УДК 577.29
DOI 10.33861/2071-8020-2020-5-26-29
Меньшикова З.Н. Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины
и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина», г. Москва
Любкина К.О., Девришова З.С., Преображенская А.С., Белоусов В.И., Нурлыгаянова Г.А.
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Центральная
научно-методическая ветеринарная лаборатория», г. Москва
Введение. Один из важных элементов поддержания здоровья населения - обеспечение качества пищевых продуктов, контроль которого осуществляется различными методами ветеринарно-санитарной экспертизы. Один из аспектов проведения такой оценки - определение ассортиментной фальсификации продуктов, под которой подразумевается замена одного вида животного сырья другим, менее ценным, и иногда опасным для здоровья человека [6]. Кроме экономических последствий такой обман может нанести большой моральный вред той категории потребителей, национальные или религиозные верования которых не позволяют употреблять мясо отдельных видов животных и птицы [4].
По этим причинам требуется всесторонний комплексный контроль качества продукции и соответствия ее потребительским требованиям. На практике при оценке качества продукта возникает необходимость идентифицировать его реальный состав в соответствии с декларированными нормативными документами. Идентификация сырья и продуктов животного происхождения - важный элемент в системе Государственного ветеринарного надзора, направленный на:
1. Защиту потребителя от недобросовестного изготовителя (поставщика, продавца);
2. Обеспечение безопасности продукции для окружающей среды, жизни, здоровья потребителя, его имущества;
3. Подтверждение соответствия продукции предъявляемым к ней требованиям [1, 2].
Традиционно видовую идентификацию мяса птицы проводят морфологическим методом, однако он практически неприемлем для оценки переработанных продуктов, когда морфологические признаки вида абсолютно утеряны (фарш, паштет, консервы и др.). Использование гистологических методов не находит широкого применения вследствие их длительности и трудоемкости [5].
Также для видовой идентификации применяют такие аналитические методы, как масс-спектрометрический анализ выявления специфических различий в актине, гемоглобине, миоглобине и альбумине, фракционное разделение экстрактов мышечной ткани посредством газовой хроматографии, метод иммунодиффузии и др. Но все они основаны на анализе белков или неразрушенных тканевых структур и их применение невозможно при оценке переработанных продуктов, подвергшихся механической или термической обработке, влекущей дегенеративные клеточные изменения [6].
Наиболее стабильная структура животного организма - ДНК. Будучи устойчивой к воздействию температурных, химических и механических факторов, она не утрачивает своей информативной функции под влиянием агрессивных воздействий. В связи с этим наиболее чувствительным и специфичным для идентификации видовой принадлежности ДНК и определения сырьевого состава продукции сегодня считается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) [6].
Применение метода ПЦР при анализе мясной продукции имеет ряд преимуществ, такие как быстрота и легкость использования; высокие показатели специфичности; подходит для видовой идентификации, как биологического материала (кровь, кожа, шерсть, перо), так и пищевых продуктов различного происхождения; возможность применения метода, как для качественной, так и для количественной оценки содержания того или иного ингредиента; метод подходит для анализа продуктов, имеющих в составе два или более видовых источника. Также метод отличается универсальностью, т.е. данным методом возможно исследовать как сырье, так и продукты, прошедшие технологическую обработку [9, 7].
Кроме идентификации видового состава мясных полуфабрикатов и готовых мясных изделий, также необходимо оценивать процентное соотношение фальсифицирующих примесей к основному мясному сырью, и определять источник проникновения данных веществ в продукт (технологически неизбежная контаминация в процессе производства или умышленная замена сырья и подлог готовой продукции) [3].
Цель работы - идентификация незаявленной в составе мясной продукции ДНК курицы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени для выявления фальсификации продукции, реализуемой в Москве и Московской области.
Материалы и методы исследований. Исследования проводились в Московской испытательной лаборатории Федерального государственного бюджетного учреждения «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория».
Для проведения комплексных лабораторных исследований отобрали десять видов мясной продукции (мясной фарш, полуфабрикаты, готовая продукция), реализуемых в розничных продовольственных магазинах города Москвы и Московской области (табл. 1).
