Скляров О.Д. ФГБУ "Всероссийский государственный Центр качества и
стандартизации лекарственных средств для животных и кормов"
Моторыгин А.В. ФГБОУ ВПО "Московский государственный университет
пищевых производств"
Эшерихиоз - остро и подостро протекающее заболевание, играющее важную роль в неонатальной патологии крупного рогатого скота, так как достаточно распространено и наносит значительный экономический ущерб животноводству за счет высокой смертности и задержке роста реконвалесцентов [1, 2, 4, 5, 6, 8, 10].
Циркулирующие среди животных эшерихии различаются по антигенной структуре [3, 5, 9, 11, 12, 13]. В связи с этим, разработка и применение средств специфической профилактики, впрочем, как и средств диагностики, невозможны без постоянного углубленного изучения этиологической структуры эшерихиоза и антигенной структуры эшерихий.
Целью работы явилось изучение этиологической структуры эшерихиоза телят и патогенных свойств изолятов Escherichia coli, выделенных из патологического материала молодняка крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Рязанской области.
Материалы и методы. Диагноз на эшерихиоз устанавливали с учетом анализа клинико-эпизоотологических данных, патоморфологических изменений результатов и результатов бактериологических исследований, выполненных в соответствии с "Методическими указаниями по колибактериозу (эше-рихиозу) животных" (2000). Серогрупповую принадлежность E.coli определяли набором стандартных "О - колисывороток", выпускаемых ФГУП "Армавирская биофабрика". Определение серогрупповой принадлежности изолятов, нетипирующихся сыворотками стандартного набора, проводили путем получения агглютинирующих кроличьих сывороток к изолятам с последующей их идентификацией эталонными штаммами эшери-хий. Реакции оценивали по скорости образования и характеру агглютината, а также степени просветления реакционной смеси. Статистическую обработку результатов исследований проводили общепринятыми методами [7].
Результаты исследований и обсуждение. В период с 2007 по 2010 годы был проведен ретроспективный анализ эпизоотический ситуации инфекционных болезней крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Рязанской области в соответствии с первичными данными ветеринарной отчетности с 2007 по 2010 годы: форма N° 2 "Журнал для записи противоэпизоотических мероприятий"; форма N° 3 "Журнал для записи эпизоотического состояния района"; форма N° 16 "Журнал серологического исследования крови". Согласно результатам анализа смертность телят 2-3-х суточного возраста за период 2007-2010 годов составила 2,6%, летальность - 2,9% в 2007 году и 4,2% в 2008 году, 3,2% в 2009 году, 5,2% в 2010 году. При анализе данных по желудочно-кишечным болезням молодняка крупного рогатого скота установлено, что по Кораблинскому и Сторожиловскому районам Рязанской области в 2007 году было зарегистрировано 34 больных животных в возрасте до 5-ти суток, в 2008 году - 45 больных животных, в 2009 году - 32, в 2010 году - 48 больных животных в возрасте до 5-ти суток. Из общего числа желудочно-кишечных болезней у молодняка в возрасте до 5 суток 45,8-59,5% составляет эшерихиоз. В 2007 году была зарегистрирована 21 голова животных, павших с подтвержденным бактериологическим исследованиями диагнозом эшерихиоз, что составило 58,6% от общего числа болезней; в 2008 году - 26 голов (52,4%); в 2009 году - 23 головы (55,4%); в 2010 году - 21 голова (47,4 %).
У телят при желудочно-кишечной инфекции ведущим клиническим признаком была диарея, проявляющаяся выделением жидких фекалий серовато-белого или желто-серого цвета с пузырьками газа или примесью слизи, со зловонным запахом. У больных животных наблюдали потерю аппетита, нарастающую слабость, адинамию, нарушение сердечной деятельности, учащенное и поверхностное дыхание, интоксикацию. Поражение центральной нервной системы характеризовалось судорогами, парезами, параличами конечностей, депрессией, сменяющейся возбуждением. При затяжном течении инфекции развивалось обезвоживание и истощение. Кроме того, наблюдались серозно-катаральные или серозно-гнойные истечения из носовых полостей, кашель, хрипы в области бронхов и легких, конъюнктивит, артрит. При патологоанатомическом исследовании на эпи- и эндокарде в области клапанов часто отмечались точечные и пятнистые кровоизлияния. Легкие имели мраморный рисунок с наличием лобулярной пневмонии, в бронхах и трахее выявлялся пенистый экссудат. В почках под капсулой отмечали точечные кровоизлияния, четкой границы между корковым и мозговым слоем не наблюдалось. Поражения органов пищеварения характеризовались катаральным или катарально-геморрагическим гастроэнтеритом с наличием точечных, пятнистых и полосчатых кровоизлияний на слизистой оболочке тонкого и толстого отделов кишечника; мезентериальные лимфатические узлы были увеличены, на разрезе сочные, красного или вишневого цвета. Брыжейка толстого отдела кишечника отечная, кровеносные сосуды инъецированы. В брюшной полости содержался серозный экссудат светло-желтого цвета, иногда с примесью крови. Печень имела глинистый цвет, пульпа органа на разрезе была дряблой консистенции. Селезенка с утолщенными краями или увеличена, с точечными кровоизлияниями под капсулой.
