УДК 578.823:619
DOI 10.33861/2071-8020-2024-5-17-19
Веретенников В. В., Джавадов Э. Д., Тарлавин Н. В., Красков Д. А. Федеральное государственное бюджетное
образовательное учреждение высшего образования «Санкт-Петербургский государственный
университет ветеринарной медицины», г. Санкт-Петербург
Румянцев А. М., Иштуганова В. В. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Санкт-Петербургский государственный университет», г. Санкт-Петербург
Инфекционная бурсальная болезнь (далее, ИББ) являет-ся высококонтагиозным вирусным заболеванием. Она наносит большой экономический ущерб птицеводческой отрасли во всем мире. Болезнь протекает либо остро, с высокой смертностью, либо субклинически и приводит к иммуносупрессии у цыплят (в возрасте от 3 до 6 недель) из-за разрушения незрелых В-лимфоцитов в бурсе Фабрициуса. Вирус ИББ относится к роду Avibirnavirus семейства Birnaviridae [1]. На сегодняшний день выделено два антигенно различных серотипа (I и II) вируса ИББ. Серотип I вируса ИББ поражает цыплят и включает в себя по меньшей мере шесть различных подтипов, которые значительно отличаются по вирулентности. Серотип II вируса ИББ заражает в основном индеек и не является патогенным для кур [8].
Геном вируса ИББ состоит из двух сегментов двухцепочечной РНК, обозначаемых как A и B. Сегмент А кодирует 108-кДа полипротеин, который саморасщепляется с образованием VP2 (48 кДа), VP3 (32 кДа) и VP4 (28 кДа). VP2 и VP3 являются основными структурными белками вируса ИББ. Было доказано, что белок VP2 несет основные нейтрализующие эпитопы (1, 2, 4, 23) [5].
Для диагностических исследований и контроля напряженности иммунитета птиц во всем мире регулярно используют иммунофер-ментный анализ (ИФА) [2]. Существуют коммерческие наборы ИФА для выявления антител к вирусу ИББ. Эти наборы основаны на использовании цельных вирионов вируса, которые производятся по традиционной технологии. ИФА, основанные на использовании рекомбинантных антигенов вируса, ранее позволяли определять антигенное родство между штаммами вируса ИББ [4].
В Российской Федерации проведены похожие исследования с использованием рекомбинантных белков в качестве антигенов для ИФА на ИББ, однако авторы использовали белок VP3 вируса инфекционной бурсальной болезни [10]. В данном исследовании мы получили очищенный рекомбинантный белок VP2 вируса ИББ, синтезированный в бактериальной системе. Белок в составе клеточного лизата, а также в очищенном виде был использован для проведения непрямого ИФА с использованием положительных и отрицательных сывороток.
Целью работы являлось изучение возможности использования рекомбинантного белка VP2 вируса ИББ в качестве антигена в наборе ИФА. Результаты сравнивали с данными коммерческого набора ИФА Бест-Вет АТ-IBD (Вектор-Бест, Россия).
Материалы и методы исследований. Исследовательскую работу выполняли на базе ФГБОУ ВО СПбГУВМ и ФГБОУ ВО СПбГУ.
Плазмида, штаммы бактерий и условия культивирования. В работе использована полученная ранее плазмида pET23a-VP2, которая содержит последовательность гена оболочечного гликопротеина VP2 от эпизоотического штамма инфекционной бурсальной болезни «Синявинский» [3]. Для синтеза белков использовали штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)pLysS (генотип: F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB-mB-) A(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 indl sam7 nin5]) [malB+]K-12(AS) pLysS(CamR), Евроген, Россия).
Для культивирования бактерий использовали среду LB: l% триптон, 0.5% дрожжевой экстракт, l70 мМ NaCl, 2.4% агар (если среда твердая). Культуры бактерий E. coli рутинно выращивали в термостате при температуре 37°С. Для индукции синтеза белка в среду добавляли изопропил-р^-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) в концентрации 0,l мМ.