Согласно нормативным документам ГОСТ 9959-2015, ГОСТ 105742016, ГОСТ Р 51478-99 (ИСО 2917-74), ТР ТС 021/2011 провели лабораторные испытания.
Образцы подверглись органолептической оценке, физико-химическим исследованиям, люминесцентной микроскопии, определению показателей безопасности (количество химических элементов, пестицидов, антибиотиков и радионуклидов).
При проведении исследований методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ), использовались коммерческие тест-системы производства ООО «Синтол»:
Получение и обработка результатов ПЦР-РВ проводились с помощью прибора для проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени Rotor-Gene Q и программного обеспечения Software v2.3.1.48. (ООО «Синтол»).
Таблица 1 Характеристика проб мясной продукции
| № пробы | Наименование продукта | Состав продукта |
|---|---|---|
| 1 | Фарш из свинины «Фермерской». Полуфабрикат мясной, рубленый категории В, охлажденный | Свинина |
| 2 | Фарш из телятины. Полуфабрикат мясной охлажденный рубленный непанированный из телятины категории А | Телятина |
| 3 | Фарш говяжий. Полуфабрикат мясной из говядины рубленый неформованный категории Б | Говядина |
| 4 | Котлеты из говядины. Полуфабрикат мясной из говядины рубленый формованный охлажденный категории Б | Говядина, вода питьевая, соль поваренная, перец черный, чеснок, лук |
| 5 | Фрикадельки. Полуфабрикат мясной из свинины рубленый категории Б. Охлажденный | Свинина, вода, лук репчатый, соль, пряности и их экстракты, чеснок, животный белок (свиной), пищевые волокна (пшеничные), концентрат пищевой свекловичный, гемоглобин (свиной) порошок, усилитель вкуса и аромата (глутамат натрия 1-замещенный), ароматизатор, регулятор кислотности (ацетат натрия, цитрат натрия), антиокислители (аскорбат натрия, аскорбиновая кислота, пиросульфит натрия, экстракт розмарина), краситель (экстракт паприки) |
| 6 | Кебабчичи из говядины охлажденные. Мясной полуфабрикат рубленый формованный категории Б | Говядина, соль, перец черный |
| 7 | Мясной продукт. Изделие колбасное вареное. Сосиски «Сливочные» категории В | Свинина, вода, говядина, жир-сырец свиной, нитритно-посолочная смесь (соль, фиксатор окраски - нитрит натрия), сливки сухие (2%), пряности, сахар, стабилизаторы - фосфаты пищевые (пирофосфат натрия, полифосфат натрия), антиокислители - аскорбиновая кислота, аскорбат натрия, изоаскорбат натрия, регуляторы кислотности - лимонная кислота, ацетат натрия, цитрат натрия, загуститель - альгинат натрия, уплотнитель - сульфат кальция, декстроза, пищевой краситель - кармин |
| 8 | Колбасное изделие вареное «Сардельки Рублевские свиные- Люкс» мясной продукт категории Б охлажденные упаковано в защитной среде | Свинина, вода, посолочная смесь (соль, фиксатор окраски: нитрит натрия), молочный белок, экстракты пряностей (кориандр, имбирь, перец чёрный), стабилизатор пирофосфат натрия, сахар, усилитель вкуса и аромата: глутамат натрия, антиокислитель: аскорбиновая кислота, регулятор кислотности: глюконо-дельта-лактон, декстроза, натуральный пищевой краситель кармин, свекольный красный |
| 9 | Мясной продукт. Изделие колбасное сырокопченое, колбаса «Свиная» кат. Б ГОСТ | Грудинка свиная, свинина, нитритно-посолочная смесь (соль поваренная пищевая, фиксатор окраски (нитрит натрия), коньяк, сахар, перец черный, чеснок |
| 10 | Колбасное изделие. Колбаса варено-копченая. Продукт мясной. Охлажденный. Готов к употреблению. Упаковано под вакуумом | Говядина, свинина, шпик, вода, молоко сухое, крахмал картофельный, животный белок, посолочная смесь (соль поваренная пищевая, фиксатор окраски-нитрит натрия), комплексная пищевая добавка (стабилизатор Е450, усилитель вкуса и аромата Е621, пряности и их экстракты, декстроза, антиокислитель Е316) |