Анализ клинико-эпизоотологических данных и патоморфологических морфологических изменений дает основание предположить, что основную долю болезней молодняка крупного рогатого скота в возрасте до 5-ти суток составляет эшерихиоз. Для бактериологического исследования использовали патологический материал от телят в возрасте от 2-х до 6-ти суток, в том числе:
Всего при исследовании было выделено 86 культур семейства Enterobacteriaceae, из которых 64 культуры были идентифицированы как E.coli, 10 - P. mirabilis, 9 - K.pneumoniae, 3 - S.typhimurium (табл. 1).
Таблица 1. Видовой состав энтеробактерий, выделенных в животноводческих хозяйствах
| Вид энтеробактерий | Патологический материал | Фекалии | Смывы со слизистых оболочек | Смывы с объектов репродукторных помещений | Всего | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | Абс. | % | |
| E. coli | 6 | 27,83 | 30 | 36,14 | 15 | 9,59 | 13 | 8,24 | 64 | 81,17 |
| S. typhimurium | - | - | - | - | - | - | 3 | 2,36 | 3 | 2,36 |
| K. pneumoniae | 1 | 0,61 | 4 | 3,25 | 4 | 4,24 | - | - | 9 | 6,13 |
| P. mirabilis | 1 | 0,35 | - | - | 5 | 5,42 | 4 | 4,01 | 10 | 10,13 |
| Всего | 8 | 28,79 | 34 | 39,26 | 24 | 20,85 | 20 | 14,28 | 86 | 100 |
При определении серогрупповой принадлежности 64 изолятов в РА поливалентными сыворотками к E.coli положительно реагировали 30 (46,87%), из них 17 (56,7%) агглютинировались поливалентной сывороткой "группы N° 1", 11 (36,6%) -"группы N° 3", 2 (6,6%) - всеми сыворотками.
Среди 17 изолятов, взаимодействовавших с сывороткой "группы N°1", 10 (55,5%) были отнесены к серогруппе 08; 5 (27,7%) -к серогруппе 0115; 3(16,6%) - к серогруппе 0126.
Все 11 культур, реагировавших с третьей поливалентной сывороткой, были отнесены к серогруппе 035 (табл. 2).
Таблица 2. Результаты исследования серогрупповой принадлежности изолятов E. coli, выделенных при желудочно-кишечных болезнях телят
| Поливалентные сыворотки |
| Моновалентные сыворотки | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | О157 | ||||||||
| ++++ | - | - | - | - | 01 | 02 | 04 | 08 | 078 | 0111 | 0115 | 0126 |
| +++ | - | - | - | - | 01 | 02 | 04 | 08 | 078 | 0111 | 0115 | 0126 |
| - | - | ++++ | - | - | 033 | 035 ++++ | 041 | 086 | 0101 | 0103 | 0117 | 0137 |
| ++++ | - | - | - | - | 01 | 02 | 04 | 08 | 078 | 0111 | 0115 | 0126 |
| ++++ | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| ++++ | - | - | - | - | 01 | 02 | 04 | 08 | 078 | 0111 | 0115 | 0126 |
| - | - | - | - | - | 01 | 02 | 04 | 08 | 078 | 0111 | 0115 | 0126 |
| - | - | +++ | - | - | 033 | 035 | 041 | 086 | 0101 | 0103 | 0117 | 0137 |
| - | - | - | - | - | 033 | 035 | 041 | 086 | 0101 | 0103 | 0117 | 0137 |
| ++++ | - | - | - | - | 01 | 02 | 04 | 08 | 078 | 0111 | 0115 | 0126 |
| - | - | - | - | - | 033 | 035 | 041 | 086 | 0101 | 0103 | 0117 | 0137 |
| Количество изолятов | - | - | 11 | - | 10 | - | - | 5 | 3 | |||
Примечание. - "++++" - агглютинация полная; "+++" - агглютинация почти полная; "++" - агглютинация не полная; "+" - агглютинация незначительная; "-" - отсутствие агглютинации.
