,4 мл/голову.

Гистологические препараты железистого желудка цыплят всех групп исследовали на 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 15, 21 и 30-е сутки их жизни. Гистологические срезы толщиной 4-7 мкм изготавливали на микротоме "Mikrom НМ450" (Германия) из парафиновых блоков кусочков железистого желудка, фиксированных в 10% нейтральном забуференном водном растворе формалина. Общую картину изменений изучали на гистологических препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, люминесцентномикроскопические характеристики - на гистопрепаратах, окрашенных 10-4М спиртовым раствором "Steins all" по методике, разработанной применительно к гистологическим срезам. Спектры люминесценции получали с помощью универсального цветоанализатора микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К, источниками света в котором являлись ртутная лампа НВО 100 W/2. Объектом для исследования методом спектрального анализа служили клетки серозной оболочки железистого желудка цыплят. Величину интенсивности люминесценции регистрировали в синей (1480) и красной (1630) областях ее спектра, и по полученным данным определяли коэффициенты соотношений НК и белков в соответствии с разработанной методикой [1].

При сравнительной визуальной оценке микроскопических изменений, обнаруженных в гистологических препаратах железистого желудка птиц с кишечной патологией, значимых идентификационных диагностических признаков не выявлено. В гистопрепаратах стенки железистого желудка цыплят контрольной группы патологические изменения отсутствовали.

В гистологических срезах стенки железистого желудка, окрашенных "Steins all", наблюдали своеобразную люминесцентномик-роскопическую картину, характеризующуюся сочетанием синего, зеленоватого и малиново-красного цветов с разной степенью интенсивности на различных участках серозной, слизистой оболочек и мышечного слоя железистого желудка. Обнаруживаемая визуально люминесценция отражала особенности распределения в его стенке НК и белков, связанных с используемым флуорохромом.

Рис. 1. Изменение показателей коэффициентов соотношений НК и белков в клетках серозной оболочки железистого желудка цыплят контрольной (IV) и опытных групп (I - колибактериоз, II - сальмонеллез, III - клебсиеллез). По оси ординат - значения коэффициентов соотношений НК и белков (К), по оси абсцисс - сутки жизни (сут).

Динамика коэффициентов соотношения НК и белков в стенке железистого желудка цыплят контрольной группы указывала на постепенное умеренное увеличение их значений с 1 по 30 сутки (рис. 1, IV). Данное обстоятельство может быть объяснено постепенным и опережающим увеличением интенсивности люминесценции при 480 нм (In) относительно возрастания ее величины при 630 нм (lb), которое наблюдалось в спектрах люминесценции клеток данной зоны. Эта тенденция сохранялась на протяжении всего периода эксперимента (рис. 2а).

При изучении динамики изменений коэффициентов соотношений НК и белков (1480/1630) в клетках серозной оболочки железистого желудка цыплят, инфицированных бактериями Escherichia coli (I опытная группа), на кривой коэффициентов (рис. 1, I) отмечали два пика (на 6 и 10 сутки жизни). Первый пик может быть следствием увеличения In на фоне уменьшения lb, а второй пик -результатом более быстрого уменьшения величины lb относительно снижения In (рис. 2б). К 15 суткам коэффициент соотношения органических веществ несколько снизился и оставался в пределах этих значений вплоть до 30 суток (рис. 1, I), что может быть объяснено значительным уменьшением как величины In, так и lb (рис. 26). При этом следует отметить, что коэффициенты соотношения органических веществ у цыплят, больных колибактериозом, были намного меньше аналогичных показателей контрольной группы в сроки от 8 до 30 дней жизни (рис. 1).

У цыплят, инфицированных бактериями Salmonella enteritidis (II опытная группа), на кривой коэффициентов соотношения НК и белков (рис. 1, II) наблюдали два пика (на 3 и 8 сутки жизни), что может быть связано с опережающим ростом величины In относительно lb, который регистрировался в спектрах люминесценции клеток серозной оболочки в эти сроки (рис. За). К 15 суткам коэффициент 1480/1630 резко снизился, что может быть результатом значительного уменьшения величины lb по сравнению со снижением In. К 30 суткам произошло незначительное повышение значения коэффициента, что может быть объяснено более быстрым возрастанием In, по сравнению с ростом lb (рис. За). При этом коэффициенты соотношения органических веществ с 10 по 30 сутки их жизни цыплят, больных сальмонеллезом, продолжали оставаться в более низких пределах, чем в контрольной группе (рис. 1).

Рис. 2. Величина интенсивности люминесценции НК (In) и белков (lb) в спектре люминесценции клеток серозной оболочки железистого желудка цыплят контрольной (а) и I опытной (б) групп. По оси ординат - величина интенсивности люминесценции, по оси абсцисс - сутки жизни. Рис. 3. Величина интенсивности люминесценции НК (In) и белков (lb) в спектре люминесценции клеток серозной оболочки железистого желудка цыплят II (а) и III (б) опытных групп. По оси ординат - величина интенсивности люминесценции, по оси абсцисс - сутки жизни.