Результаты исследований и их обсуждение. На первом этапе работы была проведена органолептическая оценка отобранных образцов мясной продукции (фарш, полуфабрикаты и готовая продукция) согласно действующим нормативно-техническим документам. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Таблица 2 Результаты органолептического исследования мясной продукции
| № образца | Фактический результат |
|---|---|
| 1, 2, 3 | Однородная масса, без костей, хрящей, сухожилий, грубой соединительной ткани, кровяных сгустков и грубых пленок; цвет светло-розовый; запах свойственный доброкачественному продукту. |
| 4, 5, 6 | Поверхность без разорванных ломаных краев; на разрезе фарш хорошо перемешан; вкус и запах свойственный доброкачественному сырью; имеет приятный вкус и аромат; консистенция готовой продукции сочная, не крошится. |
| 7, 8, 9, 10 | Оболочки деформаций не имеют; сама оболочка сухая, без слизи и плесени; цвет свойственный, запах специфический и ароматный; консистенция упругая, плотная; на разрезе фарш однородный; вкус приятный, без присутствия затхлости. |
Данные таблицы 2 свидетельствуют, что по органолептическим показателям все десять образцов мясной продукции соответствуют действующему ГОСТ 9959-2015.
На втором этапе исследований определили свежесть мясной продукции. С этой целью провели физико-химические исследования по четырем показателям. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3 Результаты физико-химических исследований мясной продукции
| Показатели | Номер пробы | |||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| pH | 6,46 | 6,38 | 6,39 | 6,48 | 6,29 | 6,24 | 6,08 | 6,26 | 6,15 | 6,06 |
| Проба на выявление крахмала с раствором Люголя | отсутствует сине или черно-синее окрашивание | присутствует синее окрашивание | ||||||||
| Реакция на серо-водород | отрицательная | -* | -* | отрицательная | -* | |||||
| Реакция на аммиак по Эберу | отрицательная | -** | -** | -** | -** | |||||
Примечание: * - проба на сероводород для оценки вареного мяса и вареных колбас нехарактерна, так как в результате деструкции белков мяса при варке из него выделяется сероводород; ** - проба Эбера на свободный аммиак неприменима для парного мяса, солонины, колбасы, мясных консервов, так как она может дать ложную реакцию. Неточные результаты получаются и при исследовании вареного мяса.
Результаты, полученные при исследовании 10 проб на определение концентрации водородных ионов (рН) и выявление крахмала с раствором Люголя, соответствуют ГОСТ 10574-2016 и ГОСТ Р 5147899 (ИСО 2917-74). В пробе № 10 по результатам исследования на выявление крахмала с раствором Люголя присутствует синее окрашивание, что является допустимым согласно маркировке образца (производитель указал наличие крахмала в продукте).
Постановку и учет реакции на сероводород и на аммиак по Эберу ставили согласно учебному пособию «Лабораторные методы в ветеринарно-санитарной экспертизе пищевого сырья и готовой продукции» [8]. При исследовании шести проб получены отрицательные результаты (образцы № 1, 2, 3, 4, 5, 6).
С целью выявления начальной стадии порчи (гниения) мясной продукции, неразличимой при обычном визуальном осмотре провели люминесцентное исследование. При люминесцентном исследовании всех десяти образцов мясных экстрактов был отмечен прозрачный цвет, что говорит о свежести мясной продукции.