Серогрупповую принадлежность изолятов, активных в отношении всех комплексных сывороток, определяли в РА с моновалентными сыворотками, входящими в состав набора. При этом культуры агглютинировали с гетерологичными сыворотками 04, 08, 015, 018, 035, 0115, 0117, 0119, 0139 с оценкой 3-4 креста. При постановке развернутой РА, типируемые культуры не агглютинировали с сыворотками серогрупп 04, 08, 015, 035, 0115, 0117, 0119 в разведении 1:200 и сывороткой серогруппы 018 - в разведении 1:1600. Тогда как сывороткой к серогруппе 0139 в разведении 1:3200 они агглютинировали с оценкой на 2 креста.
При серологической идентификации с помощью "0-колиагглютинирующих сывороток" 64 культур E.coli, выделенных из патологического материала от телят с признаками желудочно-кишечной инфекции, 18% отнесены к сероварианту 035; 16% - к сероварианту 08; 8% - к сероварианту 0115; 4% - к сероварианту 0126 (рис. 1).
Рис. 1 Серогрупповая принадлежность культур Escherichia coli, выделенных при желудочно-кишечных болезнях телят в хозяйствах Рязанской области
Как видно из данных диаграммы, 54% изолятов E.coli не удалось типировать с помощью имеющихся "0-колиагглютинирую-щих сывороток", поэтому следующей задачей явилось получение агглютинирующих сывороток с последующей идентификацией в РА эталонными штаммами эшерихий. Антигены нетипирующихся изолятов готовили однократно на весь цикл иммунизации, прогревая смывы агаровых культур в течение часа при 100°С, а затем консервировали 0,3%-ным формалином и использовали в качестве 0-антигена для иммунизации кроликов, предварительно проверив на стерильность и безвредность. Гипериммунизацию животных проводили по схеме, состоящей из 5 внутривенных инъекций антигена концентрации 2 млрд./см в нарастающих дозах: 0,2; 0,5; 1,0; 2,0 и 3,0 см3 с интервалом 5 суток. Через 8 суток после последней инъекции у кроликов производили забор крови и определяли титр антител в пробирочной РА с гомологичной культурой. Титр антител в сыворотке должен находиться от 1:3200 и выше, при оценке реакции в три-четыре креста. При более низком титре дополнительно инъецировали по 3 см3 антигена и обескровливали кроликов через 10 суток без предварительного исследования сывороток. Сыворотку выдерживали 48 часов при температуре 4-5°С, после чего центрифугировали при 3000 об/мин. в течение 20 минут и консервировали перекристаллизованной химически чистой борной кислотой. В результате гипериммунизации животных были получены 11 сывороток с титрами антител от 1:400 до 1:6400, пригодных для постановки РА. Сыворотки отстаивали в течение месяца, после чего проверяли на стерильность и использовали для постановки РА с 157 антигенами эталонных штаммов E.coli для определения серогрупповой принадлежности. Среди 11 полученных после гипериммунизации сывороток 6 относились к серогруппе 028, 4- к 066 и 1 принадлежала к серогруппе 0110.
Вирулентность бактерий определяли на лабораторных мышах массой 14-16 г, которых заражали внутрибрюшинно в дозах 2 млрд.; 400; 80; 16 - 32 млн. микробных тел, используя по 5 мышей на дозу. Вирулентность выражали в LD50. Средняя величина LD50 варьировала в пределах от 490,5 млн. до 987,4 млрд. микробных клеток и не зависела от источника выделения культуры. Наиболее вирулентными являются изоляты E.coli, серогруппы 08 и 0115, при заражении вызывают гибель 50% белых мышей в дозе 490,5 и 570 млн. микробных клеток (табл. 3).