Анализ и очистка синтезируемых белков. После культивирования клетки бактерий собирали центрифугированием (5 минут при 5000 об/мин). Среду удаляли и осадок клеток разводили в фосфатно-солевом буфере (PBS, 0,01 M, pH 7,4) в объёме, соответствующем 1/5 объёма исходной культуры. Клетки разрушали с использованием ультразвука, после чего остатки клеток собирали центрифугированием (15 минут при 10000 об/мин). Далее отбирали надосадочную жидкость, содержащую растворимые белки (клеточный лизат).
Белки из клеточного лизата осаждали с использованием сульфата аммония (60%) согласно [11] и растворяли в буфере (20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, pH 7,8-8,0). Рекомбинантный белок содержит метку из 6 гистидинов на С-конце. Для его очистки проводили аффинную хроматографию с использованием сорбента Ni Smart Beads 6FF (Smart-Lifesciences, Китай) с использованием хроматографической системы BioLogic (BioRad). При этом клеточные лизаты в загружали на сорбент. Промывали сорбент буфером (20 мМ NaH2PO4, 500 мМ NaCl, pH 7,8-8,0, 10 мМ имидазол) двумя объёмами колонки. Далее постепенно увеличивали концентрацию имидазола в буфере до 500 мМ и собирали фракции элюируемого белка.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях проводили согласно общеизвестной методике [7]. Для анализа электрофореграмм и определения концентрации белков использовали программу ImageJ [9].
Иммуноферментный анализ. На полистироловые микротитро-вальные планшеты (Labsystems, Хельсинки, Финляндия) сорбировали очищенный белок VP2 и клеточный лизат в 50 мМ карбонатном буфере (pH 9,6) в течение ночи при 4°C. После абсорбции планшеты трижды промывали PBS. Затем в планшет вносили блокирующий буфер (350 мМ NaCl и БСА) и инкубировали в течение 4 ч. После трехкратной промывки PBS в лунки планшета вносили образцы сыворотки, которые предварительно разводили 1:100. После 15 минут инкубации в термошейкере при 37°С лун- ки планшета пятикратно промывали промывочным раствором из набора Вектор-Бест ИББ и вносили антивидовой коньюгат. После 15 минут инкубации в термошейкере при 37°С планшет пятикратно промывали промывочным раствором из набора Вектор-Бест ИББ и вносили субстрат из набора Вектор-Бест и инкубировали 15 минут. Реакцию останавливали 2% SDS, а оптическую плотность измеряли при 450 нм с помощью спектрофотометра (Bio-Tek Instruments).
Для сравнения использовали коммерческий диагностический набор - ИФА Бест-Вет АТ-IBD (Вектор-Бест, Россия) в соответствии с протоколами производителей.
Сыворотка крови птиц. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови кур, не имеющих антител к вирусу ИББ. В качестве положительного контроля - сыворотку крови кур кросса Lohmann Brown в количестве 5 шт., полученную после вакцинации живой вакциной из штамма «Winterfield 2512» [1].
Результаты исследований и их обсуждение. Белок VP2 синтезировали в клетках штамма бактерий E. coli BL21(DE3)pLysS, содержащих плазмиду pET23a-VP2 [3]. Клеточные лизаты, содержащие растворимые белки, и очищенный белок VP2 анализировали с помощью денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле (рисунок 1).
Рис. 1. Электрофореграммы: 1-3 - пробы контрольного белка бычьего сывороточного кональбумина (78 кДа); 4-6 - пробы очищенного рекомбинантного белка VP2 (48 кДа); 7-9 - пробы клеточных лизатов, содержащие рекомбинантный белок VP2 (48 кДа); М - маркер молекулярного веса белков.
Был продемонстрирован синтез нужного рекомбинантного белка VP2 размером 48 кДа. При анализе электрофореграмм за счёт сравнения с образцами контрольного белка с известной концентрацией была определена концентрация VP2 в полученных клеточных лизатах и в растворе после очистки. Исходя из этих концентраций, далее для сенсибилизации ИФА планшетов на одну лунку брали 1 мкг и 5 мкг очищенного белка и соответствующие объёмы клеточных лизатов, содержавшие эквивалентное количество белка VP2.