Также провели исследования по определению показателей безопасности, результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4 Результаты исследования мясной продукции на показатели безопасности
| Наименование показателя | Ед. изм. | Норматив | Результат испытаний |
|---|---|---|---|
| Амфениколы | |||
| Левомицетин (Хлорамфеникол) | мкг/кг | не допускается (<0,0003 мг/кг) | не обнаружено |
| Антибиотики тетрациклиновой группы | |||
| Тетрациклиновая группа | мкг/кг | не допускается (<0,01 мг/кг) | не обнаружено |
| Токсичные элементы | |||
| Кадмий | мкг/кг | не более 0,05 | 0,015 |
| Мышьяк | мкг/кг | не более 0,1 | 0,011 |
| Ртуть | мкг/кг | не более 0,03 | менее 0,002 |
| Свинец | мкг/кг | не более 0,5 | 0,22 |
| Радионуклиды | |||
| Стронций 90 | Бк/кг | не более 200 | менее 0,1 |
| Цезий 137 | Бк/кг | не более 20 | менее 3 |
| Пестициды | |||
| ГХЦГ (а-, в- и Y- изомеры) | мкг/кг | не более 0,1 | не обнаружено (менее 0,007) |
| ДДТ и его метаболиты | мкг/кг | не более 0,1 | не обнаружено (менее 0,005) |
| Микробиологические показатели | |||
| КМАФАнМ | КОЕ/г | 5,0 Ч 105 | 4,3 Ч 103 |
| Listeria monocytogenes | г | в 25 г не допускается | в 25 г не обнаружено |
| S. aureus | г | в 1,0 г не допускается | в 1,0 г не обнаружено |
| БГКП (колиморфы) | г | в 1,0 г не допускается | в 1,0 г не обнаружено |
Данные таблицы 4 свидетельствуют, что согласно ТР ТС 021/2011 в исследованных образцах мясной продукции количество химических элементов, пестицидов, антибиотиков и радионуклидов было в допустимых пределах. Нарушений предельно допустимого уровня по показателям безопасности не выявлено ни по одному из исследованных десяти образцов.
В результате постановки ПЦР-РВ с помощью набора регентов «Gallus gallus/ Meleagris gallopavo/ Anas platyrhynchos Ident RT multiplex» (ООО «Синтол»), было выявлено наличие видоспецифичной ДНК курицы (Gallus gallus) в шести образцах, что составило 60% от исследованных (Рисунок 1).
Рис. 1. График накопления флуоресценции сигнала
Положительные образцы были подвергнуты дальнейшему исследованию для определения относительного количества ДНК курицы в пробах. Так, в случае, если разница величин пороговых циклов Ct составляет более 7, то содержание меньшего вида мяса (большая величина Ct) относительно превалирующего вида (меньшая величина Ct) составляет менее 1%, согласно инструкции производителя тест-системы (Табл. 5).
Таблица 3 Определение относительного количества ДНК курицы в пробах
| Средние Ct | Результат | |||
|---|---|---|---|---|
| образец № 2 | ||||
| Говядина - 16,12 | Курица - 22,78 | ДНК курицы >1% относительно ДНК говядины | ||
| образец № 6 | ||||
| Говядина - 16,24 | Курица - 24,57 | ДНК курицы <1% относительно ДНК говядины | ||
| образец № 7 | ||||
| Говядина - 18,64 | Свинина - 14,32 | Курица - 23,98 | ДНК курицы <1% относительно ДНК свинины; | |
| образец № 8 | ||||
| Свинина - 21,91 | Курица - 18,31 | ДНК свинины >1% относительно ДНК курицы | ||
| образец № 9 | ||||
| Свинина - 14,67 | Курица - 16,55 | ДНК курицы >1% относительно ДНК свинины | ||
| образец № 10 | ||||
| Говядина - 18,88 | Свинина - 20,34 | Курица - 13,27 | ДНК говядины >1% относительно ДНК курицы | |
Данные, представленные в таблице 5, свидетельствуют, что ДНК курицы (Gallus gallus) обнаружена в шести образцах мясной продукции. Полуколичественный анализ показал наличие искомого компонента в образцах № 2, 7, 8, 9, 10 более 1%, а в образце № 6 менее 1% по отношению к заявленному ингредиентному составу.
Выводы. По комплексным органолептическим и физико-химическим исследованиям десять образцов мясной продукции (мясной фарш, полуфабрикаты, готовая продукция) соответствуют требованиям ГОСТ, действующим в настоящее время. Люминесцентный анализ подтвердил отсутствие порчи в исследуемых образцах мясной продукции. При проведении исследований по определению показателей безопасности согласно ТР ТС 021/2011 установлено, что по остаткам химических элементов, пестицидов, антибиотиков и радионуклидов продукция признана безопасной. Исследование образцов методом полимеразной цепной реакции выявило ДНК курицы в шести пробах мясной продукции. При полуколичественном анализе в одном мясном продукте (образец № 6) количество искомого компонента составило менее одного процента, что свидетельствует о наличии возможных случайных или технически неустранимых примесей.