Таблица 3. Результаты определения величины LD50 изолятов E.coli
| N° | Вид микроорганизмов | Источник выделения | LD50 микр.клеток |
|---|---|---|---|
| 1 | E.coli 08 | Референтный штамм | 540,0 млн. |
| 2 | E.coli 08 | Фекалии теленка | 490,7 млн. |
| 3 | E.coli 035 | Фекалии теленка | 987,4 млн. |
| 4 | E.coli 078 N°320 | Референтный штамм | 596,5 млн. |
| 5 | E.coli 0115 | Фекалии теленка | 570,0 млн. |
Заключение. Согласно результатам исследований в хозяйствах Рязанской области из патологического материала от телят в возрасте от 2-х до 5-ти суток с признаками желудочно-кишечной инфекции больше половины выделенных культур Escherichia coli являются не типируемыми по О-антигену. При серологической идентификации О-колисыворотками 64 культур не удалось типировать 35. Остальные культуры были отнесены к О-серогруппам: 10 к группе 08; 11 - 035; 5 - 0115; 3 - О126.
Кроличьи антисывороки к изолятам, не типирующим-ся по О-антигену, оценивали в РА с эталонным штаммами Escherichia coli. Согласно результатам этого теста 6,9% нети-пирующихся изолятов были отнесены к серогруппе 028, 4,0% - 066 и 1,7% - 0110.
Наибольшей вирулентностью обладали изоляты эшерихий, выделенные из фекалий теленка с клиническими признаками диареи, дегидратации и токсемии и отнесенные к серо-группам О8 и О115. При введении белым мышам в дозе 490,5 и 570 млн. микробных клеток, соответственно, они вызывали гибель 50% животных.
Список литературы
Реферат
В работе представлены данные по изучению этиологической структуры, анализ эпизоотических данных по желудочно-кишечным болезням, результаты определения патогенных свойств и серогрупповой принадлежности E.coli, выделенных из фекалий и патолого-анатомического материала при желудочно-кишечных болезнях телят.
Ключевые слова: эшерихии, энтеробактерии, серологическая идентификация, патогенные штаммы. Сведения об авторах
Моторыгин Антон Валерьевич, аспирант кафедры инфекционных и паразитарных болезней ФГБОУ ВПО "Московский государственный университет пищевых производств"; 115048, г. Москва, ул. Усачева, д. 19, кв. 61; тел. 8(916)9222455; e-mail:hystology@yandex.ru
Ответственный за переписку с редакцией: Скляров Олег Дмитриевич, доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник, заведующий отделом качества и стандартизации иммунобиологических лекарственных средств для животных ФГБУ "ВГНКИ"; 143541, Московская область, Истринский район, с. Ивановское, ОПХ "Манихино"", д.20, кв. 12; 8(916)9596530; e-mail:scliarov@yandex.ru.
UDC 619: 576. 807. 9
ETIOLOGICAL STRUCTURE OF ESCHERICHIOSE OF CALVES IN RYAZAN REGION
Sklyarov O.D., Motorygin A.V. Summary
Authors established that majority of diseases of young cattle aged up to 5 days amounts escherichiose. Data on its etiological structure, analysis of epizootic data on gastro-intestinal diseases, results of determination of pathogenic properties of serologic group identity of E.coli, isolated from feces and pathological-anatomical material at gastro-intestinal diseases of calves are presented in the article.
Over half of cultures of Escherichia coli isolated out of pathological material from calves aged 2 - 5 days with symptoms of gastro-intestinal infection in the farms of Ryazan region were not typed by O-antigen. The most virulent isolates of Escherichia were isolated from feces of calves with clinical signs of diarrhea, dehydration and toxemia, and were assigned to serologic groups O8 and O115.
Key words: Escherichia, enterobacteria, serological identification, pathogenic strains.
References
Author affiliation
Motorygin Anton V., post-graduate student of the department of infectious and parasitic diseases of the Moscow State University of Food Production; 61/19, Usachyeva st., Moscow, 115048; 8(916)9222455; e-mail: hystology@ yandex.ru.
Responsible for correspondence with the editorial board: Sklyarov Oleg D., D.Sc. in Veterinary Medicine, senior scientific assistant, head of the department of quality and standardization of immunological medical products for animals of the All-Russian State Center for Quality and Standardization of Animal Medications and Forages; the; 12/20, Manikhino experimental industrial farm, Ivanovo vllg., Istrinsky district, Moscow area, 143541; phone: 8(499)2560477; e-mail:scliarov@yandex.ru.
http://vetkuban.com/num6_20112.html