Для определения эффективности клеточного лизата и очищенного белка VP2 в качестве антигена был проведен непрямой ИФА (табл. 1).
Таблица 1 Сравнение оптической плотности сыворотки крови кур при различной концентрации адсорбированных рекомбинантных белков на полистироловом планшете (при длине волны 450 нм)
| № | Оптическая плотность (OD) | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Клеточный лизат | Очищенный белок VP2 | Коммерческий набор ИФА | |||
| 1 мкг на лунку | 5 мкг на лунку | 1 мкг на лунку | 5 мкг на лунку | ||
| 1 | 0,772 | 0,801 | 1,006 | 1,232 | 2,747 |
| 2 | 0,605 | 0,838 | 0,944 | 1,467 | 2,707 |
| 3 | 0,880 | 0,889 | 0,905 | 1,384 | 2,704 |
| 4 | 0,755 | 0,813 | 0,987 | 1,258 | 2,658 |
| 5 | 0,814 | 0,876 | 1,010 | 1,433 | 2,754 |
| К- (среднее) | 0,175 | 0,075 | 0,081 | 0,068 | 0,121 |
Для проверки специфичности анализа использовали пять положительных куриных сывороток и пять отрицательных в разведении - 1:100. Значение отсечки было установлено для пяти куриных сывороток, которые были отрицательными к белку VP2 вируса ИББ, на уровне 0,2 OD. Сыворотки со значениями оптической плотности, превышающими значение отсечки, считались положительными.
В результате исследований установлено, что очищенный белок VP2 более чувствительным, чем клеточный лизат. Для адсорбированного клеточного лизата (1 мкг и 5 мкг на лунку) оптическая плотность образцов была на одном и том же уровне, а вот при использовании очищенного белка VP2 вируса ИББ было заметно увеличение показателей оптической плотности. Стоит отметить, что показатели оптической плотности сывороток в коммерческом наборе выше, чем на плашке с очищенным белком VP2 в концентрации 5 мкг на лунку, возможно, следует увеличить концентрацию сорбированного белка.
Заключение. В птицеводстве, где огромное количество образцов должно быть проанализировано простым и экономичным способом, необходимы дешевые и воспроизводимые антигены. В настоящее время единственные доступные наборы в Российской Федерации для выявления и мониторинга антител к вирусу ИББ основаны на ИФА, в которых в качестве антигена используются цельные вирионы. Репликация вируса ИББ на куриных эмбрионах занимает много времени и требует больших трудозатрат. В данном исследовании мы изучили возможность использования клеточного лизата и белка VP2 вируса ИББ, экспрессированного в бактериальных клетках, как возможную альтернативу этим наборам с точки зрения безопасности и экономичности. Иммуноферментный анализ, разработанный с использованием очищенного рекомбинантного белка VP2, оказался менее чувствительным, чем коммерческий набор, но специфичность белка была на одном и том же уровне. Метод получения рекомбинантного белка VP2 вируса ИББ, синтезированного в клетках E. coli и метод его очистки является эффективным и не требует высоких трудозатрат. Исходя из полученных результатов, бактериальная система экспрессии является отличной альтернативой для получения рекомбинантного белка VP2 вируса ИББ, который может быть использован для обнаружения и мониторинга специфических антител к вирусу ИББ.
Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 24-26-20116 «Разработка отечественных серологических тест-систем для диагностики иммунодепрессивных болезней птиц» и Санкт-Петербургского научного фонда.
Список литературы:
1. Веретенников, В. В. Разработка рекомбинантной вакцины против инфекционной бурсальной болезни : дис. на соиск. уч. степ. канд. вете-рин. наук / В. В. Веретенников // 2022. 114 с. EDN QWENMQ.
2. Джавадов, Э. Вирусные болезни: диагностика и профилактика / Э. Джавадов // Животноводство России. 2015. № S1. С. 7-10. EDN UMOKAD.
3. Синтез рекомбинантных белков вируса инфекционной бурсальной болезни в бактериальной системе / В. В. Веретенников, Н. В. Тарлавин, Э. Д. Джавадов [и др.] // Ветеринарный фармакологический вестник. 2022. № 4 (21). С. 22-29. EDN HQHBLW.