Заключение. Результаты проводимых исследований показали, что для точного утверждения о наличии фальсификации мясной продукции, выявленной методом ПЦР-РВ, необходим не только качественный анализ, но и количественный. В настоящее время в целях повышения качества лабораторных исследований и своевременного выявления некачественной продукции необходимо:
1. Подвергать мясную продукцию не только базовому комплексу исследований в соответствии с действующими нормативными документами, но и включать методы, направленные на выявление возможной фальсификации продукта.
2. На законодательном уровне установить точное определение технически неустранимой примеси в пищевой продукции, что позволит дифференцировать возможную фальсификацию продукции от следовых количеств не заявленных ингредиентов (технологическая примесь).
Список литературы:
Резюме. Наиболее часто встречающийся тип фальсификации продуктов животного происхождения - подмена сырья более ценных видов менее ценными, в том числе и мясом птицы. В данной работе представлены результаты исследований по идентификации незаявленной в составе мясной продукции ДНК курицы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) для выявления возможной фальсификации продукции, реализуемой в Москве и Московской области. В результате ПЦР исследования ДНК курицы (Gallus gallus) обнаружена в шести из десяти образцов мясной продукции, что составило 60% от исследованных образцов. Однако при определении относительного количества ДНК курицы в пробах полуколичественный анализ исключил один мясной продукт, так как количество искомого компонента составило менее одного процента, что свидетельствует о наличии возможных случайных или технически неустранимых примесей. Все десять образцов также подверглись органолептической оценке, физико-химическим исследованиям, люминесцентной микроскопии, определению показателей безопасности (количество химических элементов, пестицидов, антибиотиков и радионуклидов). Результаты комплексных исследований отклонений не выявили. Таким образом, метод полимеразной цепной реакции позволяет определить видовую принадлежность сырья в составе мясных фаршевых продуктов, мелкоизмельченных полуфабрикатов и в том числе подвергшихся тепловой обработке. Для точного утверждения о наличии фальсификации мясной продукции, выявленной методом ПЦР-РВ, необходим не только качественный анализ, но и количественный, что позволит дифференцировать возможную фальсификацию от следовых количеств не заявленных ингредиентов (технологическая примесь).
Ключевые слова: домашняя птица, видовой состав, фальсификация пищевых продуктов, мясная продукция, свинина, говядина, метод полимеразной цепной реакции, метод полимеразной цепной реакции в реальном времени, идентификация ДНК.
Сведения об авторах:
Меньшикова Зинаида Николаевна, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры паразитологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К.И. Скрябина»; 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23; тел.: 8-495-3778569; e-mail: dec_fvm@mgavm.ru.
Любкина Ксения Олеговна, ветеринарный врач отдела молекулярных исследований ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная, д. 23; e-mail: ksenia.luybkina@gmail.com.
Девришова Зелиха Султановна, заведующий отделом молекулярных исследований ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная, д. 23; e-mail: zul3646@yandex.ru.
Преображенская Анастасия Сергеевна, научный сотрудник отдела молекулярных исследований ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная, д. 23; e-mail: a.pcrvet@gmail.com.
Белоусов Василий Иванович, доктор ветеринарных наук, профессор, главный научный сотрудник отдела координации научно-исследовательских работ ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная, д. 23.
Ответственный за переписку с редакцией: Нурлыгаянова Гульнара Ахметовна, кандидат ветеринарных наук, ведущий научный сотрудник отдела координации научно-исследовательских работ ФГБУ «Центральная научнометодическая ветеринарная лаборатория»; 111622, г. Москва, ул. Оранжерейная д. 23. Тел.: 8(495)700-01-37. E-mail: cnmvl@cnmvl.ru
http://vetkuban.com/num5_202007.html