Уцыплят, инфицированных бактериями Klebsiella pneumoniae (III опытная группа) на кривой коэффициентов соотношений НК и белков (рис. 1, III) отмечали два пика (на 7 и 21 сутки жизни). Появление пика на 7 сутки может быть результатом более быстрого роста величины In по сравнению с lb, а резкий скачок на 21 сутки может быть связан с продолжающимся ростом величины In на фоне значительного снижения величины lb (рис. 3б). К 30 суткам наблюдали значительное уменьшение коэффициента соотношения органических веществ, при этом его значение было намного ниже, чем в контрольной группе (рис. 1). Это может быть следствием некоторого снижения величины In и одно-временного увеличения lb к этому сроку жизни больных клебсиеллезом цыплят (рис. 3б).

Проведенное исследование показало, что выявленные с помощью метода люминесцентного спектрального анализа (с использованием метахроматического флуоресцентного красителя "Steins all") изменения функционального состояния клеток серозной оболочки железистого желудка, развивающиеся в ответ на внедрение в организм цыплят возбудителей кишечных инфекций (колибактериоз, сальмонеллез и клебсиеллез), определяют характерные для каждого вида инфекционного процесса особенности динамики изменений коэффициентов соотношений НК и белков. Так, у цыплят контрольной группы изменение коэффициентов соотношений этих веществ укладывается в картину умеренного и равномерного возрастания их значений, а у инфицированных цыплят кривая, отражающая динамику этих коэффициентов, включает и повышение, и уменьшение их значений. У цыплят контрольной группы обнаруженные изменения свидетельствовали о постепенном повышении функциональной активности клеток данной зоны соответственно увеличения их возраста, а у цыплят опытных групп они указывали на сложные изменения функционального состояния клеток серозной оболочки. При этом, изменения функциональных механизмов клеток этой зоны имели свои особенности, присущие каждому отдельно взятому виду кишечной инфекции, что нашло отражение на кривой динамики коэффициентов соотношения органических веществ.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о возможности с помощью данного метода улавливать изменения функциональной активности этих клеток на ранних стадиях развития кишечных инфекций. Полученные данные могут оказаться полезными при разработке принципиально нового подхода к вопросу создания современных технологий диагностики, профилактики и лечения колибактериоза, сальмонеллеза и клебсиеллеза.

Список литературы

1. Акчурин, СВ. Новый метод люминесцентного анализа соотношений нуклеиновых кислот и белков в серозной оболочке железистого желудка цыплят с использованием флуорохрома "Steins all"/ СВ. Лкчурин // Весшик НГЛУ. - 2012. - N° 1 (22). - С. 72-78.
2. Метлин, А.Е. Диагностика бешенства животных с использованием реакции иммунофлюоресценции. / Л.Е. Метин, Н.Л. Назаров, С.С. Рыбаков, Н.М. Михайлина, К.Н. Груздев, Л.В. Чепуркин, Л.Л. Еюров // Ветеринария. - 2006. - N°2. - С. 20-23.
3. Ханис, А.Ю. Вирулентные и люминесцентные свойства разных штаммов Microsporum canis / Л.Ю. Ханис // Ветеринария. - 2003. - N°2. - С. 25-27.
4. Шмидт Т.О., Плешакова, В.И. Биологические свойства микроорганизмов, выделенных из толстого кишечника перепелов в норме и при дисбактериозе. / Ветеринарная патология. - 2012, N° 2 (40). - с. 64-66.
5. Marangoni, Л. Phagocytosis of treponema pallidum and reaclive oxigen species production by isolated rat Kupffer cells/ Л. Marangoni, R. Aldini, M. Guardigli, V. Sambri, L. Giacani, M. Montagnani, Л. Roda, R. Cevenini // Medical Microbiology and Immunology. - 2003. - T. 192. - N° 4. - С 183-188.

Реферат

Целью работы стало проведение оценки функционального сосстяния клеток слизистой и серозной оболочек железистого желудка цыплят экспериментально зараженных колибактериозом, сальмонеллезом и клебсиеллезом, с помощью метода люминесцентного спектрального анализа.

Проведенное исследование показало, что выявленные с помощью метода люминесцентного спектрального анализа (с использованием флуоресцентного красителя "Steins all") изменения функционального состояния клеток серозной оболочки железистого желудка, развивающиеся в ответ на внедрение в организм цыплят возбудителей кишечных инфекций, имеют характерные для каждого вида инфекционного процесса особенности изменения коэффициентов соотношений нуклеиновых кислот и белков в динамике.