4. Analyses of the results of different test systems in the 2005 global proficiency testing schemes for infectious bursal disease virus and Newcastle disease virus antibody detection in chicken serum / J. J. de Wit, H. W. van de Sande, G. H. Counotte et al. // Avian Pathol. 2007. No. 36. pp. 177-183.
5. Jackwood D. H., Saif Y. M. Antigenic diversity of infectious bursal disease viruses. Avian Dis. 1987. No. 31. pp. 766-770.
6. Kibenge F. S., Dhillon A. S., Russell R. G. Biochemistry and immunology of infectious bursal disease virus. J Gen Virol. 1988. No. 69. pp. 1757-1775.
7. Osterman L. A. Methods of Protein and Nucleic Acid Research: Electrophoresis and Ultracentrifugation (practical manual). Nauka, 1981.
8. Failure of viral protein 3 of infectious bursal disease virus produced in prokaryotic and eukaryotic expression systems to protect chickens against the disease / J. Pitcovski et al. // Avian Dis. 1999. No. 43. pp. 8-15.
9. NIH Image to Image: 25 years of image analysis / C. Schneider et al. // Nat Methods. 2012. pp. 671-675.
10. Generation of recombinant VP3 protein of infectious bursal disease virus in three different expression systems, antigenic analysis of the obtained polypeptides and development of an ELISA test / D. A. Shirokov et al. // Arch Virol. 2020. No. 165 (7). pp. 1611-1620.
11. Wingfield P. Protein precipitation using ammonium sulfate. Curr. Protoc. Protein Sci. 2001.
Резюме. В настоящее время известно множество способов, используемых для определения титра антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни, но иммуноферментный анализ, с использованием в качестве антигена цельного вириона вируса, является самым популярным. В данном исследовании мы изучили возможность использования клеточного лизата и белка VP2 вируса ИББ, экспрессированного в бактериальных клетках, как возможную альтернативу этим наборам с точки зрения безопасности и экономичности. Белок в составе клеточного лизата, а также в очищенном виде был использован (в концентрации 1 мкг и 5 мкг на одну лунку) для проведения непрямого ИФА с использованием положительных и отрицательных сывороток. Результаты ИФА с использованием очищенного VP2 коррелировали с результатами коммерческого набора. Клеточный лизат работал не так хорошо, как очищенный VP2. Таким образом, ИФА на основе очищенного рекомбинантного белка VP2 является хорошей альтернативой традиционным ИФА, в которых используются цельные вирионы вируса в качестве антигена.
Ключевые слова: птицеводство, инфекционная бурсальная болезнь, рекомбинантный белок VP2, иммуноферментный анализ.
Сведения об авторах:
Джавадов Эдуард Джавадович, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры эпизоотологии им. В. П. Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины»; 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5; тел.: 8-921-9666774; e-mail: vnivip1@mail.ru.
Тарлавин Николай Владимирович, кандидат ветеринарных наук, ассистент кафедры эпизоотологии им. В. П. Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины»; 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5; тел.: 8-981-8430353; e-mail: tarlav1995@bk.ru.
Красков Дмитрий Андреевич, аспирант кафедры эпизоотологии им. В. П. Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины»; 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5; тел.: 8-921-4152266; e-mail: kraskov-00@bk.ru.
Румянцев Андрей Михайлович, кандидат биологических наук, научный сотрудник кафедры генетики и биотехнологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»; 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9; тел.: 8-911-2654652; e-mail: rumyantsev-am@mail.ru.
Иштуганова Валерия Владимировна, студент кафедры генетики и биотехнологии ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет»; 199034, г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7-9; тел.: 8-981-7473464; e-mail: st086860@student.spbu.ru.
Ответственный за переписку с редакцией: Веретенников Владислав Валерьевич, кандидат ветеринарных наук, ассистент кафедры эпизоотологии им. В. П. Урбана ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет ветеринарной медицины»; 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5; тел.: 8-981-8778769; e-mail: vlad.veretennikov.96@mail.ru.
http://vetkuban.com/num5_202406.html