Резулыаты проведенного исследования свидеюльавуют о возможности с помощью данного метода улавливать изменения функциональной активности этих клеток на ранних стадиях развития кишечных инфекций. Полученные данные могут оказаться полезными при разработке нового подхода к вопросу создания современных технологий диагностики, профилактики и лечения колибактериоза, сальмонеллеза и клебсиеллеза.

Ключевые слова: нуклеиновые кислоты, белки, гистопрепараты стенки железистого желудка, люминесцентная метка-краситель "Steins all", люминесцентный спектральный анализ, колибактериоз, клебсиеллез, сальмонеллез, цыплята.

Сведения об авторе

Ответственный за переписку с редакцией: Акчурин Сергей Владимирович, кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры морфологии и патологии животных ФГБОУ ВПО "Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И.Вавилова*: 410012, г. Саратов, Театральная пл.. 1. 8(8452) 23-09-70. 8(927)2235883, akchurin@sgau.ru.

UDC 577.3

LUMINESCENT ANALYSIS OF GLANDULAR STOMACH CELLS IN CHICKENS AT ENTERIC INFECTIONS

Akchurln S.V.

Summary

Using the fluorescent spectrum analysis author evaluated functional condition of cells of the mucous and serous membranes of the glandular stomach of chickens experimentally infected with colibacillosis, salmonellosis and klebsiellosis.

Oral infection of chickens of test groups was carried out in a two-day age using bacteria Escherichia coli, Salmonella enieriiidis and Klebsiella pneumoniae. Histological samples of glandular stomach of chickens of all groups were examined at 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 15, 21 and 30th day of life. Luminescence intensity value was registered in blue (1480) and red (1630) spectral range and proportion factors of nucleic acids and proteins were determined according to obtained data in accordance with the developed methodology.

Changes in the functional condition of cells of serous membrane of the glandular stomach, identified by the method of luminescent spectral analysis, developing in response to the introduction of enteric causative agents into the body of chickens are specific to each type of infection especially by changing correlation coefficients of nucleic acids and proteins in the dynamics.

Results testify the possibility of using the method for estimation of cells' functional activity at the early stages of enteric infections. Resulting data can be used at the development of fundamentally new approach to the problem of creation of modern diagnostic technologies, preventive measures and treatment of colibacillosis, salmonellosis and klebsiellosis.

Key words: nucleic acids, proteins, histological samples of glandular stomach, luminescent tag "Steins all", luminescent spectral analysis, colibacillosis, klebsiellosis, salmonellosis, chickens.

References

1. Akchurln S.V. Novy metod lyuminesiseninogo analiza sooinosheniy nukleinovykh kislot i belkov vseroznoy obolochke zhelezistogo zheludka tsyplyat s ispolzovaniem fluorokhroma "Steins all" [New method of luminescent analysis of proportion of nucleic acids and proteins in serosal cuticle in glandular stomach in chickens using fluorchrome "Steins alls]. - 2012 - pp. 72-78.
2. Metlin Л.Е., Nazarov N.A., Rybakov S.S., Mihaylina N.M., Gruzdev K.N., Chepurkin A.V., Egorov Л.Л. Diagnosiika beshensiva zhivotnykh s ispolzovaniem reaktsii immunoflyuoresisenisii [Diagnostics of animal rabies using immunofluorescence reaction]. - Veterinariya. - 2006,(2). - pp. 20-23.
3. Khanis A.Yu. Viruleninye i lyuminesiseninye svoysiva raznykh shtammov Microsporum canis [Virulent and luminescent characteristics of various Microsporum canis strains]. - Veterinariya. - 2003, (2). - pp. 25-27.
4. Shmidt G.O., Pleshakova V.I. Biologicheskie svoysiva mikroorganismov, vydelennykh iz tolstogo kishechnika perepelov v norme i pri disbakterioze Biological properties of microorganisms at colon of quail at normal and dysbacteriosis]. - Veterinarnaya patologiya. - 2012, (40). - pp. 64-66.
5. Marangoni, Л. Phagocytosis of treponema pallidum and reactive oxigen species production by isolated rat Kupffer cells/ Л. Marangoni, R. Aldini, M. Guardigli, V. Sambri, L. Giacani, M. Montagnani, Л. Roda, R. Cevenini // Medical Microbiology and Immunology. - 2003. (4). - pp. 183-188.

Author affiliation

Responsible for correspondence with the editorial board: Akchurln Sergey V., Ph.D. In Veterinary Medicine, associate professor of the department of animal morphology and pathology of the Vavllov Saratov State Agrarian University; 1, Teatralnaya sq., Saratov, 410012; 8(8452) 23-09-70, 8(927)2235883, e-mall: akchurln@sgau.ru.

http://vetkuban.com/num6_20125.html